抑制性消减杂交

摘要： 利用抑制性消减杂交(Suppression subtraetive hybridization,SSH)方法构建了中国草原红牛与中国荷斯坦牛背最长肌差异表达消减cDNA文库,共获得859个差异表达克隆,对全文库进行了测序并与GenBank数据库进行比对分析.结果表明:共获得789个新ESTs,84个未知功能蛋白基因,356个已知功能蛋白基因.在已知功能蛋白基因中,表达上调的基因有123个,表达下调的基因有233个.差异表达基因可能与肉质性状有关,可以作为肉质性状的候选基因进行深入研究.

摘要： 七星瓢虫是优良的天敌昆虫,可凭滞育特性抵御逆境胁迫,提高种群生存能力.为研究七星瓢虫的滞育分子机制,构建抑制性消减杂交文库,经反向Northern斑点杂交技术进一步筛选,得到231个差异点.blastx比对后,正、反向文库分别得到差异表达基因64和54个,GO分类和PATHWAY分析表明,差异表达基因参与的生物过程涉及滞育的信号传导、生物合成、初级代谢和次级代谢等.文库中发现多种基因,为进一步筛选、克隆、分析滞育相关基因提供线索.着重讨论了与抗寒性相关的28 kD抗干燥应激蛋白、卵巢发育相关的Cullin 3蛋白,能量代谢相关的异柠檬酸脱氢酶的生物学功能,进而推测其与七星瓢虫滞育的相关性.

摘要： Objective]Theileria annulata can transform B lymphocytes、dendritic cells and macrophages it infects. Parasitized cells can be immortalized and acquire the ability to proliferate continuously as tumor cells in vitro culture. This study was carried out to construct a suppression subtractive hybridization (SSH) library in host cells transformed and non-transformed byT. annulata and to screen for schizont genes ofT. annulata and differential genes of host cells fromT. annulata schizont transformed cells and PBMCs of uninfected calves .[Method] The total RNA and mRNA samples were extracted fromT. annulata schizont transformed cells and PBMCs of uninfected calves, and the cDNA were synthesized by reverse transcription respectively. The cDNA subtracted library of host cells transformed and non-transformed byT. annulata was constructed using SSH technology, with cDNA fromT. annulata transformed cells as the “tester” and cDNA from PBMCs of uninfected calves as the “driver”. Positive clones randomly chosen were sequenced and analyzed by bioinformatics. Furthermore, real-time PCR was employed to detect significant changes of part of differential genes from the cDNA subtracted library.[Result]A total of 364 effective differentially Expressed Sequence Tag (ESTs) were obtainedvia DNA sequencing from 454 positive clones, ranging from 350 to 1200 bp insert size. After comparing the sequences with BLASTn in the GenBank, these ESTs belonged to 192 gene sequences. Sixty of ESTs matched toT. annulata genes (11 ESTs wereT. annulata protease genes, 10T. annulata membrane protein genes, 7T. annulata hypothetical protein genes, 5 apoptosis relatedT. annulata protein genes, 5 T. annulata ribosomal protein genes, 4T. annulata cell-cycle protein genes, 4T. annulata antigen protein genes and 14 T. annulata other genes), 131 bovine genes (19 were bovine tumor related genes) and one unknown gene. A total of 285 ESTs gene functions were annotated with Gene Ontology (GO) on the basis of biological process, cellular component, molecular function. Most of these were associated with cell, cellular processes, binding, catalytic, metabolic processes and biological regulation. Differential expressed genes fromT. annulata transformed host cells were verified by real-time PCR, The results showed that the mRNA abundance of HCLS1 and SENP5 from bovine in transformed cells was 2.06 and 1.32 times that of non-transformed cells.[Conclusion]A SSH cDNA library of bovine cells infected byT. annulata was successfully constructed, and gene sequences ofT. annulataschizonts and host cells transformed byT. annulata were obtained in this study. We acquire two bovine tumor related genes which possibly influence the host cell immortalized by real-time PCR. Our observations establish a foundation for better understanding of the molecular mechanisms of interactions betweenT. annulata and host cells.%【目的】环形泰勒虫（Theileria annulata）可以感染牛B淋巴细胞、树突状细胞和巨噬细胞，并可使被感染细胞发生转化，体外培养时可获得类似肿瘤样细胞的无限增殖能力。本研究通过构建环形泰勒虫转化和非转化宿主细胞抑制性消减文库，筛选环形泰勒虫裂殖体基因及转化细胞与宿主正常细胞之间的差异表达基因。【方法】以环形泰勒虫裂殖体转化细胞和非感染牛外周血单个核细胞（即非转化宿主细胞）为试验材料，提取总RNA和mRNA，反转录合成cDNA；然后分别作为tester和driver，进行抑制性消减杂交（SSH），构建环形泰勒虫转化和非转化宿主细胞抑制性消减文库；对随机挑取的阳性克隆进行测序及生物信息学分析，并利用实时荧光定量PCR对文库部分差异基因进行验证。【结果】通过对文库454个阳性克隆进行测序，共获得了有效表达序列标签（ESTs）364条，大小主要分布在350—1200 bp之间；将这些ESTs序列在GenBank中进行BLASTn网上序列比对，其匹配于192条基因序列；其中包括环形泰勒虫序列60条(11条为虫体蛋白酶基因序列、10条为膜蛋白基因序列、7条为假设蛋白基因序列、5条为凋亡相关虫体蛋白基因序列、5条为核糖体蛋白基因序列、4条为细胞周期蛋白基因序列、4条为虫体抗原基因序列和虫体其它基因序列14条)、牛基因序列131条（其中19条为肿瘤相关蛋白基因序列）和1条未知序列；其中已有功能注释的ESTs 285条，再将已知功能的ESTs通过WEGO软件从生物学过程（biological process）、细胞组成（cellular component）和分子功能（molecular function）3个部分进行GO聚类分析，结果表明，宿主细胞差异基因主要集中在细胞、细胞进程、结合、催化、代谢进程、生物调节等功能方面。另外，通过对部分环形泰勒虫裂殖体转化宿主细胞差异基因进行荧光定量PCR分析，结果表明，肿瘤相关基因HCLS1和SENP5在转化宿主细胞中转录水平分别是非感染牛PBMCs(非转化宿主细胞)的2.06和1.32倍。【结论】利用SSH技术，成功构建了环形泰勒虫感染宿主细胞的抑制性消减文库，筛选获得了转化宿主细胞和环形泰勒虫裂殖体的表达基因，并通过荧光定量PCR分析获得了2个可能参与宿主细胞转化的基因，为进步探索环形泰勒虫与宿主细胞相互作用的分子机制奠定了基础。

摘要： 目的 构建在两种结肠癌细胞株SW480和SW620中微小RNA的差异表达文库,分离与结肠癌转移具有潜在相关性的微小RNA.方法 以具有不同转移潜能的结肠癌细胞株SW480和SW620为材料,应用改良抑制性消减杂交联合反向斑点杂交技术,分离在两种细胞中差异表达的微小RNA,利用生物软件BLAST及MIREAP将分离到的微小RNA序列进行分析比对.结果 鉴定出在SW480和SW620之间表达有明显差异的24种微小RNA,其中4种为新发现的微小RNA,并提交至GenBank数据库.这些微小RNA中经文献查询已知部分参与了结肠癌的发生发展过程,部分在基因转录、细胞周期循环、信号传导和细胞凋亡过程具有一定的功能.结论 经过改良的抑制消减杂交技术可以高效地分离不同标本间差异表达的微小RNA;本研究得出的结果可为结肠癌细胞转移的分子生物学机制研究提供新的方向.

摘要： 目的 为了解家蝇抗菌分子免疫机制及效应免疫分子的表达情况,运用ssh、real-time PCR,构建家蝇差异表达消减文库.方法 以金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coli)和球孢白僵菌(Beauvoir bassinet bacteria),感染家蝇幼虫构建金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和球孢白僵菌感染的差减文库,成功构建了家蝇抗感染差异表达cDNA文库.结果 文库的阳性克隆进行PCR鉴定主要分布在250～750 bp之间,随机挑取252个白斑进行测序和同源性分析,应用反向Northern斑点杂交技术鉴定了35个基因,其中32个为真阳性,包括抗菌肽、酶、核糖体蛋白,以及一些功能不明的蛋白.结论 运用real-time PCR技术分析了三种蛋白基因的表达情况,结果显示诱导后不同时间点,不同发育阶段抗菌肽均普遍表达,但表达水平存在着明显的差异,诱导后表达明显升高.

摘要： 为了鉴定杜洛克猪相对于梅山猪在大卵泡中高表达的基因,本研究应用抑制性消减杂交技术成功构建了以梅山大卵泡cDNA为driver,杜洛克大卵泡cDNA为tester的消减cDNA文库.结果显示:以G3PDH和β-actin为指标检测文库的消减效率为25,从该文库中获取了350个有效的阳性克隆,PCR检测插入片段主要分布在150-750 bp.克隆测序得到74个有效的EST序列,GO分析表明主要与细胞信号、细胞结构、代谢、细胞分化、基因/蛋白质合成、细胞组织防护等功能相关.利用qPCR技术验证了ELTD1、Grbl4、SNRPE、CSDE1、ALDH 18A1、eIF4E、BMPR-IB等基因在梅山和杜洛克大卵泡中的表达模式.结果发现在两猪种的大卵泡间存在显著性差异.本研究有助于揭示影响猪卵泡发育和生殖数量控制的分子基础.

摘要： Adenylate cyclase 3 (AC3) is one of the major players in the olfactory signaling within the main olfactory epi-thelium (MOE) of mice. However, we are not ascertained whether deficiency of AC3 will lead to the differential expression of related genes in the MOE. Forward and reverse subtractive libraries were constructed by suppression subtractive hybri-dization (SSH) approach, with MOEs from AC3-/-and AC3+/+mice. These two libraries were primarily screened by Dot blot, differential expressed clones were sequenced and analyzed by bioinformatics, and differential expressed genes were verified by qRT-PCR. A total of 386 differentially expressed clones were picked out after Dot blot. The DNA sequences of 80 clones randomly selected were determined, and 62 clones were identified by blasting in GenBank. We found that 24 up-regulated clones were corresponded to genes of kcnk3, mapk7, megf11, and 38 down-regulated clones were corresponded to tmem88b, c-mip, skp1a, mlycd, etc. Their functions were annotated with Gene Ontology (GO) and found to be mainly focused on mo-lecular binding, cell cycle, processes of biology and cells. Five genes (kcnk3, c-mip, mlycd, tmem88b and trappc5) were verified by qRT-PCR with individuals of AC3+/+and AC3-/-mice. The data indicate that kcnk3 gene is up-regulated signifi-cantly, increasing 1.27 folds compared to control mice, whereas c-mip, mlycd, tmem88b and trappc5 are down-regulated significantly, decreasing 20%, 7%, 32% and 29% compared to the AC3+/+mice. The functions of these genes are closely related with K+channels, cell differentiation, metabolism of fats, membrane transportation, and so on. It is tempting to spe-culate that these genes might work together with AC3 to orchestrate the olfactory transduction signaling in the MOE.%腺苷酸环化酶3(Adenylate cyclase 3, AC3)基因在小鼠主要嗅觉表皮(Main olfactory epithelium, MOE)内的嗅觉信号传导中起着重要作用, AC3缺失是否会导致MOE内与之相关的基因发生差异表达,尚待确定。文章利用抑制性消减杂交(Suppression subtractive hybridization, SSH)方法,以AC3敲除(AC3-/-)及其同窝出生的野生型(AC3+/+)小鼠 MOE为材料,构建了正向和反向两个消减文库,采用斑点杂交对消减文库进行初步筛选,对筛选出的差异表达基因进行序列测定及生物信息学分析,并利用荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对其进行验证。斑点杂交筛选获得了386个差异表达克隆,随机选取其中的80个进行DNA序列测定,经序列比对后发现有62个在GenBank上获得了与之相匹配的基因信息,其中24个上调差异表达克隆对应于kcnk3、mapk7、megf11等基因,38个下调差异表达克隆对应于tmem88b、c-mip、skp1a、mlycd等基因。利用Gene Ontology(GO)方法对这些差异表达基因进行蛋白功能注释,发现它们主要集中在分子结合、细胞周期、生物和细胞过程等功能方面。选取其中上调基因 kcnk3和下调基因 c-mip、mlycd、tmem88b 及 trappc5进行 qRT-PCR 验证。结果表明,在 AC3-/-小鼠MOE内kcnk3的表达量显著上调,是对照组小鼠的1.27倍,而c-mip、mlycd、tmem88b和trappc5的表达量显著下调,为对照组小鼠的20%、7%、32%和29%。这些基因的功能与 K+通道、细胞发育与分化、脂肪代谢和膜蛋白转运等密切相关。推测它们可能与AC3基因共同作用,调节小鼠MOE内的嗅觉信号传导信息。

摘要： 为了探讨马氏珠母贝免疫防御机制,筛选免疫防御相关功能基因,以致病性溶藻弧菌人工感染的马氏珠母贝血淋巴为材料,采用抑制性差减杂交(SSH)技术,构建了溶藻弧菌诱导的马氏珠母贝血淋巴cDNA差减文库;以马氏珠母贝管家基因β-actin作为差减指标检测该文库的差减效率;对选取的600个阳性克隆进行测序及生物信息学分析.结果显示,该文库的差减效率可达210倍;PCR阳性检测显示差减片段为100～ 750 bp,对随机挑取600个克隆的测序结果显示,共获得414个有效EST序列;通过BLAST同源性比对,有167个EST序列(占40.34％)与NCBI数据库中已知功能蛋白质具较高同源性,其中7个EST序列(占1.69％)与免疫防御相关基因同源;此外,204个EST(占49.28％)在数据库中未发现同源序列.研究表明,SSH技术能有效富集马氏珠母贝血淋巴差异表达基因,研究结果为探索马氏珠母贝免疫基因作用机理和调控机制奠定了基础.

摘要： 肌内脂肪(IMF)是影响猪肉品质的一个重要指标，已有的研究表明IMF含量与肉的风味、嫩度等优良肉质性状呈正相关。近年来，人们在猪IMF沉积方面进行了大量研究，但影响IMF沉积的主效基因至今尚未确定。因此，本研究以IMF含量丰富的莱芜猪为研究材料，运用抑制性消减杂交(SSH)技术构建高、低IMF莱芜猪的正反抑制性消减杂交文库，筛选和鉴定影响猪IMF沉积的相关基因，以进一步揭示IMF沉积的机理，从而阐明莱芜猪IMF超级沉积的分子机制，为揭示莱芜猪特有的优异基因资源以及优质新品系肉猪的培育奠定基础。

摘要： 实验以朗德鹅为实验素材，采用抑制性消减杂交技术对填肥鹅和未填肥鹅肝脏RNA进行正反两向消减杂交获得鹅肥肝差异表达基因文库，结合斑点印迹杂交筛选差异基因克隆并进行测序分析。斑点杂交筛选后共获得517个差异克隆，经测序分析得到116个差异表达基因。其中鹅肥肝相关上调表达基因88个，下调表达基因28个，未知基因18个，假设性基因26个。差异表达基因GO聚类分析显示这些基因主要参与细胞生化过程、信号转导、脂肪合成代谢等生物学过程。荧光实时定量PCR技术检测结果证明，代谢相关差异表达基因的表达规律与消减杂交的结果基本一致。进一步的代谢途径分析(KEGG)表明，SCD、ELOVL6、ACSL1等基因及其代谢通路在肥肝形成过程中发挥极其重要的作用。

摘要： 对兴春椪柑进行干旱胁迫，以其干旱胁迫叶cDNA为试验方(tester)，正常生长的兴春椪柑叶cDNA为驱动方(driver)，利用抑制性消减杂交技术(SSH)构建了干早胁迫下兴春椪柑的消减文库。重组克隆经PCR检测，插入片段大部分集中在250-700 bp之间。通过对文库阳性克隆随机挑取85个测序，成功获得79条EST，获得非重复EST 58条。

摘要： @@病毒性心肌炎(Viral myocarditis，VMC)是指人体感染嗜心性病毒，引起心肌局限性或弥漫性的急性、亚急性或慢性的炎性病变。随着病情程度不同，临床表现差异很大。婴幼儿病情多较重，成年人多较轻，轻者可无明显病状，重者可并发严重心律失常、心功能不全甚至有猝死危险。

摘要： 穿山龙植物根进行的特定发育过程在药用次生代谢物——薯蓣皂甙生物合成和累积中发挥重要作用。为从穿山龙根中分离出薯蓣皂甙生物合成相关基因，利用抑制性消减杂交(SSH)和SMART技术，构建了3年生和1年生穿山龙(Dioscorea nipponica)根组织mRNA群体间正向差减cDNA文库。 从该文库中随机挑选了34个cDNA克隆进行酶切、测序，序列同源性比较。结果表明：其中25个cDNA克隆代表了新的EST序列。对其中6个克隆在3年生根组织的表达进行了半定量PCR和定量PCR分析，分别命名为DNR1、DNR2、DNR3、DNR4、DNR5和DNR6，其GenBank登录号分别为DN792551、DN792555、DN792562、DN792564、DN792565和DN792577。结果表明在不同的发育阶段其表达量具有差异，为根发育阶段筹异性表达基因。这也可能意味着其在薯蓣皂甙次生代谢合成可能起重要作用。该研究结果为克隆其全长基因和进一步研究其在薯蓣皂甙次生代谢生物合成中的功能提供了重要的实验基础。

摘要： 巨型艾美球虫(Eimeria maxima)是鸡球虫病的主要病原之一,在鸡的7种球虫中巨型艾美球虫的抗原变异最显著,有时可因虫株的地域差异而导致疫苗免疫效果不佳,甚至失败.为此,本文应用抑制性消减杂交技术构建了在免疫原性上显著不同的巨型艾美球虫上海株与南通株孢子囊的消减cDNA文库,并对构建的文库进行了初步分析,为从分子水平上探索球虫株间抗原差异形成的机制或球虫的分子演化规律奠定基础.

摘要： 目的 采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建汉族人狼疮性肾炎(Lupus Nephritis LN)肾阳虚证cDNA消减文库.方法 选择汉族人LN且中医辨证为肾阳虚证的患者以及正常人作为其对照组,进行正向和反向消减杂交.采用Trizol一步法提取总RNA,用SMART(Switch Mechanism At 5 end of RNA Template)技术逆转录并扩增总cDNA,用RsaI酶切基因组cDNA成大小不等的片断,分别与两种不同的接头连接,进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将PCR产物与U载体连接,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建LN肾阳虚证消减文库.结果 用SSH方法筛选出了LN肾阳虚证的差异cDNA片段,得到了480个白色克隆,再经PCR方法快速筛选出阳性重组质粒,从而成功地构建了LN肾阳虚证的cDNA消减文库.结论 SSH技术能够快速有效地分离差异cDNA片段以构建LN肾阳虚证cDNA消减文库,为进一步筛选和克隆LN肾阳虚证相关基因奠定了基础.

摘要： 以非减数分裂孤雌生殖（AMP）和双精雄核发育（BSA）技术获得的家蚕单一性别早期发育蚕卵为材料，利用抑制消减杂交技术构建了消减杂交cDNA文库。在正向（雌性）消减文库中随机选择61个克隆测序，获得43种cDNA序列，长度在88～479bp之间；在反向（雄性）消减文库中随机选择46个克隆测序，获得29种cDNA序列，长度在132～724bp之间。对两个消减文库所测序列进行生物信息学分析显示与单性生殖的高温、低温、辐射等处理有关的基因出现频次较高，并获得25个新的cDNA序列。从两个消减文库中分别挑选几个基因进行了cDNA末端快速扩增（RACE）以确认进一步的序列信息。

摘要： 以非减数分裂孤雌生殖（AMP）和双精雄核发育（BSA）技术获得的家蚕单一性别早期发育蚕卵为材料，利用抑制消减杂交技术构建了消减杂交cDNA文库。在正向（雌性）消减文库中随机选择61个克隆测序，获得43种cDNA序列，长度在88～479bp之间；在反向（雄性）消减文库中随机选择46个克隆测序，获得29种cDNA序列，长度在132～724bp之间。对两个消减文库所测序列进行生物信息学分析显示与单性生殖的高温、低温、辐射等处理有关的基因出现频次较高，并获得25个新的cDNA序列。从两个消减文库中分别挑选几个基因进行了cDNA末端快速扩增（RACE）以确认进一步的序列信息。

摘要： 以非减数分裂孤雌生殖（AMP）和双精雄核发育（BSA）技术获得的家蚕单一性别早期发育蚕卵为材料，利用抑制消减杂交技术构建了消减杂交cDNA文库。在正向（雌性）消减文库中随机选择61个克隆测序，获得43种cDNA序列，长度在88～479bp之间；在反向（雄性）消减文库中随机选择46个克隆测序，获得29种cDNA序列，长度在132～724bp之间。对两个消减文库所测序列进行生物信息学分析显示与单性生殖的高温、低温、辐射等处理有关的基因出现频次较高，并获得25个新的cDNA序列。从两个消减文库中分别挑选几个基因进行了cDNA末端快速扩增（RACE）以确认进一步的序列信息。

摘要： 本发明公开了一种杂交水稻穗萌抑制剂及其制备方法和抑制杂交水稻穗萌的方法，该杂交水稻穗萌抑制剂以水为溶剂，含有浓度为20～60mg/kg的脱落酸、40～160mM的环己胺、10～60mg/kg丁香酚。本发明使用脱落酸、环己胺和丁香酚进行组合，不但有效地降低了杂交水稻穂萌率，而且对收获后的水稻种子芽、根生长以及干重有极显著的促进作用，综合品质有所提升。

摘要： 本发明提供了一种双链特异性DNA酶介导的cDNA均一化消减杂交方法，依次包括第一链cDNA的合成、合成双链cDNA、转录RNA、逆转录、均一化和消减杂交、双链特异性DNA酶消化、PCR扩增、克隆差异表达基因及鉴定等步骤。与其它方法相比本发明的有益效果主要体现在：(a)对共同表达基因的高消减效率，对差异表达基因的高效富集，同时表达量很低的差异表达基因可以被有效富集；(b)能够得到全长cDNA序列。

摘要： 本发明提供了一种全长cDNA均一化消减杂交方法，所述方法包括以下顺序步骤：(1)第一链cDNA的合成；(2)双链cDNA的合成；(3)选择性连接和引物延伸；(4)消减杂交；(5)PCR扩增差异表达的cDNA。消减杂交的PCR产物可以直接克隆到载体上，构建差异表达基因富集的cDNA文库，利用这些文库分析基因表达，也可以制备基因芯片，还可以标记为探针，从已有文库中筛选差异表达的基因。此外如果消减效率不够高，还可以把消减杂交的PCR产物重复进行消减杂交，提高均一化和消减效率。本发明所述的全长cDNA均一化消减杂交(FNSH)方法的有益效果主要体现在：对差异基因的高消减效率，对差异表达基因的高效富集，高效均一化，并且得到全长cDNA。

摘要： 本发明公开了一种消减杂交文库构建方法，该方法包括以下步骤：(1)消减杂交装置的制备；(2)检测组和驱动组的酶切；(3)驱动组的固定；(4)检测组连接接头；(5)进行消减杂交；(6)消减产物的分组扩增；(7)消减杂交文库的构建。与传统的物理消减杂交方法相比，本发明具有以下优点：1)消减杂交装置成本低，制作简单；2)尼龙膜与核酸分子以共价键结合，结合牢固；3)在杂交过程中可控制杂交温度和时间；4)可根据需要控制杂交轮次；5)洗脱体积可按需要控制在数十微升，便于进一步的操作；6)试验操作简单，可重复性好；7)在消减杂交后进行PCR，避免了假阳性的出现；8)消减后进行分组PCR，可使低丰度的差异表达cDNA扩增。

摘要： 本发明公开了一种杂交水稻穗萌抑制剂及其制备方法和抑制杂交水稻穗萌的方法，该杂交水稻穗萌抑制剂以水为溶剂，含有浓度为20～60mg/kg的脱落酸、40～160mM的环己胺、10～60mg/kg丁香酚。本发明使用脱落酸、环己胺和丁香酚进行组合，不但有效地降低了杂交水稻穂萌率，而且对收获后的水稻种子芽、根生长以及干重有极显著的促进作用，综合品质有所提升。

摘要： 本发明公开了一种DSN法直接获得差异表达基因全长cDNA的改良消减杂交方法，属于基因工程领域，其主要方法是：利用Cap-finder法来合成双链cDNA，实验组和对照组分别进行反转录，实验组用3′poly A尾和5′-GGG帽结构分别在cDNA两端加上序列相同的锚定引物，对照组用普通反转录方法反转录，反转录后的cDNA与实验组的cDNA进行杂交，杂交结束后加入DSN酶进行消化，再进行纯化即获得实验组的差异表达cDNA，利用锚定引物进行PCR扩增，扩增产物分级分离后收集大片段连接T载体，进行转化获得阳性克隆，然后进行斑点杂交，本发明能够一次获取全长差异cDNA。

摘要： 本发明提供了一种双链特异性DNA酶介导的cDNA均一化消减杂交方法，依次包括第一链cDNA的合成、合成双链cDNA、转录RNA、逆转录、均一化和消减杂交、双链特异性DNA酶消化、PCR扩增、克隆差异表达基因及鉴定等步骤。与其它方法相比本发明的有益效果主要体现在：(a)对共同表达基因的高消减效率，对差异表达基因的高效富集，同时表达量很低的差异表达基因可以被有效富集；(b)能够得到全长cDNA序列。

摘要： 本发明提供了一种全长cDNA均一化消减杂交方法，所述方法包括以下顺序步骤：(1)第一链cDNA的合成；(2)双链cDNA的合成；(3)选择性连接和引物延伸；(4)消减杂交；(5)PCR扩增差异表达的cDNA。消减杂交的PCR产物可以直接克隆到载体上，构建差异表达基因富集的cDNA文库，利用这些文库分析基因表达，也可以制备基因芯片，还可以标记为探针，从已有文库中筛选差异表达的基因。此外如果消减效率不够高，还可以把消减杂交的PCR产物重复进行消减杂交，提高均一化和消减效率。本发明所述的全长cDNA均一化消减杂交(FNSH)方法的有益效果主要体现在：对差异基因的高消减效率，对差异表达基因的高效富集，高效均一化，并且得到全长cDNA。

摘要： 本发明涉及蛋白表达差异的分析方法，特别是直接在蛋白质水平上分析蛋白表达差异的方法。本发明通过构建DNA或RNA随机序列库（aptamer库），使之进入细胞体内结合相应特异性抗原蛋白分子。如果某蛋白分子有表达数量差异，那么其结合的特异性DNA、RNA序列或aptamer也会表现出相应的数量变化来，从而把在蛋白水平上的消减杂交转移到对DNA序列的消减杂交上来。从而达到了简捷快速的高通量筛选表达差异蛋白的目的。

摘要： 本发明公开了一种消减杂交文库构建方法，该方法包括以下步骤：(1)消减杂交装置的制备；(2)检测组和驱动组的酶切；(3)驱动组的固定；(4)检测组连接接头；(5)进行消减杂交；(6)消减产物的分组扩增；(7)消减杂交文库的构建。与传统的物理消减杂交方法相比，本发明具有以下优点：1)消减杂交装置成本低，制作简单；2)尼龙膜与核酸分子以共价键结合，结合牢固；3)在杂交过程中可控制杂交温度和时间；4)可根据需要控制杂交轮次；5)洗脱体积可按需要控制在数十微升，便于进一步的操作；6)试验操作简单，可重复性好；7)在消减杂交后进行PCR，避免了假阳性的出现；8)消减后进行分组PCR，可使低丰度的差异表达cDNA扩增。