具有优良的热稳定性的真核阿马道里酶、真核阿马道里酶的基因和重组DNA，和生产具有优良的热稳定性的真核阿马道里酶的方法

摘要

本发明的目标是克服与常规真核阿马道里酶中热稳定性有关的缺陷并提供具有优良的热稳定性的真核阿马道里酶以用作糖尿病的临床诊断用酶或酶传感器。公开了，真核阿马道里酶，其通过向编码来自属于锥毛壳属或正青霉属的微生物的真核阿马道里酶的DNA中引入突变以便在真核阿马道里酶中的特定氨基酸残基中引入替代，从而克服与热稳定性有关的缺陷；真核阿马道里酶的基因或重组DNA；和生产具有优良热稳定性的真核阿马道里酶的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及具有优良的热稳定性的真核阿马道里酶(amadoriase)、真核阿马道里酶的基因和重组DNA，和生产具有优良的热稳定性的真核阿马道里酶的方法。

背景技术

阿马道里酶在氧存在的情况下氧化亚氨基二乙酸或其衍生物(也称作“阿马道里化合物”)以催化反应而产生水合乙醛酸或α-酮醛、氨基酸或肽，和过氧化氢。

已经在细菌、酵母和真菌中发现了阿马道里酶(例如，见专利文件1到4)。已经从曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、镰孢属(Fusarium)、毕赤氏酵母属(Pichia)、锥毛壳属(Coniochaeta)、正青霉属(Eupenicillium)、棘壳孢属(Pyrenochaeta)、节菱孢属(Arthrinium)、新赤壳菌属(Neocosmospora)、棒杆菌属(Corynebacterium)和土壤杆菌属(Agrobacterium)纯化了阿马道里酶以测定每种阿马道里酶的氨基酸序列(例如，见，非专利文件1到4和专利文件5到9)。

可以将这些阿马道里酶分类为原核和真核阿马道里酶的两种类型。来自原核生物的原核阿马道里酶和来自真核生物的真核阿马道里酶具有分别与仅仅相同类型中的阿马道里酶有高同源性的氨基酸序列，而所述氨基酸序列在真核和原核阿马道里酶的不同类型之间具有极低的同源性。

原核阿马道里酶具有如下问题：通过在酶的纯化或保存期间由于与辅酶形成不是共价键的键而分离一些辅酶，而不幸地丧失它们的酶活性。相比之下，在原核阿马道里酶中证实的前述问题在真核阿马道里酶中却没有看到，因为真核阿马道里酶与辅酶形成共价键，且从而真核阿马道里酶具有优良的实用特征。

在糖尿病的临床诊断领域中，已经注意到糖基化血红蛋白(HbAlc)为血糖(glycemic)控制标记，其对于诊断糖尿病患者和控制状况是重要的。关于快速和简单地测量HbAlc的方法，已经提出了使用阿马道里酶的酶方法，即，测量由例如蛋白酶分解HbAlc所释放的糖基化的氨基酸或糖基化的肽的方法(例如，见专利文件10到13)。

在阿马道里酶作为临床诊断糖尿病的酶被配制为用于试剂盒试剂的情况中，要求热稳定性作为酶的性质。来自土曲霉(Aspergillus terreus)GP1菌株的真核阿马道里酶在45℃热处理10分钟中显示的残留活性为约40％(例如，见非专利文件2)。来自尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)S-1F4菌株的真核阿马道里酶在45℃热处理5分钟中显示的残留活性为约10％(例如，见非专利文件5)。来自Coniochaetidium savoryiATCC36547菌株的真核阿马道里酶在等于或小于37℃热处理30分钟中显示的残留活性为80％(例如，见专利文件14)。此外，来自节菱孢属物种(Arthrinium sp.)TO6、棘壳孢属物种(Pyrenochaeta sp.)YH807、颖枯壳小球腔菌(Leptosphaeria nodorum)NBRC7480、葱叶格孢腔菌(Pleospora herbarum)NBRC32012和匍毛蛇孢腔菌(Ophiobolusherpotrichus)NBRC6158的每种真核阿马道里酶在等于或小于40℃热处理30分钟中显示出80％的残留活性。来自侵脉新赤壳菌(Neocosmospora vasinfecta)NBRC7590菌株的真核阿马道里酶在等于或小于45℃热处理30分钟中也显示出80％的残留活性。来自棒弯孢(Curvularia clavata)YH923菌株的真核阿马道里酶在等于或小于50℃热处理30分钟中显示出80％的残留活性(例如，见专利文件14)。

然而，在这些真核阿马道里酶被用作临床诊断用酶的情况中，需要进一步的热稳定性。即，考虑到真核阿马道里酶作为糖尿病的临床诊断用酶配制用于试剂盒试剂，和用作酶传感器，需要更高的热稳定性，尽管来自棒弯孢YH923菌株的酶(具有最高的热稳定性)在等于或小于50℃下热处理30分钟中显示出80％的残留活性。

关于一般的技术，已知向编码酶的DNA加入突变、向酶的氨基酸中引入替代并选择具有优良的热稳定性的酶以提高酶的热稳定性的方法。此外，如果通过在具有高同源性的酶中进行氨基酸替代提高热稳定性的实例是已知的，那么可以基于该信息预期热稳定性的提高。

实际上，在来自棒杆菌属细菌的原核阿马道里酶中，已经表明通过替代几个氨基酸将提高原核阿马道里酶的热稳定性(例如见，非专利文件5)，并且也可以向其他原核阿马道里酶中引入热稳定性。

然而，因为如上所述，阿马道里酶的氨基酸序列在真核阿马道里酶和原核阿马道里酶类型之间具有极低的同源性，所以不可能期望基于涉及来自棒杆菌属细菌的原核阿马道里酶的热稳定性的氨基酸突变信息而提高真核阿马道里酶的热稳定性。

同样，还没有报导通过氨基酸替代提高公知的真核阿马道里酶的热稳定性，并且不可利用关于真核阿马道里酶的热稳定性的现有信息。需要广泛的专门研究来确定需要替代序列中的哪个氨基酸以在实际上提高真核阿马道里酶类型的热稳定性。

专利文件1：日本专利公开号05-33997；

专利文件2：日本专利申请公开号2000-270855；

专利文件3：日本专利申请公开号07-289253；

专利文件4：日本专利申请公开号08-336386；

专利文件5：日本专利申请公开号2003-235585；

专利文件6：日本专利申请公开号2004-275063；

专利文件7：WO 2004/104203的小册子；

专利文件8：日本专利申请公开号11-155579；

专利文件9：日本专利申请公开号2003-79386；

专利文件10：日本专利申请公开号2001-95598；

专利文件11：日本专利公开号05-33997的公报；

专利文件12：日本专利申请公开号11-127895；

专利文件13：WO 97/13872的小册子；

专利文件14：日本专利申请公开号2004-275013；

非-专利文件1：Arch.Microbiol.178，344-50，2002；

非-专利文件2：Eur.J.Biochem.242，499-505，1996；

非-专利文件3：Mar.Biotechnol.6，625-32，2004；

非-专利文件4：Biosci.Biotechnol.Biochem.59，487-91，1995；

非-专利文件5：Appl.Environ.Microbiol.69，139-45，2003。

发明内容

本发明要解决的问题是克服与常规真核阿马道里酶中的热稳定性相关的缺陷和提供具有优良的热稳定性的真核阿马道里酶以用作糖尿病的临床诊断用酶或酶传感器。

由于解决前述问题的重复的广泛研究的结果，本发明人发现用特定氨基酸残基替代来自锥毛壳属的真核阿马道里酶(FPOX-CE)或者来自正青霉属的真核阿马道里酶(FPOX-EE)中的特定氨基酸残基可以解决前述问题，从而完成了本发明。

更具体而言，本发明将提供下面的发明：

(1)具有下面的特征(a)和/或(b)的真核阿马道里酶：

(a)在pH8.0和50℃热处理30分钟中等于或高于83％的残留活性；和

(b)具有与根据SEQ ID NO：1的真核阿马道里酶的氨基酸序列有等于或高于75％同源性的氨基酸序列。

(2)根据上述(1)的真核阿马道里酶，其在对应于选自下面(a)到(c)的氨基酸的位置具有一个或多个氨基酸改变或突变：

(a)在根据序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸序列中184位的甘氨酸；

(b)在根据序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸序列中272位的天冬酰胺；和

(c)在根据序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸序列中388位的组氨酸。

(3)具有下面的特征(a)和(b)的真核阿马道里酶：

(a)在50℃热处理30分钟中等于或高于83％的残留活性；和

(b)具有序列表中SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列，具有一个或几个氨基酸缺失、插入、添加和/或替代。

(4)在对应于根据序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸序列中94位的精氨酸、184位的甘氨酸、265位的苯丙氨酸、272位的天冬酰胺、302位的组氨酸或者388位的组氨酸的位置处具有一个或多个氨基酸改变或突变的真核阿马道里酶。

(5)真核阿马道里酶，其在根据序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸序列中包含选自下面(a)到(f)的一个或多个改变或突变的组合：

(a)在94位的精氨酸被赖氨酸替代；

(b)在184位的甘氨酸被天冬氨酸替代；

(c)在265位的苯丙氨酸被亮氨酸替代；

(d)在272位的天冬酰胺被天冬氨酸替代；

(e)在302位的组氨酸被精氨酸替代；和

(f)在388位的组氨酸被酪氨酸替代。

(6)真核阿马道里酶，其中在根据序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸序列中，272位的天冬酰胺被天冬氨酸替代；302位的组氨酸被精氨酸替代；且388位的组氨酸被酪氨酸替代。

(7)具有下面特征(a)和/或(b)的真核阿马道里酶：

(a)在pH8.0和50℃热处理30分钟中等于或高于50％的残留活性；和

(b)具有与根据序列表中SEQ ID NO：2的真核阿马道里酶的氨基酸序列有等于或高于75％同源性的氨基酸序列。

(8)具有下面特征(a)和(b)的真核阿马道里酶：

(a)在50℃热处理30分钟中等于或高于50％的残留活性；和

(b)具有序列表中SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，具有一个或几个氨基酸缺失、插入、添加和/或替代。

(9)在对应于根据序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列中184位的甘氨酸、272位的天冬酰胺、或者388位的组氨酸的位置处具有一个或多个氨基酸改变或突变的真核阿马道里酶。

(10)真核阿马道里酶，其在根据序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列中包含选自下面(a)到(c)的一个或多个改变或突变的组合：

(a)在184位的甘氨酸被天冬氨酸替代；

(b)在272位的天冬酰胺被天冬氨酸替代；和

(c)在388位的组氨酸被酪氨酸替代。

(11)真核阿马道里酶，其中在根据序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列中，184位的甘氨酸被天冬氨酸替代；272位的天冬酰胺被天冬氨酸替代；且388位的组氨酸被酪氨酸替代。

(12)真核阿马道里酶基因，其编码根据上述(1)到(11)任一项的氨基酸序列。

(13)重组载体，其包含根据上述(12)的真核阿马道里酶基因。

(14)宿主细胞，其包含根据上述(13)的重组载体。

(15)产生真核阿马道里酶的方法，其包括下面的步骤：

(a)培养根据上述(14)的宿主细胞；

(b)表达宿主细胞中包括的真核阿马道里酶基因；和

(c)从培养物分离真核阿马道里酶。

(16)用于测量糖基化蛋白质的试剂盒，其包含根据上述(1)到(11)任一项的真核阿马道里酶。

(17)用于测量糖基化血红蛋白的试剂盒，其包含根据上述(1)到(11)任一项的真核阿马道里酶。

(18)具有下面(a)到(f)的物理化学性质的真核阿马道里酶：

(a)功能和底物特异性：在氧存在的情况下作用于果糖基缬氨酰组氨酸并催化反应以产生α-酮醛、缬氨酰组氨酸和过氧化氢；

(b)最适pH：pH6.0到8.0；

(c)对功能有益的温度范围：20到45℃，

(d)热稳定性：在pH8.0和50℃下热处理30分钟中等于或大于83％的残留活性；

(e)稳定pH范围：pH6.0到9.0；和

(f)分子量：约52,000(SDS-PAGE)。

根据本发明，提供了具有优良的热稳定性的真核阿马道里酶和编码真核阿马道里酶的基因，并有利地将其用作糖尿病诊断用酶和测量糖尿病标记的试剂盒。

附图简述

图1是真核阿马道里酶序列比对图，包括SEQ ID NO：1中显示的氨基酸序列(第一行)和具有与该氨基酸等于或高于75％同源性的氨基酸序列。

实施本发明的最佳方式

下面详述本发明。

阿马道里酶也称作果糖基氨基酸氧化酶和果糖基胺氧化酶，指在氧存在的情况下氧化亚氨基二乙酸或者其衍生物(阿马道里化合物)以催化反应而产生水合乙醛酸或α-酮醛、氨基酸或肽和过氧化氢的酶。

阿马道里酶广泛分布于自然界并且可以通过搜索来自微生物、动物或者植物的酶得到。在微生物中，可以从例如丝状真菌、酵母或细菌得到阿马道里酶。

根据本发明的真核阿马道里酶是热稳定性优良的改变的真核阿马道里酶，其基于来自锥毛壳属的具有SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列或来自正青霉属的具有SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的真核阿马道里酶(FPOX-CE或FPOX-EE)生产。此种突变体的实例可包括例如，具有与SEQ ID NO：1或2有高同源性(例如，75％或更高，优选85％或更高，更优选95％或更高)的氨基酸序列的真核阿马道里酶，和具有SEQ IDNO：1或2的氨基酸序列的真核阿马道里酶，其中一个或几个氨基酸被改变或突变，或缺失、替代、添加和/或插入。注意到当权利要求中描述的热稳定性和/或氨基酸序列的条件被满足时，也可以基于来自另一丝状真菌或酵母如正青霉属、棘壳孢属、节菱孢属、弯孢属、新赤壳菌属、青霉属、镰孢属或曲霉属的真核阿马道里酶生产这种突变体。

常用的基因克隆方法通常用于得到编码这些真核阿马道里酶的根据本发明的基因(下文中也仅仅称作“真核阿马道里酶基因”)。例如，可以通过常规方法，如“Current Protocols in Molecular Biology”(WILEYInterscience，1989)中描述的方法从能够生产真核阿马道里酶的微生物菌体或各种细胞提取染色体DNA或mRNA。此外，可以使用mRNA作为模板合成cDNA。使用以这种方式得到的染色体DNA或cDNA可以制备染色体DNA或cDNA文库。

然后可以通过如下方法得到包括全长靶真核阿马道里酶基因的DNA：基于前述真核阿马道里酶的氨基酸序列合成合适的探针DNA并使用该探针DNA从染色体DNA或cDNA文库选择真核阿马道里酶基因，或者通过基于前述氨基酸序列生产合适的引物DNA，通过合适的聚合酶链反应(PCR)，如5’RACE方法或3’RACE方法扩增包括编码真核阿马道里酶的靶基因区段的DNA，并连接这些DNA片段。

以这种方式得到的编码真核阿马道里酶的基因的优选实例包括来自锥毛壳属的真核阿马道里酶基因的实例(专利文件5)。

这些真核阿马道里酶基因优选根据常规操作方法连接到各种载体。例如，通过使用QIAGEN(Qiagen K.K.生产)可以从重组质粒pKK223-3-CFP(专利文件5)提取和纯化编码真核阿马道里酶基因的DNA，包括编码来自锥毛壳属物种NISL9330菌株的真核阿马道里酶基因的DNA。

此外，可以用于本发明的载体不限于前述质粒，而是包括例如本领域技术人员公知的任何其他载体，如噬菌体或者黏粒。具体地，例如优选pBluescriptII SK⁺(STRATAGENE公司生产)。

取决于预期的突变形式，可以通过任何公知的方法实现真核阿马道里酶基因的突变处理。更具体地，使作为诱变剂的化学药品接触并作用于真核阿马道里酶基因或整合有该基因的重组DNA的方法、紫外线照射方法、基因工程技术、或者完全利用蛋白质工程技术的方法可被广泛使用。

用于前述突变处理的作为诱变剂的化学药品可以包括例如，羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍、亚硝酸、亚硫酸、肼、甲酸或5-溴尿嘧啶。

可被采用的用于接触/发挥功能的各种条件包括取决于将使用的药物类型的条件，并且在可以实际上在真核阿马道里酶基因中诱导所需的突变的情况中，不受到具体限制。通常，通过在20到80℃的反应温度下接触/发挥功能10分钟或更长时间，优选10到180分钟，优选在0.5到12M的前述药物浓度下，可以诱导所需的突变。也可以根据如上述的常规方法进行紫外线照射(Gendai Kagaku，pp.24-30，1989年6月出版)。

作为充分利用蛋白质工程技术的方法，一般可以使用称作位点特异性诱变的技术，并且其实例包括Kramer方法(Nucleic Acids Res.，12，9441(1984)：Methods Enzymol.，154，350(1987)：Gene，37，73(1985))，Eckstein方法(Nucleic Acids Res.，13，8749(1985)：Nucleic Acids Res.，13，8765(1985)：Nucleic Acids Res，14，9679(1986))，和Kunkel方法(Proc.Natl.Acid.Sci.U.S.A.，82，488(1985)：Methods Enzymol.，154，367(1987))。

也可以使用称作一般聚合酶链反应的技术(Technique，1，11(1989))。除了前述遗传改变方法外，通过有机合成方法或者酶的合成方法，也可以直接合成所需的经改变的真核阿马道里酶基因。

通过前述方法得到的真核阿马道里酶基因的DNA碱基序列可以通过例如使用多毛细管DNA分析系统CEQ 2000(Beckman Coulter，Inc.生产)测定或验证。

通过常规方法将如上所述得到的真核阿马道里酶基因整合到用于转化原核或真核细胞的载体如噬菌体、黏粒或者质粒中，并可以通过常规方法转化或转导对应于每种载体的宿主。例如，作为宿主，如属于埃希氏菌属(Escherichia)的微生物，将所得的重组DNA用于转化或转导到大肠杆菌(E.coli)K-12的菌株中，优选大肠杆菌JM109或大肠杆菌DH5α等等的菌株中(每种由Takara Bio Inc.生产)以得到每种菌株。

随后，例如，可以用下面的方法选择根据本发明的真核阿马道里酶的生产菌株。

首先，用灭菌的丝绒布从前述得到的转化体形成菌落的LB琼脂培养基收集几种复制物到新的琼脂培养基中，并培养所述培养基。当复制的琼脂培养基中菌落的大小足够时，将浸入溶菌剂如溶菌酶的膜置于培养基上，并将培养基在37℃下静置约1小时以实现溶菌作用。在该步骤中，膜吸附溶菌的粗酶溶液。

将吸附粗酶溶液的膜在55℃的条件下静置1小时，之后将其放置于浸入0.1M磷酸钾缓冲溶液(pH8.0)(包括果糖基缬氨酸、过氧化物酶、TOOS和4一氨基安替比林作为底物)的膜上以观察紫色着色的程度。也通过相似的方法进行改变前的真核阿马道里酶的生产菌株的着色试验以通过比较生产菌株选择靶转化体。

以这种方式，可以得到能够生产具有优良的热稳定性的根据本发明的真核阿马道里酶的转化体。

此外，如果需要，在热稳定性方面更优良的经改变的真核阿马道里酶和能够生产该真核阿马道里酶的转化体也可以如下得到：通过上述改变方法，使用能够生产具有热稳定性的真核阿马道里酶的转化体向经改变的真核阿马道里酶基因中进一步反复引入突变。

以这种方式得到的生产热稳定性优良的真核阿马道里酶的转化体的实例包括大肠杆菌JM109菌株(pKK223-3-CFP-T7)，其生产的真核阿马道里酶在pH8.0和50℃热处理30分钟的百分比残留活性为83％或更多，优选90％或更多，更优选95％或更多。作为实例所述的包括编码根据本发明的真核阿马道里酶的基因的质粒pKK223-3-CFP-T7在2006年3月31日被保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(Independent Administrative Agency，National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology，International Patent OrganismDepository)(Central 6，1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本)并被给予保藏号FERM BP-10593。

可以通过程序如GENETYX-Mac(Software Development Co.，Ltd.生产)的最大匹配或搜索同源性，或程序如DNASIS Pro(Hitachi SoftwareEngineering Co.，Ltd.生产)的最大匹配或多重比对，可以计算氨基酸序列的同源性。

通过使用公知的算法如Lipman-Pearson方法比较氨基酸序列以对存在于每种真核阿马道里酶的氨基酸序列中的保守氨基酸残基分配最大同源性，也可以进行鉴定“对应于氨基酸的位置”的方法。不管氨基酸序列中氨基酸残基的插入或缺失，通过用这种方法比对真核阿马道里酶的氨基酸序列，可以确定每种真核阿马道里酶序列中同源氨基酸残基的位置。可以想象，同源氨基酸残基位于三维结构中的相同位置，并且可以估计靶真核阿马道里酶在特异性功能方面具有相似的作用。

如本文所用的，“对应于根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列中184位的甘氨酸的位置”指当所鉴定的真核阿马道里酶的氨基酸序列与SEQ IDNO：1中所示的来自锥毛壳属的真核阿马道里酶的氨基酸序列比较时，对应于SEQ ID NO：1的真核阿马道里酶中184位甘氨酸的氨基酸。从而，参考图1可以鉴定所述氨基酸，其中通过前述鉴定“对应位置的氨基酸残基”的方法比对氨基酸序列。

更具体地，所述氨基酸对应于来自正青霉属的真核阿马道里酶的184位的甘氨酸、来自棘壳孢属的真核阿马道里酶的184位的甘氨酸、来自节菱孢属的真核阿马道里酶的184位的甘氨酸、来自新赤壳菌属的真核阿马道里酶的184位的甘氨酸、来自青霉属的真核阿马道里酶的184位的丝氨酸或来自曲霉属的真核阿马道里酶的183位的甘氨酸。

“对应于根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列中272位的天冬酰胺的位置”指当所鉴定的真核阿马道里酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：1中所示的来自锥毛壳属的真核阿马道里酶的氨基酸序列比较时，对应于根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列中272位天冬酰胺的氨基酸。参考图1也可以鉴定所述氨基酸，其中通过前述方法比对氨基酸序列。

更具体地，所述氨基酸对应于来自正青霉属的真核阿马道里酶的272位的天冬酰胺、来自棘壳孢属的真核阿马道里酶的270位的天冬酰胺、来自节菱孢属的真核阿马道里酶的272位的天冬酰胺、来自新赤壳菌属的真核阿马道里酶的272位的天冬酰胺、来自青霉属的真核阿马道里酶的272位的天冬酰胺、或来自曲霉属的真核阿马道里酶的272位的天冬酰胺。

此外，“对应于根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列中388位的组氨酸的位置”指当所鉴定的真核阿马道里酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：1中所示的来自锥毛壳属的真核阿马道里酶的氨基酸序列比较时，对应于根据SEQ ID NO：1的真核阿马道里酶中388位组氨酸的氨基酸。参考图1也可以鉴定所述氨基酸，其中通过前述方法比对氨基酸序列。

更具体地，所述氨基酸对应于来自正青霉属的真核阿马道里酶的388位的组氨酸、来自棘壳孢属的真核阿马道里酶的386位的组氨酸、来自节菱孢属的真核阿马道里酶的389位的组氨酸、来自新赤壳菌属的真核阿马道里酶的388位的组氨酸、来自青霉属的真核阿马道里酶的388位的组氨酸、或来自曲霉属的真核阿马道里酶的388位的组氨酸。

为了使用如上所述得到的能够生产热稳定性优良的真核阿马道里酶的菌株生产真核阿马道里酶，可以通过常规的固体培养方法，优选可能时采用液体培养方法培养所述菌株。

此外，用于培养前述菌株的培养基包括例如，这样的培养基，其中将一种或多种无机盐，如氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化镁、氯化铁、硫酸铁和硫酸三价锰加入一种或多种氮源，如酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、肉膏、玉米浆和大豆或麸皮的浸提液中，且此外，如果需要，适当向其中加入糖精材料和维生素等等。

注意到合适的是调节培养基的最初pH到pH7到9。

此外，通过通气旋转浸没培养、振荡培养或静置培养，优选在20到42℃的培养温度下培养，优选在约37℃的培养温度下培养4到24小时，更优选在约37℃的培养温度下培养4到8小时。

培养结束后，用常用的酶收集手段从培养物收集真核阿马道里酶。例如，可以通过常规方法将菌体进行例如超声分解处理或者研磨处理；可以用水解酶如溶菌酶提取该酶；或可以在甲苯存在下在摇动或静置的条件下实现溶菌作用以将该酶从菌体排出到外部。然后将该溶液过滤或离心以除去固体内容物，并如果需要，用硫酸链霉素、硫酸鱼精蛋白或硫酸锰等等进行核酸的去除，接着向溶液中加入硫酸铵、醇或丙酮以分级分离该溶液并收集沉淀以得到真核阿马道里酶的粗酶。

为了从前述真核阿马道里酶的粗酶进一步得到真核阿马道里酶纯化的酶制剂，可以通过适当地选自如下的方法得到纯化的真核阿马道里酶酶制剂：凝胶过滤方法，其使用Sephadex，Ultrogel，Bio-Gel，等等；使用离子交换剂的吸附-洗脱方法；使用聚丙烯酰胺凝胶等的电泳方法；使用羟基磷灰石的吸附-洗脱方法；沉降方法，如蔗糖密度梯度离心；亲和层析方法；和使用分子筛膜、中空纤维膜等等的分级分离方法；或这些方法的组合。以这种方式，可以得到热稳定性优良的所需的真核阿马道里酶。

如本文所用，“热稳定性优良的”也指在根据下面所述的活性测量方法和热稳定性测量方法的反应条件下，相对于热处理前的活性，在pH8.0和50℃下热处理SEQ ID NO：1的真核阿马道里酶30分钟后，百分比残留活性为83％或更高，优选90％或更高，更优选95％或更高，并且指相对于热处理前的活性，在pH8.0和50℃下热处理SEQ ID NO：2的真核阿马道里酶30分钟后，百分比残留活性为50％或更高，优选70％或更高。热稳定性优良的真核阿马道里酶显著改善了保持含有所述酶的产品的质量并且因此在工业上是极其有益的。

注意到热稳定性优良的真核阿马道里酶自身具有高度稳定的蛋白质结构，且从而对蛋白酶的抗性得到提高。

当用蛋白酶、接着通过阿马道里酶功能进行HbAlc的分解用于通过阿马道里酶测量HbAlc时，使用对蛋白酶具有高度抗性的阿马道里酶是极其有价值的。这是因为在该测量系统中，蛋白酶不仅影响HbAlc而且影响阿马道里酶以不利地影响HbAlc的测量值。使用对蛋白酶具有抗性的阿马道里酶防止了蛋白酶对阿马道里酶的分解，消除了对分离操作的需要，且使得能够更准确地测量。也使得能够以高浓度进行蛋白酶处理(其在以前是不可能的)以提高测量值的精度。蛋白酶反应时间也可以被缩短以导致HbAlc的快速测量。

如本文所用，“对蛋白酶具有抗性”也指相对于蛋白酶处理前的活性，在pH8.0和37℃下用50mU蛋白酶处理30分钟后，真核阿马道里酶的百分比残留活性为40％或更多，优选60％或更多，更优选80％或更多。例如，在测量对蛋白酶的抗性的方法中，可以通过用0.1M磷酸盐缓冲液(pH8.0)稀释阿马道里酶酶溶液或者粗酶溶液从而使得阿马道里酶活性为约0.05U/ml，向每个样品中加入50mU中性蛋白酶(RocheCorp.生产)，之后在37℃加温样品30分钟，测量中性蛋白酶处理之前和之后样品中包括的酶的活性，并测定百分比剩余活性，来评估对蛋白酶的抗性。

作为测量真核阿马道里酶活性的方法、测量底物亲和力的方法、和测量热稳定性的方法，可以使用各种方法。例如，如本文所用的测量真核阿马道里酶活性的方法和测量热稳定性的方法在下文描述。

(测量真核阿马道里酶活性的方法)

测量根据本发明的真核阿马道里酶的酶活性的方法包括测量酶反应产生的过氧化氢的量的方法和测量酶反应中消耗的氧的量的方法作为主要测量方法。作为实例，在下面给出测量过氧化氢的量的方法。

为了测量根据本发明的真核阿马道里酶的活性，除非另外指出，将果糖基缬氨酸用作底物。注意到对于酶滴度，将当用果糖基缬氨酸作为底物测量时，每分钟产生1μmol过氧化氢的酶水平定义为1U。

根据Sakagami等人的方法(见日本专利申请公开号2001-95598)合成和纯化糖基化的氨基酸如果糖基缬氨酸和糖基化的肽如果糖基缬氨酰组氨酸。

A.试剂的制备

(1)试剂1：POD-4-AA溶液

1.在0.1M磷酸钾缓冲溶液(pH8.0)中，将0kU过氧化物酶(Kikkoman Corporation生产)和100mg 4-氨基安替比林(TokyoChemical Industry Co.，Ltd.生产)溶解以定量测定溶液至1L。

(2)试剂2：TOOS溶液

在离子交换水中，溶解500mg TOOS(Dojindo Laboratories生产)以定量测定溶液至100ml。

(3)试剂3：底物溶液(150mM；终浓度5mM)

在离子交换水中，溶解417mg果糖基缬氨酸以定量测定溶液至10ml。

B.测量方法

将2.7ml试剂1、1,100μl试剂2和100μl酶溶液混合以在37℃初步加温混合物5分钟。随后，加入100μl试剂3以充分混合混合物，接着通过分光光度计(U-2000A，Hitachi Ltd.生产)测量其在555nm的吸光度。测量值是基于555nm下从1到3分钟每分钟吸光度的变化的。通过相同方法制备对照溶液，只是加入100μl离子交换水代替100μl试剂3。使用预先制备的过氧化氢标准溶液代替试剂3和离子交换水代替酶溶液制作曲线图，其中检查了与所产生的着色物质的量的关联。使用该曲线图计算在37℃下每分钟产生的过氧化氢的微摩尔数，并且酶溶液中活性单位是基于计算的值的。

(测量热稳定性的方法)

用包括10％木糖醇的0.1M磷酸盐缓冲液(pH8.0)稀释真核阿马道里酶粗酶溶液或者真核阿马道里酶纯化制剂以便为约0.1U/ml，并将经稀释的溶液在50℃加温30分钟。测量加热之前和之后样品的酶活性以测定剩余(酶)活性(％)来评估稳定性。

本发明参考实施例在下文进一步具体描述，但是本发明的技术范围根本不受到这些实施例的限制。

实施例1

(1)重组质粒pKK223-3-CFP DNA的制备

将具有锥毛壳属的真核阿马道里酶(SEQ ID NO：1)基因的重组质粒的大肠杆菌JM109(pKK223-3-CFP)菌株(专利文件5，FERMBP-8132，2002年8月1日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(Chuou 6，1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本))接种在100ml LB-amp培养基[1％(W/V)细菌用胰蛋白胨(Bactotrypton)，0.5％(W/V)蛋白胨，0.5％(W/V)NaCl，50μg/ml氨苄青霉素]中并在37℃振荡培养培养基20小时以得到培养物。

通过以7,000rpm离心培养物5分钟进行收获以得到菌体。使用QIAGEN tip-100(Qiagen K.K.生产)从菌体提取和纯化重组质粒pKK223-3-CFP以得到100μg重组质粒pKK223-3-CFP DNA。

实施例2

(2)重组质粒pKK223-3-CFP DNA的改变操作

使用100μg前述重组质粒pKK223-3-CFP DNA的20μg，根据D.M.Morrison的方法(Method in Enzymology，68，326-331，1979)转化XL1-RED(Stratagene Ltd.生产)(易于引起质粒的复制错误和生长的改变)以得到约5,000转化体。

为了从所有菌落收集质粒DNA，向琼脂培养基加入QIAGEN sol I(Qiagen K.K.生产)，通过涂布器用QIAGEN sol I将菌落刮取在一起，用自动移液器(Pipetman)收集溶液，且之后通过常规的质粒收集方法得到进行改变操作的100μg重组质粒pKK223-3-CFP DNA。使用20μg前述改变的重组质粒pKK223-3-CFP DNA，根据D.M.Morrison的方法(Method in Enzymology，68，326-331，1979)转化大肠杆菌JM109的菌株以得到具有改变的质粒的约1,000个转化体。

实施例3

(3)搜索热稳定性优良的真核阿马道里酶

首先，使用丝绒布将所有前述得到的转化体在新的LB-amp琼脂培养基上复制。将复制平板上的菌落转移到Hybond-N⁺(AmershamCorporation生产)，并将该Hybond-N⁺浸入10mg/ml溶菌酶溶液(SigmaCo.生产)中。当在48℃处理该Hybond-N⁺1小时且之后浸入0.1M磷酸钾缓冲溶液(pH8.0)中时，该缓冲溶液包括2mM果糖基缬氨酸、1mg/ml过氧化物酶(Kikkoman Corporation生产)、1mg/ml4-氨基安替比林(Tokyo Chemical Industry Co.，Ltd.生产)和10mg/ml TOOS(DojindoLaboratories生产)，观察到显示出强烈着色的一些菌株。

在主平板上选择对应于强烈着色的菌落，并通过在2ml LB-amp培养基中液体培养生产质粒编码的经改变的真核阿马道里酶。

培养后，将每种所得的菌体用0.1M磷酸钾缓冲液(pH8.0)洗涤，超声破裂，并在15,000rpm离心10分钟以制备1.5ml每种粗酶溶液。将溶液超声破裂并在12,000rpm离心5分钟，且然后收集上清液。使用粗酶溶液，根据前述测量热稳定性的方法(测量热稳定性的方法)计算剩余活性(％)(处理后活性/处理前活性)。

可以通过相似的培养、提取和热处理得到两种改变的真核阿马道里酶和生产其的大肠杆菌，经过测量活性，所述两种改变的真核阿马道里酶与改变前真核阿马道里酶的百分比残留活性相比较，百分比残留活性得到提高。

将两种得到的菌株在37℃下在2ml LB-amp培养基中振荡培养18小时，并使用GFX微量质粒制备试剂盒(GFX Micro Plasmid Prep Kit)(Amersham Corporation生产)从培养基分离质粒。将质粒分别命名为pKK223-3-CFP-T1和pKK223-3-CFP-T2，并使用多毛细管DNA分析系统CEQ 2000(Beckman Coulter，Inc.生产)测定每种质粒中真核阿马道里酶的DNA碱基序列。

结果，发现导入了这样的突变，其中根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列中302位的组氨酸被pKK223-3-CFP-T1中的精氨酸替代并且根据SEQID NO：1的氨基酸序列中388位的组氨酸被pKK223-3-CFP-T2中的酪氨酸替代。

实施例4

(4)双重突变体pKK223-3-CFP-T3的产生

将重组质粒pKK223-3-CFP-T1和pKK223-3-CFP-T2用限制酶AatII和SacI双重消化。通过琼脂糖凝胶电泳，分别从前述pKK223-3-CFP-T1DNA和pKK223-3-CFP-T2 DNA发出约1kb DNA片段和约5kb DNA片段，并通过常规方法纯化。此外，使用T4DNA连接酶连接两个DNA片段，并将大肠杆菌JM109的菌株转化以得到重组质粒pKK223-3-CFP-T3。

将以这种方式得到的具有每种重组质粒的大肠杆菌JM109(pKK223-3-CFP-T1)、大肠杆菌JM109(pKK223-3-CFP-T2)和大肠杆菌JM109(PKK223-3-CFP-T3)菌株在LB-amp培养基中于37℃下培养20小时。随后，用pH8.0的0.1M磷酸钾缓冲溶液洗涤菌体，超声破裂，并以15,000rpm离心10分钟以制备1.5ml每种粗酶溶液。

对于以这种方式制备的酶溶液，通过前述方法(测量热稳定性的方法)测量剩余的阿马道里酶的酶活性。结果在表1中显示。

在表1中，pKK223-3-CFP代表来自大肠杆菌JM109(pKK223-3-CFP)菌株的野生型真核阿马道里酶，且其他三种酶代表本发明的真核阿马道里酶。如从该表1显而易见的，发现本发明中得到的真核阿马道里酶具有优良的热稳定性。

表1

实施例5

(5)改变的积累

通过如上述(1)所述的方法，从作为上述(4)中得到的改变的真核阿马道里酶生产菌株的大肠杆菌JM109(pKK223-3-CFP-T3)菌株制备质粒DNA。此外，通过前述(2)的方法引入突变，并随后将前述(3)的方法用于进行选择，其中将以前得到的经改变的真核阿马道里酶作为该实施例5中的比较对照。得到产生真核阿马道里酶的大肠杆菌的四种菌株，它们在pH8.0和50℃下热处理30分钟中具有高的百分比剩余活性并且被进一步改变。用以这种方式所得的四种大肠杆菌菌株在2mlLB-amp培养基中于37℃下进行振荡培养18小时。

使用GFX微量质粒制备试剂盒(GFX Micro Plasmid Prep Kit)(Amersham Corporation生产)从培养基分离质粒。将质粒分别命名为pKK223-3-CFP-T4、pKK223-3-CFP-T5、pKK223-3-CFP-T6和pKK223-3-CFP-T7，并使用多毛细管DNA分析系统CEQ 2000(BeckmanCoulter，Inc.生产)测定每种质粒中编码真核阿马道里酶的DNA碱基序列。

结果，除了其中302位的组氨酸被精氨酸替代和388位的组氨酸被酪氨酸替代的突变外，还发现引入了这样的突变，其中pKK223-3-CFP-T4中94位的精氨酸被赖氨酸替代，pKK223-3-CFP-T5中184位的甘氨酸被天冬氨酸替代，pKK223-3-CFP-T6中265位的苯丙氨酸被亮氨酸替代，且pKK223-3-CFP-T7中272位的天冬酰胺被天冬氨酸替代。

在LB-amp培养基中于37℃下培养具有以这种方式得到的重组质粒的大肠杆菌JM109(pKK223-3-CFP-T4)、大肠杆菌JM109(pKK223-3-CFP-T5)、大肠杆菌JM109(pKK223-3-CFP-T6)和大肠杆菌JM109(PKK223-3-CFP-T7)菌株20小时，并用0.1M磷酸钾缓冲溶液(pH8.0)洗涤每种菌体，之后超声破裂，并在15,000rpm下离心10分钟以制备1.5ml每种粗酶溶液。

对于以这种方式制备的酶溶液，通过前述方法(测量热稳定性的方法)测量剩余的酶活性。结果在表2中显示。

在表2中，pKK223-3-CFP代表来自改变前的大肠杆菌JM109(pKK223-3-CFP)菌株的真核阿马道里酶，且其他五种酶代表本发明的真核阿马道里酶。如从该表2显而易见的，发现在本发明中得到的真核阿马道里酶的具有的活性甚至在pH8.0和50℃热处理30分钟也几乎没有丧失并且具有优良的热稳定性。

表2

实施例6

(6)本发明真核阿马道里酶的生产和纯化

将如上所述得到的生产本发明的真核阿马道里酶的转化体大肠杆菌JM109(pKK223-3-CFP-T7)接种到10L LB-amp培养基中，并在30℃的培养温度下在1L/分钟的气流速度和600rpm的搅拌速度条件下使用小型发酵罐旋动培养24小时。

通过以7,000rpm离心10L所得的培养基10分钟进行真菌的收获，并将真菌悬浮在500ml缓冲液A(10mM磷酸缓冲液，1mM EDTA，5％甘油，0.5mM PMSF，pH8)且之后通过弗氏压碎器压碎。

将压碎液在9,000rpm离心15分钟，并向上清液逐渐加入硫酸铵以便至40％饱和以沉淀过剩的蛋白质。将液体在4℃过夜放置，且之后离心(9,000rpm，4℃，15分钟)以收集上清液。

此外，将硫酸铵逐渐加入上清液以便至60％饱和以沉淀靶蛋白。将液体在4℃过夜放置且之后离心(9,000rpm，4℃，15分钟)以收集沉淀。向该沉淀中加入10ml缓冲液B(10mM磷酸缓冲液，1mM EDTA，5％甘油，0.2M NaCl，pH8)并溶解，通过PD-10(Amersham Corporation生产)替代缓冲液，并然后将溶液应用到事先用缓冲液B平衡的UltrogelAcA34柱(2.8cm x 85cm)(IBF Bio-techniques生产)。随后，用1L缓冲液B洗脱沉淀以收集活性级分。

通过Centriprep-10(Amicon生产)进行所得活性级分的浓缩，接着通过将缓冲液A应用于Q-Sepharose FF的柱(1.0cm x 8cm)(AmershamCorporation生产)置换该缓冲液。通过用缓冲液C(10mM磷酸缓冲液，1mM EDTA，5％甘油，pH8)到缓冲液D(10mM磷酸缓冲液，1mMEDTA，5％甘油，0.5M NaCl，pH8)的线性梯度实现洗脱。用SDS-PAGE分析所得的活性级分以观察到单个带(分子量约52,000)。

检查发现以这种方式得到的酶的包括最适pH和底物特异性的性质与改变前酶的那些性质相似。即，发现本发明的真核阿马道里酶的性质(排除热稳定性)与改变前所述酶的那些性质相似。

实施例7

(7)生产编码真核阿马道里酶的重组质粒

使用SEQ ID NOS：3和4的磷酸化引物，Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio Inc.生产)，用来自正青霉属的真核阿马道里酶(SEQ ID NO：2)基因的重组质粒(puc-EFP)(专利文件5，FERM BP-8131)的DNA作为模板在下述条件下进行PCR反应。

即，加入10μl 10x Pyrobest缓冲溶液(Takara Bio Inc.生产)，8μldNTP混合溶液(调节为每种dNTP为2.5mM)，作为模板的350ngpuc-EFP质粒DNA，100pmol每种前述引物，和1μl Pyrobest DNA聚合酶，从而使得总体积为100μl。用热循环仪(Eppendorf Co.生产)重复30个循环的：<94℃，20秒-60℃，60秒-72℃，120秒>。

在1.0％琼脂糖凝胶上将反应液的部分电泳以证实约1,300bp DNA被特异扩增。

将通过PCR扩增的来自正青霉属的真核阿马道里酶基因连接到用限制酶HpaI切割的pUTE100K′载体(日本专利申请公开号06-292584)，并转化大肠杆菌JM109的菌株以得到重组质粒pUTE100K′-EFP。

将具有重组质粒pUTE100K′-EFP的大肠杆菌JM109(pUTE100K′-EFP)菌株在LB-amp培养基中于37℃的培养温度下振荡培养20小时以得到培养物。洗涤所得的培养菌体并之后超声破裂以证实来自正青霉属的真核阿马道里酶活性的表达。

因此，将大肠杆菌JM109(pUTE100K′-EFP)菌株接种到100mlLB-amp培养基中并在37℃的培养温度下振荡培养20小时以得到培养物。通过以7,000rpm离心培养物5分钟进行真菌的收获以得到菌体。

使用QIAGEN tip-100(Qiagen K.K.生产)，从菌体提取和纯化重组质粒pUTE100K′-EFP以得到100μl重组质粒pUTE100K′-EFP DNA。

实施例8

(8)位点特异性改变操作

决定引入其中根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列中184位的甘氨酸被天冬氨酸替代的突变、其中272位天冬酰胺被天冬氨酸替代的突变和其中388位组氨酸被酪氨酸替代的突变。

首先，为了引入其中根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列中184位的甘氨酸被天冬氨酸替代的突变，通过常规方法合成包括SEQ ID NOS：5和6的DNA序列的引物。然后在与前述(7)相同的条件下用SEQ ID NOS：5和6的引物，Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio Inc.生产)，使用前述(7)中得到的重组质粒pUTE100K′-EFP的DNA作为模板进行PCR反应。

用1.0％琼脂糖凝胶分析部分反应液以证实约6,000bp DNA被特异扩增。通过限制酶DpnI处理切割剩余模板后，用限制酶KpnI处理以这种方式得到的DNA。将用DpnI和KpnI处理的DNA在1.0％琼脂糖凝胶上电泳，并通过常规方法从凝胶提取DNA以收集DNA片段。

使用连接酶连接以这种方式得到的前述DNA片段，并转化大肠杆菌JM109菌株以得到重组质粒pUTE100K′-EFP-T1。

随后，为了引入其中根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列(FPOX-EE)中272位天冬酰胺被天冬氨酸替代的突变，在与前述(7)相同的条件下用SEQ ID NOS：7和8的引物，Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio Inc.生产)，使用质粒pUTE100K′-EFP DNAs作为模板进行PCR反应。将扩增的约6,000bp DNA用限制酶DpnI和NspV处理，通过常规方法纯化，之后连接，并转化大肠杆菌JM109菌株以得到重组质粒pUTE100K′-EFP-T2。

随后，为了引入其中根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列(FPOX-EE)中388位组氨酸被酪氨酸替代的突变，在与前述(7)相同的条件下用SEQ ID NOS：9和10的引物，Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio Inc.生产)，使用质粒pUTE100K′-EFP DNAs作为模板进行PCR反应。将扩增的约6,000bp DNA片段用限制酶DpnI和SnaBI处理，通过常规方法纯化DNA片段，并使用连接酶连接，并转化大肠杆菌JM109菌株以得到重组质粒pUTE100K′-EFP-T3。

此外，使用质粒pUTE100K′-EFP-T2DNA作为模板引入其中根据上述SEQ ID NO：2的氨基酸序列中388位组氨酸被酪氨酸替代的突变，以得到质粒pUTE100K′-EFP-T4，并随后使用质粒pUTE100K′-EFP-T4作为模板引入其中根据上述SEQ ID NO：2的氨基酸序列中184位甘氨酸被天冬氨酸替代的突变，以得到质粒pUTE100K′-EFP-T5。

SEQ ID NO：5      5′GCTGGTACCTTTCAGCAACCTCTGTTCG      3′(正向引物)

SEQ ID NO：6      5′AAAGGTACCAGCATCTCCAAAGCCAAACTTG   3′(反向引物)

(用于引入G184D。下划线部分代表限制酶KpnI的识别序列。)

SEQ ID NO：7      5′TCTTTTTCGAACCCGACGAGTATGGGGTG     3′(正向引物)

SEQ ID NO：8      5′TCGGGTTCGAAAAAGAACCCATATTCACC     3′(反向引物)

(用于引入N272D。下划线部分代表限制酶NspV的识别序列。)

SEQ ID NO：9      5′ACATCGGGAAATACGTAGTTGAGCTTTTAG    3′(正向引物)

SEQ ID NO：10     5′CTAAAAGCTCAACTACGTATTTCCCGATGT    3′(反向引物)

(用于引入H388Y。下划线部分代表限制酶SnaBI的识别序列。)

使用多毛细管DNA分析系统CEQ 2000(Beckman Coulter，Inc.生产)测定每种质粒中编码真核阿马道里酶的DNA碱基序列。

结果，证实引入了如下突变：其中质粒pUTE100K′-EFP-T1中根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列中184位的甘氨酸被天冬氨酸替代、质粒pUTE100K′-EFP-T2中根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列中272位的天冬酰胺被天冬氨酸替代、质粒pUTE100K′-EFP-T3中根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列中388位的组氨酸被酪氨酸替代、和质粒pUTE100K′-EFP-T4中根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列中272位的天冬酰胺被天冬氨酸替代和388位的组氨酸被酪氨酸替代，和如下突变：其中质粒pUTE100K′-EFP-T5中根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列中184位的甘氨酸被天冬氨酸替代、272位的天冬酰胺被天冬氨酸替代、和388位的组氨酸被酪氨酸替代。

将以这种方式得到的具有前述重组质粒的大肠杆菌JM109(pUTE100K’-EFP-T1)、大肠杆菌JM109(pUTE100K’-EFP-T2)、大肠杆菌JM109(pUTE100K’-EFP-T3)、大肠杆菌JM109(pUTE100K’-EFP-T4)和大肠杆菌JM109(pUTE100K’-EFP-T5)菌株在LB-amp培养基中于37℃的培养温度下培养20小时。用0.1M磷酸钾缓冲液(pH8.0)洗涤每种得到的菌体，之后超声破裂，且在15,000rpm下离心10分钟以制备1.5ml每种粗酶溶液。

对于以这种方式制备的酶溶液，通过前述方法(测量热稳定性的方法)测量剩余的阿马道里酶的酶活性。结果在表3中显示。

如表3所示，大肠杆菌JM109(pUTE100K′-EFP)菌株产生的改变前的真核阿马道里酶在pH8.0和50℃热处理30分钟中剩余的酶活性为热处理前活性的2.8％。

相比之下，大肠杆菌JM109(pUTE109K′-EFP-T1)和大肠杆菌JM109(pUTE100K′-EFP-T2)菌株生产的改变后的真核阿马道里酶在pH8.0和50℃热处理30分钟中剩余的酶活性与改变前的真核阿马道里酶相比分别增加到7.4％和11.9％。大肠杆菌JM109(pUTE109K′-EFP-T3)、大肠杆菌JM109(pUTE100K′-EFP-T4)和大肠杆菌JM109(pUTE109K′-EFP-T5)菌株生产的改变后的真核阿马道里酶在pH8.0和50℃热处理30分钟中剩余的酶活性与改变前的真核阿马道里酶相比分别增加到49.7％、54.8％和78.9％。

发现本发明中得到的真核阿马道里酶具有优良的热稳定性。

表3

实施例9

(9)改变的积累(四重突变体的产生)

pKK223-3-CFP-T7包括如下突变：根据SEQ ID NO：1的真核阿马道里酶的氨基酸序列中272位的天冬酰胺被天冬氨酸替代、302位的组氨酸被精氨酸替代、且388位的组氨酸被酪氨酸替代。决定向pKK223-3-CFP-T7中加入如下突变最终制备六重突变体：94位的精氨酸被赖氨酸替代、184位的甘氨酸被天冬氨酸替代和265位的苯丙氨酸被亮氨酸替代。

首先，为了引入突变F265L，通过常规方法合成包括SEQ ID NOS：11和12的DNA序列的引物。然后在与前述(7)相同的条件下，使用SEQID NOS：11和12的引物，Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio Inc.生产)，用前述(5)中得到的重组质粒pKK223-3-CFP-T7作为模板进行PCR反应。

SEQ ID NO：11       5′TTCTTCGAACCTGATGAGTTTGGTGTAATAAAG3′(正向引物)

SEQ ID NO：12       5′AGGTTCGAAGAAGAAGCCAAGTTCGCC     3′(反向引物)

(用于引入265L。加下划线的部分代表NspV的识别序列。)

用1.0％琼脂糖凝胶分析部分反应液体以证实特异扩增了约6kbpDNA。通过DpnI处理切割剩余的模板后，用NspV处理以这种方式得到的DNA。将用DpnI和NspV处理的DNA在1.0％琼脂糖上电泳，并通过常规方法从凝胶提取和收集DNA。连接以这种方式得到的DNA，并转化大肠杆菌JM109以得到重组质粒pKK223-3-CFP-T8。此外，作为使用多毛细管DNA分析系统CEQ 2000(Beckman Coulter，Inc.生产)测定pKK223-3-CFP-T8质粒中编码真核阿马道里酶的DNA的碱基序列的结果，发现引入了对应于F265L、N272D、H302R和H388Y的每个替代的突变。

改变的积累(五重突变体的产生)

用限制酶KpnI和SnaBI双重消化重组质粒pKK223-3-CFP-T8和pKK223-3-CFP-T5。通过琼脂糖凝胶电泳，分别从pKK223-3-CFP-T8DNA和pKK223-3-CFP-T5 DNA发出约500bp DNA片段和约5.5kbDNA片段，将其通过常规方法纯化，且之后用T4 DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌JM109以得到重组质粒pKK223-3-CFP-T9。

此外，作为使用多毛细管DNA分析系统CEQ 2000(Beckman Coulter，Inc.生产)测定pKK223-3-CFP-T9质粒中编码真核阿马道里酶的DNA的碱基序列的结果，发现引入了对应于G184D、F265L、N272D、H302R和H388Y的每个替代的突变。

改变的积累(六重突变体的产生)

用限制酶BglII消化重组质粒pKK223-3-CFP-T9和pKK223-3-CFP-T4。通过琼脂糖凝胶电泳，分别从pKK223-3-CFP-T9DNA和pKK223-3-CFP-T4 DNA发出约900bp DNA片段和约5.0kbDNA片段，将其通过常规方法纯化，且之后用T4DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌JM109以得到重组质粒pKK223-3-CFP-T10。此外，作为使用多毛细管DNA分析系统CEQ2000(Beckman Coulter，Inc.生产)测定pKK223-3-CFP-T10质粒中编码真核阿马道里酶的DNA的碱基序列的结果，发现引入了对应于R94K、G184D、F265L、N272D、H302R和H388Y的每个替代的突变。

以这种方式生产的质粒pKK223-3-CFP-T10在2007年3月16日被保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(Central6，1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本)并被给予保藏号FERM BP-10800。

将具有以这种方式得到的重组质粒的大肠杆菌菌株JM109(pKK223-3-CFP-T7)、JM109(pKK223-3-CFP-T8)、JM109(PKK223-3-CFP-T9)和JM109(pKK223-3-CFP-T10)以及JM109(PKK223-3-CFP)在LB-amp培养基中于37℃下培养20小时。用0.1M磷酸钾缓冲溶液(pH8.0)洗涤每种菌体，之后超声破裂，并以15,000rpm离心10分钟以制备1.5ml每种粗酶溶液。

对于以这种方式制备的酶溶液，通过前述方法(测量热稳定性的方法)测量剩余的酶活性。结果在表4中显示。在表4中，JM109(pKK223-3-CFP)代表改变前的真核阿马道里酶，且JM109(pKK223-3-CFP-T7)、JM109(pKK223-3-CFP-T8)、JM109(pKK223-3-CFP-T9)和JM109(pKK223-3-CFP-T10)的酶代表本发明的真核阿马道里酶。如从该表4显而易见的，发现本发明中得到的真核阿马道里酶具有的活性甚至在pH8.0和50℃下热处理30分钟也几乎没有丧失并且具有优良的热稳定性。

表4

实施例10

(10)蛋白酶抗性的证实

将具有直到实施例9中所得的重组质粒的大肠杆菌菌株JM109(pKK223-3-CFP-T7)和JM109(pKK223-3-CFP-T10)以及JM109(PKK223-3-CFP)在LB-amp培养基中37℃下培养20小时。用0.1M磷酸钾缓冲溶液(pH8.0)洗涤每种菌体，之后超声破裂，并以15,000rpm离心10分钟以制备1.5ml的每种粗酶溶液。

用0.1M磷酸盐缓冲液(pH8.0)稀释粗酶溶液从而使得阿马道里酶活性为约0.05U/ml，向每个样品加入50mU中性蛋白酶(Roche Corp.生产)，且然后在37℃加温样品30分钟。对于每个样品，通过测量蛋白酶处理之前和之后样品中包括的酶的活性并确定百分比剩余活性来评估蛋白酶抗性。结果在表5中显示。在表5中，JM109(pKK223-3-CFP)代表改变前的真核阿马道里酶，且JM109(pKK223-3-CFP-T7)和JM109(pKK223-3-CFP-T10)的酶代表本发明的真核阿马道里酶。如从该表5显而易见的，发现本发明中得到的真核阿马道里酶对蛋白酶的抗性显著提高并且具有优良的热稳定性。

表5

序列表

<110>Hirokawa，Kozo；Ichiyanagi，Atsushi；Kikkoman Corporation

<120>具有优良的热稳定性的真核阿马道里酶、真核阿马道里酶的基因和重组DNA，和生产

     具有优良的热稳定性的真核阿马道里酶的方法

<130>PCT-AB07016

<150>JP 2006-120363

<151>2006-04-25

<160>10

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>437

<212>PRT

<213>锥毛壳属物种(Coniochaeta sp.)

<400>1

<210>2

<211>437

<212>PRT

<213>Eupenicillium terrenum

<400>2

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物3

<400>3

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物4

<400>4

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>G184D 引物5

<400>5

<210>6

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>G184D 引物6

<400>6

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>N272D 引物7

<400>7

<210>8

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>N272D 引物8

<400>8

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>H388Y 引物9

<400>9

<210>10

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>H388Y 引物10

<400>10