真核表达

摘要： 为获得增强型猫ω干扰素(FeIFN-ω),本研究通过分子对接方法预测和参考相关位点研究,设计3组定点突变引物。以pJET-FeIFN-ω为模板分别扩增FeIFN-ω基因及其3个突变基因(FeIFN-ω-R35L、FeIFN-ω-A156R、FeIFN-ω-T188R),并连接慢病毒载体pLVX-IRSE,构建重组质粒pLVX-FeIFN-ω、pLVX-FeIFN-ω-R35L、pLVX-FeIFN-ω-A156R、p LVX-FeIFN-ω-T188R。4个重组质粒分别与包装质粒psPAX2和膜蛋白质粒pMD2.G共转染293T细胞包装慢病毒,48 h后收获细胞上清即为慢病毒。分别将4个慢病毒转导293悬浮细胞(293s),扩大培养后收获细胞上清,经镍离子亲和层析柱纯化蛋白,并经SDS-PAGE检测、BCA法测蛋白浓度。结果显示,rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R、rFeIFN-ω-T188R在293s细胞中得到高效表达,且蛋白纯化效果好;经BCA法测浓度,4种重组蛋白浓度均约为200μg/mL,即获得了重组干扰素rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R、rFeIFN-ω-T188R。4种重组干扰素分别经猫肾细胞(CRFK)孵育18 h后接种猫杯状病毒(FCV)或猫疱疹病毒(FHV)12 h,经相对荧光定量PCR法检测干扰素抗FCV和FHV活性;4种重组干扰素分别经CRFK细胞孵育12 h,经相对荧光定量PCR法检测干扰素刺激基因ISG15、Viperin、IFITM1的转录水平,结果显示:实验组与空白对照组差异极显著(P0.05)或表现为活性降低,rFeIFN-ω-T188R与rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R差异均显著(P<0.05)表现为活性增强,并且r FeIFN-ω-T188R抗病毒活性及诱导ISGs的转录水平均比rFeIFN-ω高1倍左右。选择r FeIFN-ω和rFeIFN-ω-T188R分别与His纯化树脂结合,加入等量表达干扰素受体(IFNAR1/R2)的重组质粒转染293T细胞的裂解液,4°C结合过夜,经western blot鉴定干扰素与IFNAR1/R2结合亲和力分析,结果显示,rFeIFN-ω-T188R与IFNAR1的结合能力比r FeIFN-ω高1倍左右,且两者与IFNAR2的结合能力差异不显著。本研究成功筛选到增强型rFeIFN-ω-T188R,为研究高效FeIFN-ω药物奠定了基础。

摘要： 【目的】扩增牛妊娠相关蛋白19(bovine pregnancy-associated glycoprotein 19,BoPAG19)基因,构建真核表达载体,并检测其在HEK-293F细胞中的表达。【方法】根据BoPAG19基因序列(GenBank登录号:NM_176628)体外合成BoPAG19基因,PCR扩增目的基因,经双酶切后与真核表达载体pcMV3连接,构建pcMV3-BoPAG19重组质粒。采用Lipofectamine■2000将重组质粒瞬时转染至HEK-293F细胞,SDS-PAGE法鉴定细胞培养上清中BoPAG19蛋白的表达,采用亲和层析法纯化BoPAG19蛋白。通过在线工具分析BoPAG19蛋白的疏水性、跨膜区域、信号肽、B细胞抗原、二级结构、三级结构和蛋白相互作用。【结果】成功构建pcMV3-BoPAG19重组载体,目的基因长约1200 bp,表达蛋白约60 ku。生物信息学分析显示,BoPAG19蛋白编码380个氨基酸,其中含量最高的是丝氨酸(Ser),占比9.2%,含量最低的是色氨酸(Trp),占比1.6%;分子式为C_(1937)H_(3028)N_(524)O_(532)S_(15),理论分子质量为41.8 ku,等电点为9.62,不稳定指数为40.75,在水中不稳定,脂肪系数为91.53,消光系数为52370 mol^(-1)·cm^(-1),具有水溶性;含有1个信号肽,无跨膜区域,有6个糖基化位点和11个B细胞表位;二级结构中α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸链占比分别为18.95%、6.32%、42.37%和32.37%,三级结构预测结果与二级结构一致。与BoPAG19互作的蛋白包括APLP2和APP,可能参与了妊娠期的神经调节。【结论】试验成功表达、纯化了BoPAG19蛋白,并分析了BoPAG19的生物信息学特征,为BoPAG19蛋白的结构和功能研究,以及BoPAG19诊断奠定基础。

摘要： 反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV) C和V蛋白是P基因通过特殊编码方式产生的两种非结构蛋白,他们通过抑制干扰素产生在天然免疫中发挥重要作用。本研究将C基因起始密码子AUG突变为ACG,并在氨基酸序列的第9位、第12位引入终止密码子,在V基因编码氨基酸序列的第7位、第285位、第294位引入三个终止密码子,运用PCR技术扩增获得了表达沉默的突变基因ΔC和ΔV,构建了真核表达载体p3flag-CMV-14-ΔC和p3flag-CMV-14-ΔV。实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测表明转染突变基因质粒HEK-293T细胞中C基因(P<0.001)和V基因(P<0.01)表达均极显著降低,蛋白质印迹(Western blot)检测表明转染突变基因质粒细胞中C蛋白和V蛋白均无表达。研究结果为进一步研究PPRV病毒C和V蛋白的功能提供了科学依据。

摘要： 目的:为后续进一步研究H1N1病毒DNA疫苗对小鼠免疫系统的影响提供技术支撑。方法:应用PCR方法体外扩增血凝素(HA)基因全序列,并利用pcDNA3.1(+)载体构建甲型流感病毒(H1N1)血凝素(HA)的真核表达质粒(pcDNA3.1(+)-HA),经双酶切鉴定后,转染293T细胞,通过RT-PCR和Western blot方法观察该重组质粒在293T细胞中的表达情况。结果表明,pcDNA3.1(+)-HA重组质粒构建成功;与空白及阴性对照相比,转染293T细胞48 h后的HA mRNA水平显著上升(2.4×10^(3),P<0.0001),并能在293T细胞中成功表达,为深入研究H1N1病毒DNA疫苗对小鼠免疫系统的影响奠定了基础。

摘要： 目的:构建人自噬受体蛋白p62的真核表达质粒,初步探索p62在氧化应激中的功能。方法:从HeLa细胞系中扩增SQSTM1基因,插入真核表达载体nFLAG/pRK5,构建p62的重组表达质粒nFLAG-SQSTM1/pRK5。采用HEK293T细胞表达带有FLAG标签的重组p62蛋白,免疫共沉淀法观察p62和核因子E2相关因子2(Nrf2)相互作用。结果:重组表达质粒nFLAG-SQSTM1/pRK5经琼脂糖凝胶电泳和测序对比均与预期结果一致,Western blot实验中p62蛋白可正常表达,且大小与预期结果一致。免疫共沉淀和蛋白质谱证明p62与氧化应激转录调控蛋白Nrf2可相互作用。结论:采用真核表达系统成功表达p62蛋白,并发现其与Nrf2可相互作用,为进一步研究p62与Keap1-Nrf2通路关系提供依据。

摘要： 为了明确猪TREX1在JEV感染中的作用,本研究利用PCR扩增获得猪TREX1基因的ORF,并将该基因克隆至真核表达载体p3xFlag-CMV-14中,将构建的重组真核表达质粒命名为pFlag-pTREX1,利用lipofectamine 2000将构建成功的pFlag-pTREX1重组质粒瞬时转染至293T细胞中,通过Western blot检测其表达情况,最后在PIEC细胞上,通过猪TREX1基因过表达或沉默TREX1基因的表达,分析其在JEV感染中的作用。结果显示:本研究成功构建了Flag-pTREX1真核表达载体;利用抗Flag抗体可以识别真核表达的Flag-pTREX1融合蛋白,约35 kDa;与转染Flag-vector的样品相比,过表达猪TREX1促进JEV在PIEC上的感染;与NC对照组相比,沉默猪TREX1基因的表达抑制JEV在PIEC上的表达。结果表明,本研究成功构建了猪TREX1基因真核表达载体并初步探索了猪TREX1在JEV感染中的作用,这为进一步研究猪TREX1在猪源病毒中的作用奠定了基础。

摘要： 为建立一种能检测血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的阻断ELISA方法,本研究以真核表达后纯化的ASFV p30重组蛋白作为包被抗原,以特异性单抗作为阻断抗体,经条件优化、特异性试验和敏感性试验,建立了一种检测血清中ASFV抗体的阻断ELISA方法。结果显示,纯化后的p30重组蛋白大小约为25 ku,建立的ASFV抗体阻断ELISA检测方法通过方阵试验优化后,最终确定了抗原最佳包被浓度为1μg/m L,待检血清最佳稀释度为1∶2,最佳封闭液为5%BSA,酶标抗体最佳稀释度为1∶20 000,阴阳性血清临界值为35.11%。本方法与PCV3灭活阳性血清、PRRSV灭活阳性血清、SVA灭活阳性血清、PRV灭活阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。本方法检测ASFV阳性血清的敏感性可达1∶128。本试验建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,在非洲猪瘟的临床检测中具有广泛的应用价值。

摘要： 【目的】旨在构建轮状病毒(Rotavirus,RV)非结构蛋白1(NSP1)和3(NSP3)真核表达载体,并在人胚肾上皮HEK239T细胞中表达,随后研究轮状病毒NSP1和NSP3在体外初步影响IFN-β/ISRE报告基因活性。【方法】首先合成猿轮状病毒SA11株NSP1、NSP3编码基因连接到克隆载体pUCm-T上,通过PCR技术扩增目的片段,再以真核表达载体pRK-Flag、pRK-HA为骨架构建出可特异性表达重组蛋白pRK-Flag-NSP1/pRK-HA-NSP1、pRK-Flag-NSP3/pRK-HA-NSP3的真核表达质粒,经酶切及测序鉴定正确后将质粒转染到HEK293T细胞中,通过Western blot鉴定NSP1/NSP3蛋白的表达。随后,将重组质粒pRK-Flag-NSP1/pRK-Flag-NSP3与IFN-β-Luc/ISRE-Luc质粒共转染至HEK239T细胞,经RIG-IN(RIG-I活化结构域)的刺激后利用双荧光素酶报告基因系统判定NSP1/NSP3蛋白对IFN-β/ISRE报告基因活性的影响。【结果】成功克隆了NSP1和NSP3全长基因,构建了猿轮状病毒SA11株NSP1、NSP3蛋白真核表达质粒pRK-Flag-NSP1/pRK-HA-NSP1、pRK-Flag-NSP3/pRK-HA-NSP3,并在HEK293T细胞中转染表达,Western blot确定了NSP1和NSP3蛋白成功表达。重组质粒pRK-Flag-NSP1和pRK-Flag-NSP3可显著降低RIG-IN诱导的双荧光素酶活性。【结论】NSP1和NSP3蛋白可抑制RIG-IN刺激的IFN-β和ISRE启动子活性,证明NSP3蛋白和已报道的NSP1蛋白一样具有抑制IFN-β信号通路的功能,为深入研究NSP3蛋白调控Ⅰ型干扰素信号通路的作用机制奠定理论基础。

摘要： 本实验成功构建了真核表达质粒pVAX1-IL-2,并对质粒进行PCR,双酶切及测序鉴定,RT-PCR成功验证了目的基因在MDBK细胞中能够转录,同时ELISA验证目的基因在MDBK细胞中能表达。研究结果为pVAX1-IL-2作为核酸疫苗的细胞因子佐剂的应用研究提供生物材料。

摘要： 【目的】构建表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的重组猪痘病毒(recombinant Swinepox virus,rSWPV),制备抗GFP单克隆抗体。【方法】首先合成3′-端含His标签的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)序列EGFP-His,用双酶切方法将其插入到基础质粒载体pSW中,构建重组转移载体pSW-EGFP-His;采用脂质体转染的方法使该载体与SWPV(SWPV-JX20G株)同源重组,经蚀斑纯化获得rSWPV-EGFP-His。重组病毒进行PCR和SDS-PAGE鉴定,扩增并纯化EGFP-His蛋白免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌抗GFP特异性抗体的杂交瘤细胞,制备腹水,对抗GFP单克隆抗体进行效价及特异性鉴定。【结果】PCR和SDS-PAGE结果显示,成功构建并纯化到rSWPV-EGFP-His,该病毒感染PK15细胞可稳定表达EGFP-His蛋白,蛋白大小约27 ku,为可溶性表达,镍柱纯化的EGFP-His蛋白溶液呈明显的绿色。EGFP-His蛋白免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠血清抗体效价高达1∶256000。采用杂交瘤技术制备了9株能稳定分泌抗EGFP-His单克隆抗体的杂交瘤细胞株,间接ELISA和Western blotting结果显示,9株单克隆抗体中的7株针对GFP的线性表位,另外2株单克隆抗体针对GFP的构象表位。【结论】本研究成功制备了EGFP-His蛋白和9株抗EGFP-His的单克隆抗体,为后续建立GFP的免疫学检测方法提供了必备材料。

摘要： 葡萄糖转运蛋白4(Glut4)介导的葡萄糖转运是肌糖代谢的主要限速步骤.本研究旨在克隆广西巴马小型猪Glut4基因,构建真核表达载体,转染细胞研究Glut4功能.以广西巴马小型猪背最长肌组织作为实验材料,通过RT-PCR技术扩增出Glut4基因编码序列,连接入PMD18－T克隆载体,测序鉴定正确后提取克隆质粒.用BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶双酶切克隆质粒,获得Glut4片段,连接至pEGFP-N1载体上,构建真核表达载体pEGFP-N1-Glut4,鉴定正确后,提取pEGFP－N1－Glut4重组质粒转染至C2C12细胞,观察细胞荧光表达情况,并检测转染24h和48h时培养液的葡萄糖浓度.实验结果表明:广西巴马小型猪Glut4基因编码区序列长1530bp,编码509个氨基酸,与参考序列(序列号为EU590115.1)的同源性为99.7％;重组质粒转染C2C12细胞能表现出绿色荧光,转染24h和48h时,细胞培养液中葡萄糖浓度均显著低于空载体转染组(16.08±0.49vs.17.13±0.13,4.93±0.19vs.6.28±0.12,P＜0.01).在C2C12成肌细胞中过表达广西巴马小型猪Glut4基因,能增加细胞的葡萄糖摄入量.

摘要： 本试验旨在构建甲型H7N9流感病毒非结构蛋白(NS1)真核表达载体,并在293T细胞中表达其编码的NS1蛋白.首先提取安徽分离株甲型H7N9流感病毒(A/Anhui/3/2013(H7N9))的总RNA,通过RT-PCR技术获得了甲型H7N9流感病毒H7N9NS1全长基因,然后将其克隆至载体pcDNA4-Flag-HA中构建pcDNA4-Flag-HA-NS1真核重组表达载体,经酶切及测序鉴定正确后将质粒pcDNA4-Flag-HA-NS1转染到293T细胞中,通过Western blotting鉴定NS1蛋白的表达.结果表明成功克隆了NS1全长基因,构建了甲型H7N9流感病毒NS1蛋白真核表达载pcDNA4-Flag-HA-NS1,并在293T细胞中转染表达,Western blotting确定了NS1蛋白的成功表达.该表达载体的成功构建及在293T细胞中成功表达NS1蛋白,为后期开展流感病毒NS1蛋白功能及与真核细胞中的蛋白相互作用奠定了基础.

摘要： MEQ基因是马立克氏病病毒血清l型特异性基因,为了研究MEQ基因的致瘤机理,本研究构建了MEQ基因的真核表达载体.首先采用TA克隆将MEQ基因片段连接pMD19-T Vector质粒,构建成pMD19-T-meq质粒,然后采用EcoRI、XhoI限制性内切酶双酶切将MEQ基因克隆至pVAX-1真核表达质粒,构建pVAX-1-meq真核表达质粒.提取pVAX-1-meq质粒转染至鸡胚成纤维细胞中,转染后提取贴壁细胞中总RNA,以β-actin作为内参采用real-time PCR检测MEQ基因、错配修复相关基因、p53基因的mRNA的表达情况.结果本试验成功构建出pVAX1-meq真核表达载体,并在鸡胚成纤维细胞中成功表达.MEQ基因转染的鸡胚成纤维细胞中错配修复相关基因(MSH2和MLH1基因)、p53基因的mRNA表达量显著上调.表明MDV感染造成宿主DNA损伤后,MEQ基因影响DNA损伤修复相关基因的表达,干扰宿主对损伤的DNA进行修复,导致MD肿瘤的形成.

摘要： 为了增强猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)DNA疫苗免疫效力,以pVAXI为真核表达载体,以PRRSV ORF5基因为目的基因,构建了含有CpG和PRRSV ORF5的真核表达质粒CpG-pVAX1-ORF5,并在猪体进行了免疫试验.检测猪PRRSV的特异性抗体滴度、IL-2水平以及淋巴细胞增殖反应(MTT法)水平,并做了攻毒保护试验.

摘要： 为制备高活性的犬干扰素α4(CaIFN-α4),将犬IFN-α4和绿色荧光蛋白(GFP)基因用2个GGGGS五肽(2G4S)柔性肽连接,获得犬IFN-α4和GFP的融合基因(CaIFN-α4-GFP).将该融合基因与真核表达载体pL-eGFP连接,构建重组表达质粒pL-CαIFN-α4-GFP,并与其它三种慢病毒质粒(pC-Gp,pR-Rev,pC-VsvG)共同转染293FT细胞,包装获得重组慢病毒(vCaIFN-α4-GFP).用获得的重组慢病毒感染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,经杀道瘟菌素筛选、流式细胞仪分选和有限稀释法克隆转染细胞,获得表达CaIFN-α4-GFP的CHO细胞.用荧光显微镜观察构建的CHO细胞呈现荧光,用MDCK与MDBK细胞检测CHO细胞培养上清液具有抗水疱性口炎病毒(VSV)活性,活性分别为1.39×105U/ml和2.19×104U/ml.本研究成功地利用CHO细胞表达了具有活性的犬干扰素α4,为进一步研制高活性的犬IFN-α4生产系统奠定了实验基础.

摘要： 近年来,胰岛素样生长因子-1(IGF-1)成为研究者们关注的一个重要基因和研究热点,IGF-1能促进细胞对葡萄糖和氨基酸摄取与利用,增加糖原、脂肪和蛋白等的合成,刺激细胞遗传物质的复制、细胞增殖分化、性腺分泌,促进产后动物泌乳以及新生动物肠道发育等功能.目前,本课题已成功克隆了藏猪IGF-1基因及序列分析,但国内尚未见关于藏猪成熟肽IGF-1表达及活性研究报道.Ma等研究表明,猪血浆中的IGF-1水平与猪的体重及增重成正相关,在猪的生长和生殖调控中具有具有重要的生理作用,但血液中IGF-1的含量很低,提取纯化根本无法满足基础研究及治疗需要,且人工合成成本高,采用基因工程在体外大量获得具有生物活性的IGF-1成熟蛋白将是实现IGF-1作用的根本.笔者曾采用大肠杆菌表达系统对IGF-1基因进行原核表达,但原核表达系统缺少蛋白质翻译后修饰和加工,很难表达出具有天然活性的成熟肽,如果把它制成新型的动物生长制剂,后期处理程序较复杂,生产成本高,使得IGF-1在临床的应用将受到限制.毕赤酵母表达系统被认为是一种较为理想的外源蛋白表达系统,该系统遗传稳定,适于高密度培养、重组表达产物杂蛋白少,表达出来的成熟肽具有天然活性.因此本试验利用PCR技术扩增出藏猪IGF-1成熟肽基因,克隆到分泌表达载体pPIC9K并转化至毕赤酵母GS115中,进行真核表达,为进一步研究其生物学功能及其开发IGF-1蛋白作为一种新型的动物生长制剂提供科学依据.本试验在反向引物后端直接合成上His尾巴和c-myc标签，克隆出IGF-1成熟肽基因，克隆到pPIC9k上，转化GS115中，甲醇诱导，获得了具有促进细胞增殖生物活性的体外重组IGF-1成熟肽蛋白。本试验是未经优化的基因，仅仅通过pPIC9K表达载体上一段信号肽序列a因子信号序列来介导IGF-1成熟肽的分泌表达，添加以便后期纯化的His标签和便于检测重组蛋白在靶细胞中表达的c-myc标签，简单的优化发酵条件是远远不够的，今后研究中还可以采用优化密码子、应用AOX1和UAP启动子组合共表达重组蛋白等方法来提高蛋白质的表达量，为藏猪IGF-1成熟肽应用于畜牧业并且规模化生产进行进一步摸索。

摘要： 本研究旨在构建菌丝霉素Plectasin (Ple)的真核重组表达载体pPICZαA-Ple,表达重组菌丝霉素,并鉴定其生物活性和稳定性.根据本实验室前期构建的质粒pMD 19-T-Ple获得目的基因,通过限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ双酶切和DNA连接酶构建重组质粒pPICZαA-Ple,通过电转导入宿主菌X33,筛选阳性转化子诱导表达.结果表明:重组菌pPICZαA-Ple/X33成功表达了一个41 kDa的融合蛋白,产量达143 μg/mL.融合蛋白经过超滤管浓缩和亲和层析纯化后,抑菌活性试验表明,本试验获得的重组菌丝霉素对猪链球菌和金黄葡萄球菌等革兰氏阳性菌有强烈的抑制作用,最小抑菌浓度显示菌丝霉素对猪链球菌最为敏感,最小抑菌浓度为4 μg/mL,重组菌丝霉素能从pH 2.0到10.0保持抗菌活性,且经胃蛋白酶消化处理后仍能保持较强的抑菌活性.上述研究结果表明,本实验室构建表达的重组菌丝霉素抗菌肽具有较强的稳定性,具有替代抗生素在动物生产上应用的潜力.

摘要： 本研究构建了一株犬瘟热病毒(CDV)ZH-10株H基因的真核表达载体pCI-H,对表达产物的免疫原性进行了初步研究,并进行了小鼠的DNA免疫试验.结果显示:pCI-H免疫组血清可与感染病毒的MDCK细胞发生特异性IPMA反应呈现特异的棕红色;ELISA血清抗体滴度可达1∶28～1∶79;病毒中和抗体可达1∶11～1∶32.研究表明H蛋白具有免疫原性,但是诱导抗体效价不足,需进一步完善.

摘要： 在本研究中试图通过对miRNA-449a在肺癌细胞株中的生物学作用进行研究，探讨肺癌发生发展过程中的内在机制，为提高肺癌的特异性治疗及预后判断水平提供新的思路，同时探索肺癌的特异性新靶标。结果：1) miR-449a在低转移性人肺巨细胞癌细胞株95C中的表达水平明显高于在高转移性人肺巨细胞癌细胞株95D中的水平，提示其可能与肺癌转移相关，有可能成为肺癌治疗的目的基因。2)成功构建了真核表达载体pCDNA3.1-miR-449a,并建立了稳定过表达miR-449a的95D-pCDNA3.1-miR-449a细胞株，为研究miR-449a对肺癌细胞的生物学功能的影响奠定了基础。3)过表达miR-449a可以使肺癌细胞株95D的迁移及侵袭能力降低，而增殖能力无变化，显示miR-449a可以抑制肺癌细胞的迁移及侵袭能力，提示miR-449可能与肺癌的转移相关，为肺癌的早期诊断及基因靶向治疗和预后判断提供了新的理论基础。

摘要： X-连锁肾上腺-脑白质营养不良(X-linked adrenoleukodystrophy,X-ALD)是一种遗传异质性疾病,其疾病基因——ABCD1基因定位于染色体Xq28,编码1个含745个氨基酸残基的蛋白质,称为ABCD1蛋白,又称ALD蛋白(ALD protein,ALDP).其生化特点是极长链饱和脂肪酸(very long chain fatty acids,VLCFAs),特别是二十六烷酸(C26:0)及二十四烷酸(C24:0)在不同组织和体液中的积累.病变主要侵犯脑白质、肾上腺等组织，临床上主要表现为听力、视力、智力及运动障碍等中枢神经系统症状以及肾上腺皮质功能减退的症状。

摘要： 本发明的目标是克服与常规真核阿马道里酶中热稳定性有关的缺陷并提供具有优良的热稳定性的真核阿马道里酶以用作糖尿病的临床诊断用酶或酶传感器。公开了：真核阿马道里酶，其通过向编码来自属于锥毛壳属或正青霉属的微生物的真核阿马道里酶的DNA中引入突变以便在真核阿马道里酶中的特定氨基酸残基中引入替代，从而克服与热稳定性有关的缺陷；真核阿马道里酶的基因或重组DNA；和生产具有优良热稳定性的真核阿马道里酶的方法。

摘要： 本发明的目标是克服与常规真核阿马道里酶中热稳定性有关的缺陷并提供具有优良的热稳定性的真核阿马道里酶以用作糖尿病的临床诊断用酶或酶传感器。公开了，真核阿马道里酶，其通过向编码来自属于锥毛壳属或正青霉属的微生物的真核阿马道里酶的DNA中引入突变以便在真核阿马道里酶中的特定氨基酸残基中引入替代，从而克服与热稳定性有关的缺陷；真核阿马道里酶的基因或重组DNA；和生产具有优良热稳定性的真核阿马道里酶的方法。

摘要： 本发明涉及一种基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统及其在真核生物中表达蛋白质的方法。所述稳定T7表达系统包含T7 RNA聚合酶、T7转录单元和病毒加帽酶，所述T7转录单元由T7启动子、T7终止子和目标基因构成。所述方法包括将T7 RNA聚合酶整合到宿主基因组，将T7启动子启动的转录单元构建到载体或基因组，利用病毒加帽酶为T7 RNA聚合酶合成的mRNA加5′Cap结构，帮助T7 RNA聚合酶转录的mRNA运输到细胞质，并在细胞质与核糖体结合，完成翻译和高水平表达目标蛋白质。本发明的基于病毒加帽酶的T7表达系统不随宿主细胞的分裂而丢失，在真核生物中高效稳定地表达外源蛋白。

摘要： 本发明提供了一种真核表达载体、真核表达系统、二者的制备方法和应用及GDF11蛋白，涉及分子生物学技术领域，本发明提供的真核表达载体，能够高表达GDF11基因。本发明提供的上述真核表达载体的制备方法，包括将GDF11基因片段插入重组质粒，操作简单，制备得到的真核表达载体具有高表达GDF11基因的效果。本发明提供的真核表达系统，宿主细胞为CHO，能够稳定高效地表达重组蛋白GDF11。本发明提供的上述真核表达系统的制备方法，包括将真核表达载体转染到CHO细胞中，培养并筛选，通过DHFR二氢叶酸还原酶系统进行转染子筛选，能够在保证细胞活率的情况下，通过反馈调节，使GDF11基因扩增，提高蛋白的表达量。

摘要： 本发明提供了一种SLO蛋白的真核表达和含真核表达SLO蛋白的试剂盒。本发明通过真核表达获得SLO蛋白，还利用该蛋白发明了一种检测ASO含量的试剂盒，所述试剂盒由R1试剂、R2试剂和校准品三部分组成，其中R1试剂为磷酸盐缓冲体系，R2试剂为胶乳悬浮液，校准品主要为牛血清基质。本发明采用真核表达系统表达出纯度高、活性强的，并且采用复合乳胶颗粒包被SLO蛋白抗原，解决了目前市场上ASO检测灵敏度不高、重复性欠佳、不能满足临床对ASO定量的要求的问题，明显提高了测定结果的灵敏度、准确性和线性。

摘要： 本发明提供了一种真核表达载体、真核表达系统、二者的制备方法和应用及GDF11蛋白，涉及分子生物学技术领域，本发明提供的真核表达载体，能够高表达GDF11基因。本发明提供的上述真核表达载体的制备方法，包括将GDF11基因片段插入重组质粒，操作简单，制备得到的真核表达载体具有高表达GDF11基因的效果。本发明提供的真核表达系统，宿主细胞为CHO，能够稳定高效地表达重组蛋白GDF11。本发明提供的上述真核表达系统的制备方法，包括将真核表达载体转染到CHO细胞中，培养并筛选，通过DHFR二氢叶酸还原酶系统进行转染子筛选，能够在保证细胞活率的情况下，通过反馈调节，使GDF11基因扩增，提高蛋白的表达量。

摘要： 本发明提供了一种SLO蛋白的真核表达和含真核表达SLO蛋白的试剂盒。本发明通过真核表达获得SLO蛋白，还利用该蛋白发明了一种检测ASO含量的试剂盒，所述试剂盒由R1试剂、R2试剂和校准品三部分组成，其中R1试剂为磷酸盐缓冲体系，R2试剂为胶乳悬浮液，校准品主要为牛血清基质。本发明采用真核表达系统表达出纯度高、活性强的，并且采用复合乳胶颗粒包被SLO蛋白抗原，解决了目前市场上ASO检测灵敏度不高、重复性欠佳、不能满足临床对ASO定量的要求的问题，明显提高了测定结果的灵敏度、准确性和线性。

摘要： 本发明公开了一种牙鲆SOCS3基因及其真核表达载体、表达系统和异源表达方法。所述牙鲆SOCS3基因的核酸序列如SEQIDNO.1所示。扩增所述牙鲆SOCS3基因的上游引物如SEQIDNO.2所示，下游引物如SEQIDNO.3所示。本申请在成功克隆牙鲆SOCS3基因的基础上，进一步构建了牙鲆SOCS3基因的真核表达载体pEGFP‑C1‑PoSOCS3，并将其成功转染HEK293T细胞中，荧光倒置显微镜观察牙鲆SOCS3基因在细胞中的亚细胞定位，为后续的牙鲆SOCS3功能研究提供了基础资料。

摘要： 本发明公开了一种AIDA-I表达元件和CMV真核表达元件共表达载体的构建方法，具体包括

摘要： 本发明公开了一种人PAK1蛋白的真核表达载体的构建方法，包括如下步骤：1)以表达PAK1蛋白的基因序列为模板，采用PCR扩增获得PAK1基因片段；2)将得到的PAK1基因片段连接到真核表达载体上得到重组质粒；3)将得到的重组质粒进行转染转化复制，得到人PAK1蛋白的真核表达载体。还公开了利用真核表达系统进行重组人PAK1蛋白表达的方法：还包括步骤4)利用步骤3)获得的人PAK1蛋白的真核表达载体扩增纯化得到的质粒转染进入真核细胞中进行表达。还公开了获得重组人PAK1蛋白的方法：还包括步骤5)将步骤4)得到的阳性克隆进行培养扩大体系，收集培养细胞，离心收集上清，通过色谱柱纯化，即得。