百日咳毒素

摘要： 目的讨论κ-阿片肽受体(kappa-opioid receptor,κ-OR)激活后通过细胞外信号调节激酶通路对内皮素-1(vascular endothelin-1,ET-1)诱导的心肌细胞肥大的抑制作用。方法体外原代培养大鼠乳鼠心肌细胞,ET-110 nmol·L^(-1)诱导心肌细胞肥大,观察κ-OR激动剂(U50488H)1μmol·L^(-1)对心肌细胞的作用,并探讨细胞外信号调节激酶1/2特异性抑制剂(U0126)1μmol·L^(-1)、蛋白激酶C(PKC)抑制剂Ro-31-8220(50 nmol·L^(-1))、百日咳毒素(pertussis toxin,PTX)5 mg·L^(-1)、κ-OR拮抗剂nor-binaltorphimine(NOR-BNI,1μmol·L^(-1))存在时,κ-OR的激活对心肌细胞肥大的影响及相关机制。心肌细胞的体积应用消化分离法及计算机图像分析系统测定;心肌细胞的心钠素(atrial natriuretic peptide,ANP)的mRNA相对表达利用RT-PCR法测定;心肌细胞ERK1/2的相对表达水平应用Western blot法测定;心肌细胞的形态变化利用相差显微镜观察。结果ET-1可以使心肌细胞体积增大,ANPmRNA表达增多,ERK1/2表达增多;与ET-1(10 nmol·L^(-1))组相比,U50488H(1μmol·L–1)可明显使ET-1诱导的心肌细胞体积变小,ANPmRNA表达减少,ERK1/2表达减少,U0126(1μmol·L^(-1))、Ro-31-8220(50 nmol·L^(-1))与其抑制程度相似,三者差异无显著性;当用U0126(1μmol·L^(-1))、Ro-31-8220(50 nmol·L^(-1))预处理时U50488H(1μmol·L^(-1))的抑制现象部分消失,但当用PTX(5 mg·L^(-1))、NOR-BNI(1μmol·L^(-1))(κ-OR受体拮抗剂)预处理时U50488H(1μmol·L^(-1))的抑制现象基本消失。结论κ-OR激动剂U50488H能抑制内皮素-1诱导的大鼠心肌细胞肥大,其作用机制主要与其能抑制胞外信号调节激酶通路的上游元件PKC的激活有关。

摘要： 百日咳毒素(pertussis toxin,PTx)是百日咳鲍特菌产生的重要毒素,是百日咳发病过程中重要的致病因子.研究显示,与PTx互作蛋白的分子量差异较大,从人淋巴细胞表面的43 kD蛋白到胰岛素分泌细胞表面的200 kD蛋白不等.已经明确PTx可与宿主细胞表面的N连接寡糖糖蛋白、唾液酸糖蛋白类因子以及一些糖蛋白(如触珠蛋白和胎球蛋白)、GD1a糖脂相互作用,尤其与其受体Gi蛋白互作,致胞内cAMP水平上升,引起各种生理反应.但目前对PTx在胞内的其他修饰底物和互作蛋白认识有限,严重阻碍了对PTx如何调控宿主细胞的其他信号通路和生理功能的深入理解.

摘要： 目的 了解百日咳毒素(pt)基因启动子区及不同亚基编码区遗传变异特点及进化规律,为分子流行病学监控和疫苗研究提供参考依据.方法 从GenBank数据库中下载已公开发表的百日咳菌株pt基因启动子区序列及S1～S5亚基编码序列,利用PhyML 3.0软件构建系统发育树,确定进化簇;利用MEGA 7.0软件计算遗传距离;通过VESPA分析工具,分析不同进化簇的特征性核苷酸/氨基酸位点;利用SNAP v2.1.1软件计算不同区域选择压力.结果 获得启动子区序列797条,含有4个进化簇,平均遗传距离为1.89×10-3;获得S1区序列786条,含有4个进化簇,平均遗传距离为2.43×10-4,dn/ds＞1;获得S2区序列772条,含有2个进化簇,平均遗传距离为4.31×10-5,dn/ds＞1;获得S3区序列772条,含有1个进化簇,平均遗传距离为3.96×10-6;获得S4区序列775条,含有1个进化簇,平均遗传距离为2.36×10-5;获得S5区序列776条,含有1个进化簇,所有序列无差异,平均遗传距离为0.结论 pt基因不同区域遗传变异度及进化特点存在明显差别.针对pt基因的分子流行病学研究和疫苗研发应重点关注启动子区,S1亚基及S2亚基.

摘要： 目的 考察不同培养基、不同牛血清、血清灭活与否及生产过程中添加的各外源物质对百日咳毒素(pertussis toxin,PT)在中华仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary cell,CHO)簇集试验中的影响.方法 分别使用3种培养基F-12K、DMEM/F12和1640培养CHO细胞,并进行CHO细胞簇集试验,观察细胞生长状态及PT引起细胞簇集的敏感性;分别选取2个厂家的牛血清(对2种血清进行灭活和不灭活处理)培养CHO细胞,观察4种牛血清对细胞生长及簇集的影响;选用生产过程中添加的物质进行CHO细胞簇集试验,观察细胞生长状态及是否出现簇集,确定不影响细胞生长的最高浓度,同时使用不影响细胞生长的各添加物质最高浓度进行小鼠组胺致敏试验,观察与CHO细胞簇集试验结果是否一致.结果 3种培养基对CHO细胞生长及CHO细胞簇集存在明显差异,F-12K培养基培养的细胞形态规则、典型,其他2种培养基培养的细胞生长缓慢,且对PT的敏感性均低于F-12K培养基;4种牛血清中胎牛血清培养的细胞生长最快且形态规则,簇集试验敏感性优于其他3组血清;添加的各外源物质均会导致细胞生长缓慢或死亡,在稀释至一定浓度后可以排除添加物质对CHO细胞簇集试验的影响,同时在小鼠组胺致敏试验中不会引起动物死亡.结论 F-12K培养基最适宜实验室CHO细胞生长,不同血清对细胞生长和簇集的敏感度有一定差异,添加的外源物质残留量应进行控制以保证试验结果的稳定可靠.

摘要： 目的 建立一种无细胞百日咳疫苗的功能性抗体检测方法 ,为无细胞百日咳疫苗原液及成品的生产一致性评价和效力评价提供一种便捷有效的解决方案.方法优化并使用CHO细胞簇集试验方法检测小鼠免疫血清的百日咳毒素中和抗体滴度.结果 确定疫苗样品以1/5人用剂量腹腔免疫20～24 g、5周龄的雌性NIH小鼠10只,4周后采血分离血清,倍比稀释血清用0.1 IU/ml的百日咳毒素国家参考品中和2 h,加入到预先培养的CHO细胞孔中孵育48 h后判定簇集结果,最终不簇集孔的血清稀释倍数的几何均值即为样品中和抗体滴度.不同工艺无细胞百日咳疫苗的中和抗体滴度有显著性差异;不同工艺无细胞百日咳疫苗改良脑腔攻击试验结果通过与不通过的产品中和抗体有明显区分度.结论 百日咳毒素中和抗体法大幅减少动物使用量,CHO细胞簇集试验具备一定的重复性和精密性,可以满足不同工艺无细胞百日咳疫苗成品及原液的生产一致性和效力的监测和初步评价.

摘要： 目的比较CHO细胞簇集试验、小鼠体内检测法（小鼠组胺致敏试验、小鼠白细胞增多试验）检测不同脱毒条件下的百日咳类毒素残余毒性的应用效果和相关性。方法以不同脱毒条件百日咳类毒素作为研究对象,用CHO细胞簇集试验、小鼠体内法检测百日咳毒素残余毒性,并进行相关性分析。结果白细胞增多实验与组胺致敏实验结果存在显著的正相关（r=0.881,P=0.00）,CHO细胞法与白细胞增多实验呈负相关（r=0.630,P=0.028）,CHO细胞法与组胺致敏实验呈负相关（r=-0.613,P=0.034）。结论分析了无细胞组分百日咳疫苗脱毒工艺中CHO细胞簇集试验和小鼠体内检测法2种检测试验的差异性和相关性,为百日咳毒素脱毒工艺的便捷检测开发提供重要参考。

摘要： 目的 比较CHO细胞簇集试验、小鼠体内检测法(小鼠组胺致敏试验、小鼠白细胞增多试验)检测不同脱毒条件下的百日咳类毒素残余毒性的应用效果和相关性.方法 以不同脱毒条件百日咳类毒素作为研究对象,用CHO细胞簇集试验、小鼠体内法检测百日咳毒素残余毒性,并进行相关性分析.结果 白细胞增多实验与组胺致敏实验结果存在显著的正相关(r=0.881,P=0.00),CHO细胞法与白细胞增多实验呈负相关(r=0.630,P=0.028),CHO细胞法与组胺致敏实验呈负相关(r=-0.613,P=0.034).结论 分析了无细胞组分百日咳疫苗脱毒工艺中CHO细胞簇集试验和小鼠体内检测法2种检测试验的差异性和相关性,为百日咳毒素脱毒工艺的便捷检测开发提供重要参考.

摘要： 目的:建立第2代WHO百日咳毒素国际标准品.方法:以第1代WHO百日咳毒素国际标准品为协作标定的标准品,对英国国家生物制品检定所提供的待标品和中国食品药品检定研究院内部参考品进行国际单位值测定和稳定性测定.测定方法为组胺致敏试验、CHO细胞簇集试验以及3项生化试验方法.结果:中国食品药品检定研究院完成了组胺致敏、CHO细胞簇集2项试验以及1项生化试验.结论:NIBSC经过对来自12个国家的14个实验室的结果进行统计学处理后,赋值第2代WHO百日咳毒素国际标准品组胺致敏活性为每支1 813 IU、CHO细胞簇集活性为每支680 IU,储存和运输稳定性符合要求.%Objective: To establish the 2 ndgeneration WHO international reference standard of pertussis toxin. Methods: The candidate reagent provided by the NIBSC and NIFDC were assayed against the 1 stgeneration WHO pertussis toxin standard. The histamine sensitisation test, CHO cell clustering test and three biochemical test methods were used to calculate the IU and investigate the sability. Results: Two tests of histamine sensitization, CHO cell clustering test and a biochemical test were performed in NIFDC. Conclusion: After statistical analysis of the results from 14 laboratories in 12 countries, NIBSC assigned the histamine sensitization activity of the 2 nd generaion WHO pertussis toxin international reference standard to 1 813 IU·ampoule-1, CHO cell cluster activity to680 IU/ampoule. The storage and transport stabilities meet the requirements.

摘要： 目的:建立适合大规模生产的组分无细胞百日咳疫苗(acellular component pertussis vaccine,ACPV)纯化新工艺,从百日咳杆菌发酵液中分离纯化百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)和百日咳黏附素(pertactin,PRN)3种抗原组分.方法:百日咳杆菌发酵液经离心分离上清和菌体,上清通过超滤浓缩后,经多模式阳离子交换介质Eshmuno(R) HCX和阳离子交换介质Capto SP ImpRes两步层析获得PT;菌体经高盐缓冲液浸提后离心,浸提上清经阳离子交换介质Capto SP ImpRes和羟基磷灰石介质CHT两步层析获得FHA;浸提沉淀采用尿素抽提和硫酸铵盐析后,经复合型阴离子交换介质Capto Adhere和阳离子交换介质Capto SP ImpRes两步层析获得PRN.采用该工艺连续生产3批ACPV,检测各项指标,验证该工艺的重复性.结果:经该工艺得到的3种抗原组分完整性好且纯度均在95％以上,层析工艺平均回收率可达60％以上,FHA和PRN抗原均可通过特异性毒性检查;建立的纯化新工艺具有良好的重复性.结论:采用柱层析方法从百日咳杆菌培养物中分离纯化出了3种高纯度的百日咳抗原成分(PT,FHA和PRN),该方法适用于大规模生产,为以组分百白破疫苗为基础的联合疫苗的研发奠定基础.

摘要： 目的:rn 研究百日咳毒素(PTX)阻断G蛋白偶联雌激素受体(GPER)对17β雌二醇(17β-E2)活化子宫内膜癌细胞HEC-1A和Ishikawa磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/AKT信号通路的影响.探讨GPER在子宫内膜癌雌激素活化PI3K/AKT信号通路中的作用.rn 方法:rn 应用免疫细胞化学法检测子宫内膜癌细胞HEC-1A和Ishikawa中GPER蛋白的表达情况.不同浓度(0、0.1、0.5、1.0μg/mL)百日咳毒素(PTX)分别作用两种细30min后,1×10-6mol/L 17β-E2分别共同刺激HEC-1A细胞15min、Ishikawa细胞30min,用Western blot法检测两种细胞中GPER、Erα蛋白及Erβ蛋白的表达情况及AKT活化情况.rn 结果:rn 1.Ishikawa细胞中,GPER蛋白细胞浆阳性表达;随着PTX作用浓度的增加:P-AKT/AKT比值逐渐下降,浓度为1.0μg/mL时比值下降最显著(F=63.729 P=0.0001);GPER的表达量逐渐下降,浓度为1.0μg/mL时表达量下降最显著(F=160.284 P=0.0001);Erα和Erβ蛋白的表达量各浓度组间差异均无统计学差异.rn 2.HEC-1A细胞中,GPER蛋白细胞浆阳性表达;随着PTX作用浓度的增加:P-AKT/AKT比值逐渐下降,浓度为1.0μg/mL时,AKT的活化被完全阻断(F=1039.321 P=0.0001);GPER的表达量逐渐下降,浓度为1.0 μg/mL时GPER的表达被完全抑制(F=833613 P=0.0001);Erα蛋白的表达量各浓度组间差异均无统计学意义.rn 结论:rn 1.Ishikawa细胞中,GPER蛋白细胞浆阳性表达;随着PTX作用浓度的增加:P-AKT/AKT比值逐渐下降,浓度为1.0μ g/mL时比值下降最显著(F=63.729 P=0.0001);GPER的表达量逐渐下降,浓度为1.0μg/mL时表达量下降最显著(F=160.284 P=0.0001);Erα和Erβ蛋白的表达量各浓度组间差异均无统计学差异.rn 2.HEC-1A细胞中,GPER蛋白细胞浆阳性表达;随着PTX作用浓度的增加:P-AKT/AKT比值逐渐下降,浓度为1.0μg/mL时,AKT的活化被完全阻断(F=1039.321 P=0.0001);GPER的表达量逐渐下降,浓度为1.0μg/mL时GPER的表达被完全抑制(F=833.613 P=0.0001);Erα蛋白的表达量各浓度组间差异均无统计学意义.

摘要： 目的：克隆百日咳毒素S1亚单位C端截短片段S146,构建表达重组子,在大肠杆菌中表达并纯化目的蛋白,利用其自制抗体进行包被初步建立特异性检测百日咳毒素的双抗体夹心ELISA方法。方法 PCR扩增得到S146基因产物,将其亚克隆入载体pUC18,通过转化测序,筛选到阳性重组体pUC18-S146,双酶切获得S146编码基因,连接入载体pET16b,转化大肠杆菌BL21,经IPTG.诱导表达。表达产物经镍离子亲和层析柱纯化,并用SDS-PAGE和Western blot鉴定。纯化S146蛋白免疫家兔获得抗血清,经Protein G柱纯化后,作为包被抗体与抗天然百日咳毒素抗体联合特异性检测无细胞百日咳原液中的百日咳毒素。结果 成功表达和纯化S146蛋白,用纯化PTS146片段免疫家兔产生的抗体可特异性识别天然PT;将抗S146抗体与抗天然PT抗体联合组建双抗体夹心ELISA法能够检测天然PT,而与白喉类毒素、破伤风类毒素和FHA无交叉反应,为研制特异性检测试剂,提供一种疫苗的质量控制方法奠定基础。

摘要： 目的：克隆百日咳毒素S1亚单位C端截短片段S146，构建表达蘑组子，在大肠杆菌中表达并纯化目的蛋白，利用其自制抗体进行包被初步建立特异性检测百日咳毒素的双抗体夹心ELISA方法。rn 方法: PCR扩增得到S146基因产物，将其亚克隆入载体pUC18，通过转化测序，筛选到阳性重组体pUC18-S146，双酶切获得S146编码基因，连接入载体pET16b，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达。表达产物经镍离子亲和层析柱纯化，并用SDS-PAGE和Western blot鉴定。纯化S146蛋白免疫家兔获得抗血清，经Protein G柱纯化后，作为包被抗体与抗天然百日咳毒素抗体联合特异性检测无细胞百日咳原液中的百日咳毒素。rn 结果: 成功表达和纯化S146蛋白，用纯化PT S146片段免疫家兔产生的抗体可特异性识别天然PT；将抗S146抗体与抗天然PT抗体联合组建双抗体夹心ELISA法能够检测天然PT，而与白喉类毒素、破伤风类毒素和FHA无交叉反应，为研制特异性检测试剂，提供一种疫苗的质量控制方法奠定基础。

摘要： 百日咳毒素（ＰＴ）是鲍特氏菌属百日咳杆菌所产生的一种主要毒力因子，具有多种生物学活性，能引起百日咳众多的临床症状，同时也是主要的免疫原。

摘要： 了解北京市2017年常住人口中产妇及新生儿脐带血血清特异性百日咳IgG,百日咳毒素IgG抗体水平.随机选取北京市三家妇幼保健院产妇613例及其分娩的616例新生儿作为研究对象,采用问卷调查收集调查对象的人口学特征、百日咳患病史及含百日咳成分疫苗接种史,采集产妇静脉血、脐带血3ml,用酶联免疫吸附试验检测百日咳毒素IgG及百日咳特异性抗体IgG.

摘要： 百口咳毒素(Pertussis toxin,PT)是鲍特氏菌属百口咳杆菌产生的一种主要毒力因子，具有多种生物学活性.PT与白喉、霍乱等细菌毒素结构相似，为A-B型毒素，由一具有酶活性的A-原体与B-寡聚体组成。PT因毒性太强，需采用化学脱毒，进行脱毒处理制成类毒素，既严格保证失去毒性，又保留免疫原性，方可作为疫苗使用。PT的残留毒性被认为是全细胞百口咳疫苗接种不良反应的一个主要原因，目前根据PT的生物学活性建立了很多特异性检测方法，用于检测PT毒性，包括体内法和体外法两类。

摘要： 目的：建立无细胞百日咳疫苗血清学效价检测方法(PSPT)并与改良小鼠脑腔攻击法(MICA)相比较，对其适用性进行初步研究。rn 方法：采用离子交换、亲和层析等方法纯化出百日咳毒素(PT)和丝状血凝索(FHA)。用纯化抗原包被酶标板，以羊抗鼠IgG酶标抗体为指示抗体，建立检测小鼠抗PT抗体和抗FHA抗体的ELISA间接法，并对系统各项技术指标进行验证。在此基础上建立PSPT法，并与MICA法进行相关性分析。rn 结果：建立了小鼠抗PT抗体ELISA和抗FHA抗体ELISA，标准曲线线性范围内r≥0.99;经验证，两系统与无关抗体之间均无交叉反应;检测限度分别为93.75 mEU/ml和59.0625 mEU/ml，检测限量分别为100mEg/ml和70mEU/ml。建立了小鼠抗PT抗体PSPT和抗FHA抗体PSPT，将10批无细胞百日咳原液分别以PSPT法和MICA法进行效价测定，MI-CA法测定效价越高的原液，其诱导小鼠产生的抗PT抗体和抗FHA抗体滴度也越高，两者呈正相关关系，两种方法对原液合格与否的判定结果没有显著性差异(P>0.05)，且PSPT法比MICA法具有更好的重复性。rn 结论：抗PT抗体ELISA和抗FHA抗体ELLSA灵敏度高，准确度及精密度均较好，在此基础上建立起来的PSPT法有望替代MICA法用于检测无细胞百日咳疫苗的效价。

摘要： 本发明提供了明确而有效地除去百日咳内毒素的方法，特征在于在进行区域离心前，在过量磷酸根离子存在下向含I期百日咳博德特氏菌菌株之抗感染部分及内毒素的液体中加入钙离子，同时提供了一种内毒素含量为每10μg蛋白氮不超过0.5ng的百日咳类毒素及其生产方法。

摘要： 本发明公开了一种百日咳毒素产品和百白破疫苗中活性蛋白的定性、定量测定方法。采用高效液相色谱串联质谱方法，建立了一种高通量、高选择性、高灵敏度的百日咳毒素产品和百白破疫苗活性蛋白百日咳毒素、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素的定量方法。本方法首次从复杂的疫苗基质中筛查出可用于各活性疫苗蛋白定性和定量分析的特征肽段，这些肽段与其它所报道的蛋白肽段不同，不能通过蛋白检索库获得，也不能通过这些疫苗蛋白的氨基酸序列简单得出。可实现不同生产厂家、不同批次百日咳毒素产品和百白破疫苗中百日咳毒素5种亚基、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素的同时定量。

摘要： 本发明涉及一种百日咳毒素检测试剂盒及其应用。本发明首先获得了一个抗体效价高达107，亲和常数为3.85×1011M‑1的百日咳毒素单克隆抗体，该单抗是由保藏编号为CGMCC No.15288的杂交瘤细胞株分泌得到，将本发明的单抗包被ELISA试剂盒，可用于酶联免疫法检测百日咳疫苗生产过程以及成品疫苗中百日咳毒素的含量检测，以便进行疫苗的质控，具有广泛的应用前景与市场价值。

摘要： 本发明涉及纯化百日咳毒素(PT)的试剂和方法。

摘要： 本发明公开了一种百日咳毒素产品和百白破疫苗中活性蛋白的定性、定量测定方法。采用高效液相色谱串联质谱方法，建立了一种高通量、高选择性、高灵敏度的百日咳毒素产品和百白破疫苗活性蛋白百日咳毒素、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素的定量方法。本方法首次从复杂的疫苗基质中筛查出可用于各活性疫苗蛋白定性和定量分析的特征肽段，这些肽段与其它所报道的蛋白肽段不同，不能通过蛋白检索库获得，也不能通过这些疫苗蛋白的氨基酸序列简单得出。可实现不同生产厂家、不同批次百日咳毒素产品和百白破疫苗中百日咳毒素5种亚基、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素的同时定量。

摘要： 提供了针对百日咳毒素(PT)的单域抗体、人源化单域抗体、其衍生蛋白及其用途。

摘要： 本发明公开了一种百日咳毒素在治疗脑梗死中的应用，所述百日咳毒素为针剂，该针剂制作包括百日咳毒素纯化、溶液配制和封装三个步骤，其中百日咳毒素的浓度为40‑50ug/ml。本发明提供的百日咳毒素可在卒中中起到保护作用，为临床治疗脑梗死的药物研发提供了积极的借鉴作用。

摘要： 本发明涉及一种百日咳毒素检测试剂盒及其应用。本发明首先获得了一个抗体效价高达107，亲和常数为3.85×1011M‑1的百日咳毒素单克隆抗体，该单抗是由保藏编号为CGMCC No.15288的杂交瘤细胞株分泌得到，将本发明的单抗包被ELISA试剂盒，可用于酶联免疫法检测百日咳疫苗生产过程以及成品疫苗中百日咳毒素的含量检测，以便进行疫苗的质控，具有广泛的应用前景与市场价值。

摘要： 本发明公开了一种分离纯化百日咳毒素和丝状血凝素的方法，它包括：S1.样品处理：百日咳杆菌培养结束后去除菌体、收集上清液，上清液用超滤膜包浓缩；S2.一次层析：包括洗脱杂蛋白、分离百日咳毒素和分离纯化丝状血凝素；S3.二次层析：将分离的百日咳毒素粗制品上样于CaptoMMC层析柱，缓冲液洗脱，收集OD

摘要： 本发明涉及纯化百日咳毒素(PT)的试剂和方法。