狼疮性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库的构建

摘要

目的 采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建汉族人狼疮性肾炎(Lupus Nephritis LN)肾阳虚证cDNA消减文库.方法 选择汉族人LN且中医辨证为肾阳虚证的患者以及正常人作为其对照组,进行正向和反向消减杂交.采用Trizol一步法提取总RNA,用SMART(Switch Mechanism At 5 end of RNA Template)技术逆转录并扩增总cDNA,用RsaI酶切基因组cDNA成大小不等的片断,分别与两种不同的接头连接,进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将PCR产物与U载体连接,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建LN肾阳虚证消减文库.结果 用SSH方法筛选出了LN肾阳虚证的差异cDNA片段,得到了480个白色克隆,再经PCR方法快速筛选出阳性重组质粒,从而成功地构建了LN肾阳虚证的cDNA消减文库.结论 SSH技术能够快速有效地分离差异cDNA片段以构建LN肾阳虚证cDNA消减文库,为进一步筛选和克隆LN肾阳虚证相关基因奠定了基础.