永生化

摘要： 背景:细胞永生化是细胞获得持续增殖能力的一种特性,大T抗原基因可使细胞永生化效率提升,并广泛应用于实验中,越来越受到研究者的关注.目的:建立人骨髓间充质干细胞永生化细胞株,为人骨髓间充质干细胞的临床应用奠定基础.方法:使用含有猴空泡病毒40大T抗原基因的重组质粒载体转染人骨髓间充质干细胞,连续传代培养,通过形态学、细胞增殖能力、细胞表面标记、多向分化潜能等方法进行鉴定.结果 与结论:①该方法构建的永生化细胞株为贴壁生长的梭形细胞,具有人骨髓间充质干细胞特异性表面标志;②转染后第50代人骨髓间充质干细胞仍然可表达猴空泡病毒40大T抗原基因;③永生化细胞株的增殖能力优于未转染人骨髓间充质干细胞;④永生化细胞株具有向成骨、成脂肪、成软骨细胞分化的潜能;⑤由此可见,转染猴空泡病毒40大T抗原基因不影响人骨髓间充质干细胞的生物学特性和分化能力,该方法可以用于建立人骨髓间充质干细胞永生化细胞株.

摘要： 背景:细胞永生化是细胞获得持续增殖能力的一种特性,大T抗原基因可使细胞永生化效率提升,并广泛应用于实验中,越来越受到研究者的关注。目的:建立人骨髓间充质干细胞永生化细胞株,为人骨髓间充质干细胞的临床应用奠定基础。方法:使用含有猴空泡病毒40大T抗原基因的重组质粒载体转染人骨髓间充质干细胞,连续传代培养,通过形态学、细胞增殖能力、细胞表面标记、多向分化潜能等方法进行鉴定。结果与结论:①该方法构建的永生化细胞株为贴壁生长的梭形细胞,具有人骨髓间充质干细胞特异性表面标志;②转染后第50代人骨髓间充质干细胞仍然可表达猴空泡病毒40大T抗原基因;③永生化细胞株的增殖能力优于未转染人骨髓间充质干细胞;④永生化细胞株具有向成骨、成脂肪、成软骨细胞分化的潜能;⑤由此可见,转染猴空泡病毒40大T抗原基因不影响人骨髓间充质干细胞的生物学特性和分化能力,该方法可以用于建立人骨髓间充质干细胞永生化细胞株。

摘要： 目的:分离牙髓干细胞,用含有SV40-LT抗原的慢病毒感染牙髓干细胞以建立永生化细胞株并进行鉴定。方法:消化法获得牙髓干细胞;用慢病毒粒子HBLV-SV40LT-3*flag-PURO感染目的细胞,抗生素筛选出稳定传代的细胞株,并进行干性测定。结果:原代与永生化的牙髓干细胞(iDPSCs)在分化能力及表面标记物的检测无差异;Real-time PCR结果显示,感染组细胞中SV40-LT基因的转录水平显著提高;Western blot结果显示,实验组均可检测到标签蛋白Flag的表达。结论:含有SV40-LT基因片段的慢病毒可使人牙髓干细胞发生永生化,永生化后的细胞仍具有多向分化潜能。

摘要： 取长江江豚(Neophocaena phocaenoids asiaeorientalis)产后胎盘脐静脉,经组织块培养,差异贴壁法纯化,构建长江江豚的原代细胞系;经外源癌基因SV40 T antigens(猿猴病毒T抗原)转染构建稳定脐带细胞系,并对长江江豚的永生化后的成纤维细胞的细胞形态、转染效率、生长曲线和活率等进行探究.结果表明:(1)原代脐静脉细胞大约14d从组织边缘分离,20d形成单层,细胞呈现典型的成纤维细胞状,梭形、不规则星行或多边形.原代细胞传代14代后出现老化和凋亡.(2)通过SV40 T antigens转染构建的细胞系可传代40—50次,证实转染SV40 T antigens后可增加细胞的增殖能力.(3)不同世代永生化的成纤维细胞复苏前后细胞活性并无明显差异,复苏细胞活性在90％以上,表明永生化后的细胞可以稳定保存.利用CCK-8法测得细胞的生长曲线呈现"S"型.(4)对永生化的细胞系进行后续基因表达尝试,通过转染外源基因绿色和红色荧光蛋白,转染外来质粒效率约为15％,说明外源基因可以表达,并能被成功检测.研究构建长江江豚的脐静脉来源的永生化后细胞系,为江豚的其他组织细胞系建立以及江豚细胞库的建立提供基础,成功对永生化后的细胞系进行外源基因的转染,为以后深入长江江豚相关基因和分子机制研究打下基础.

摘要： 背景:黏着斑激酶被作为骨组织工程中"生物材料/支架""种子细胞""生长因子"3个要素的桥梁分子,研究其在相关种子细胞成骨分化过程中的作用及机制,对于骨组织工程的发展及应用尤为重要.目的:探讨黏着斑激酶在诱导永生化小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化过程中的作用及机制.方法:在相同的诱导条件下诱导野生型及黏着斑激酶敲除后小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化,在相同的诱导条件下诱导经磷脂酰肌醇3-激酶特异性磷酸化抑制剂和细胞外调节蛋白激酶磷酸化抑制剂处理的野生型及黏着斑激酶敲除后小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化.在显微镜下观察不同诱导时期细胞形态改变,蛋白免疫印迹技术检测早期成骨相关蛋白表达水平及相应的磷脂酰肌醇3-激酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、细胞外调节蛋白激酶磷酸化水平,Real-time PCR检测成骨相关基因转录水平,最后在成骨诱导3周后对诱导细胞进行茜素红钙结节染色.结果与结论:①相同的诱导条件下黏着斑激酶敲除后小鼠胚胎成纤维细胞的成骨效应较保留斑激酶的小鼠胚胎成纤维细胞组明显下降;②加入磷脂酰肌醇3-激酶特异性磷酸化抑制剂处理的野生型及黏着斑激酶敲除后,小鼠胚胎成纤维细胞与对照组相比成骨相关蛋白表达水平及成骨效应明显下降;③加入细胞外调节蛋白激酶磷酸化抑制剂处理的野生型及黏着斑激酶敲除后,小鼠胚胎成纤维细胞与对照组相比成骨相关蛋白表达水平及成骨效应明显下降;④提示静默黏着斑激酶表达可通过降低磷脂酰肌醇3-激酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、细胞外调节蛋白激酶(1/2)磷酸化水平,降低成骨相关蛋白表达水平,进而抑制小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化.

摘要： 背景:黏着斑激酶被作为骨组织工程中“生物材料/支架”“种子细胞”“生长因子”3个要素的桥梁分子,研究其在相关种子细胞成骨分化过程中的作用及机制,对于骨组织工程的发展及应用尤为重要。目的:探讨黏着斑激酶在诱导永生化小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化过程中的作用及机制。方法:在相同的诱导条件下诱导野生型及黏着斑激酶敲除后小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化,在相同的诱导条件下诱导经磷脂酰肌醇3-激酶特异性磷酸化抑制剂和细胞外调节蛋白激酶磷酸化抑制剂处理的野生型及黏着斑激酶敲除后小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化。在显微镜下观察不同诱导时期细胞形态改变,蛋白免疫印迹技术检测早期成骨相关蛋白表达水平及相应的磷脂酰肌醇3-激酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、细胞外调节蛋白激酶磷酸化水平,Real-time PCR检测成骨相关基因转录水平,最后在成骨诱导3周后对诱导细胞进行茜素红钙结节染色。结果与结论:①相同的诱导条件下黏着斑激酶敲除后小鼠胚胎成纤维细胞的成骨效应较保留斑激酶的小鼠胚胎成纤维细胞组明显下降;②加入磷脂酰肌醇3-激酶特异性磷酸化抑制剂处理的野生型及黏着斑激酶敲除后,小鼠胚胎成纤维细胞与对照组相比成骨相关蛋白表达水平及成骨效应明显下降;③加入细胞外调节蛋白激酶磷酸化抑制剂处理的野生型及黏着斑激酶敲除后,小鼠胚胎成纤维细胞与对照组相比成骨相关蛋白表达水平及成骨效应明显下降;④提示静默黏着斑激酶表达可通过降低磷脂酰肌醇3-激酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、细胞外调节蛋白激酶(1/2)磷酸化水平,降低成骨相关蛋白表达水平,进而抑制小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化。

摘要： 近年我国的水禽养殖业迅速发展,但对于鸭鹅等水禽的疾病防控主要专注于禽流感、新城疫等疾病。自2017年起于我国养鹅场突然爆发的雏鹅痛风至死亡等的疾病,由于缺乏适宜的实验室宿主系统,对病毒的分离鉴定及后续疫苗的开发产生深远影响。因此为便于日后的病毒扩增及深入研究,将原代鹅肾细胞进行永生化培养。研究主要针对鹅构建永生化细胞系,使用22日龄左右鹅胚,处理组织剪碎消化,采用组织块贴壁法培养原代细胞。经感受态细胞扩增PcDNASV40-LT质粒载体,设定引物并用PCR对质粒DNA进行验证,证明质粒扩增表达成功后转染原代培养的鹅肾组织细胞。通过直接接触法进行细胞转染,随后采用抗生素筛选出获得SV40-LT基因表达的阳性细胞,挑取单一转化灶经过多次传代培养,成功建立鹅肾细胞系。

摘要： [目的]建立永生化绵羊瘤胃成纤维细胞系,为基础研究和动物病毒的研究提供稳定的体外细胞模型.[方法]采用组织块贴壁法培养绵羊瘤胃成纤维细胞(ovine ruminal fibroblasts cells,ORFCs),利用PEI试剂将带有hTERT基因的pCI-neo-hTERT质粒转染ORFCs,经G418筛选得到阳性克隆细胞.采用RT-PCR、Western Blot检测F15和F35代阳性克隆细胞的hTERT基因的转录和表达情况;利用血球计数法绘制原代ORFCs和F35代阳性克隆细胞的生长曲线比较其增殖能力.[结果]将hTERT基因成功转入ORFCs并稳定表达;阳性克隆细胞的增殖能力显著高于原代ORFCs.[结论]该试验成功建立了永生化绵羊瘤胃成纤维细胞系.

摘要： [目的]探索永生化对麝鼠香腺成纤维细胞转录组的影响.[方法]在获得永生化的麝鼠香腺成纤维细胞后,采用二代测序的方法对其永生化前后转录组进行检测,并通过生物信息学方法进行差异分析.[结果]用Trinity软件对麝鼠永生化和原代香腺细胞测序数据进行基因组装,总共发现62152 unigenes,富集分析结果显示,上述基因主要聚集在细胞代谢、细胞生物学调控、蛋白结合和酶催化等基因的细胞基础代谢活动.基于DESeq2包的基因表达差异分析结果表明,永生化和原代细胞表达差异的基因总共有8690个,其中上调基因3414个,下调基因5276个,上调基因主要富集于DNA复制、同源重组、错配修复、细胞周期和RNA代谢通路,下调基因主要富集于氧化磷酸化、帕金森病和阿尔茨海默病疾病通路中.[结论]永生化过程对麝鼠原代细胞基因的影响较大,可为后续建立永生化香腺细胞体外泌香体系提供理论支撑.

摘要： 人脐带间充质干细胞(hMSCs)是一种具有多向分化潜能的多能干细胞,在组织修复和某些疾病治疗的临床应用上发挥着重要作用。利用CRISPR/Cas9技术在腺相关病毒AAVS1位点插入具有磷酸甘油酸激酶PGK启动子和SV40-polyA的SV40 LT基因,使hMSCs达到永生化。并利用慢病毒构建具有抑癌作用的反义长链非编码RNA MYC-AS1转基因的hMSCs,从该细胞系的培养液中分离提取表达MYC-AS1的外泌体。通过处理肝癌HepG2细胞,研究外泌体对HepG2表型的影响。结果表明:与野生型MSCs相比,永生化细胞MSCs-SV40增殖显著加快,但其定向分化特性并未改变,可在体外稳定传代超过40代,且未发现成瘤性。MYC-AS1转基因hMSCs的外泌体能表达MYC-AS1,且显著抑制HepG2肿瘤细胞的增殖和迁移。这一研究通过CRISPR/Cas9技术敲入SV40 LT基因成功构建了hMSCs,其MYC-AS1转基因细胞的外泌体对HepG2肿瘤细胞具有明显的抑制作用,这对hMSCs及其外泌体的基础研究和临床应用研究具有重要意义。

摘要： 近年来,人源肝细胞的需求日益增多。新药的开发与应用、病毒性肝炎的实验研究、肝细胞移植及生物人工肝的研究应用等等均需要大量的人源肝细胞。但人肝细胞来源困难，细胞分离、培养及储存的技术尚不完善，体外培养存活时间短，其供给无法满足日益增多的需求。近几年永生化的人肝细胞技术进展较快，尤其是构建成功的可逆性永生化人肝细胞，有望从根本上解决人肝细胞来源困难的难题，本文介绍了永生化的人肝细胞技术和可逆性永生化人源肝细胞技术。

摘要： 本文构建了包括雌激素受体与重组酶的融合基因Cre-ER、永生化基因SV40T、加强型绿色荧光蛋白与胸苷激酶的融合基因EGFP-TK以及重组位点loxP序列的可回复性永生化逆转录病毒载体,为肝细胞可回复性永生化奠定基础.方法：扩增EGFP及TK并采用重叠延伸拼接(SOE)法连接EGFP和TK,将EGFP-TK融合基因亚克隆至pBABE-puro-lox的SalⅠ和CiaⅠ位点之间,构建成新载体pBGTKlox.连接SV40T与FMDV-2A,回收后用EcoRⅠ和SalⅠ酶切连接至pBGTKlox载体的相应位点,构成的新载体称为pBTGTKlox.连接Cre-ER与FMDV-2,回收后用EcoRⅠ酶切连接至pBTGTKlox的相应位点,构成的新载体称为pCTGTKlox.将纯化的pCTGTKlox和pPDFl5质粒共转染包装细胞PT67,并在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达.扩大培养稳定转染的细胞,免疫组化染色检测SV40T基因的表达.结果：成功拼接EGFP-TK融合基因并克隆入pBABE-puro-lox,构建成新载体pBGTKlox.酶切鉴定证明为重组阳性体,测序验证无密码突变,转染PT67细胞证明EGFP-TK基因得到表达.成功扩增出含FMDV-2A序列的SV40T并克隆入pBOTKlox载体,构成pBTGTKlox.酶切鉴定证明为重组阳性体,经测序验证无编码突变,转染PT67细胞24h后可见细胞发出绿色荧光.成功在Cre-ER基因的3'端加上FMDV-2A序列,并将扩出的Cre-ER2A片段正向克隆入pBTOTKlox,构成新载体pCTGTKlox.EcoRI酶切鉴定证实为重组阳性体,经测序验证无核苷酸突变.pCTGTKlox转染PT67细胞24h后,荧光显微镜下可见散在多处绿色荧光.免疫组化染色显示细胞胞核呈阳性染色.结论：成功将SV40T、Cre及调控基因置于两个LoxP位点之间,构建并表达可回复性永生化逆转录病毒载体pCTGTKlox,为细胞的可回复永生化提供了一种良好的新型载体.

摘要： 目的:建立永生化的人骨髓基质细胞系供神经外科临床和基础研究使用。rn 方法:原代培养人骨髓基质干细胞,以逆转录病毒为载体,导入人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)全长cDNA,经筛选得到阳性克隆,体外连续传代,检测hTERT基因的整合情况及其表达,并对转化的骨髓基质细胞进行诱导,使其分化成神经元样细胞。rn 结果:成功地将hTERT基因转入人骨髓基质细胞,得到的转化细胞端粒酶表达阳性,增殖旺盛,至今已传至82代。神经元特异性标志物NeuN和 Tubulin—β III表达呈阳性。rn 结论:转导外源性的hTERT基因可以导致人骨髓基质细胞永生化且可诱导其分化成神经元样细胞。

摘要： 目的:建立人源性永生化肝细胞系,为生物人工肝和肝细胞移植等提供合适的细胞源.方法:利用SV40LTag基因和真核表达载体pcDNA3.1(-)经脂质体转染至来源于25岁男性脑死亡者供肝的原代培养细胞,使其永生化,进一步鉴定其形态学特征和生物学功能.结果:经G418 700-300μg/ml筛选,42天后获一抗G418永生化肝细胞系.该细胞系呈单层贴壁、上皮细胞样形态生长,体外培养可无限传代,具有分泌ALB、ALT、AST及LDH的功能,超微结构观察发现,转染肝细胞具有原代培养肝细胞的大多数典型特征,如较大的细胞核、细胞内含有丰富的糖原颗粒、大量的线粒体和粗面内质网等.经RT-PCR和Westenr blot检测,转染肝细胞的ALB mRNA阳性和细胞色素P450 2E1阳性.结论:新建人源性肝细胞系与原代培养肝细胞具有类似的形态学特征和生物学功能.

摘要： 本发明提供一种构建永生化猪肝星状细胞系的方法、永生化猪肝星状细胞系和应用，涉及永生化细胞技术领域，本发明所述方法从猪肝脏中分离得到正常的猪肝星状细胞，以SV40LT过表达慢病毒转染，得到永生化的猪肝星状细胞系。本发明采用包含SV40LT序列的慢病毒载体对猪肝星状细胞进行永生化，具有可感染非分裂期细胞、容纳外源性基因片段大，可长期表达等优点。本发明所述方法构建的永生化猪肝星状细胞系呈伸展状态生长，有伪足，细胞轮廓清晰，细胞完整，具有与原代猪肝星状细胞类似的典型形态学特征；所得永生化猪肝星状细胞系传代10代后，细胞形态和特征与第1代细胞无明显差别，该构建的永生化猪肝星状细胞系可在药物筛选中应用。

摘要： 本发明提供了一种制备永生化树突状细胞的基因、载体、方法和永生化树突状细胞，属于基因工程技术领域，将ST40基因经linker与TAX2基因连接后，得到制备永生化树突状细胞的基因；所述ST40基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述TAX2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。采用本发明提供的基因制备得到的永生化树突状细胞，除包括HLA‑A0201以外，还涵盖了中国人群常见的HLA‑A1101、HLA‑A2402、HLA‑A0301等近9种类型，大大增加了应用范围。

摘要： 本发明公开了一种永生化饲养层细胞株的构建方法、永生化饲养层细胞株及应用，本发明选择将至少两种永生化基因感染进饲养层细胞中，两种永生化基因通过不同的促进细胞永生化的途径对饲养层细胞永生化实现协同促进作用，并得到永生化饲养层细胞株，弥补了饲养层细胞永生化方法的空白，为评价药物治疗肿瘤或控制肿瘤细胞增殖效果以及确定细胞增殖或衰老机理提供了广泛的细胞资源。

摘要： 本发明提供了一种制备永生化树突状细胞的基因、载体、方法和永生化树突状细胞，属于基因工程技术领域，将ST40基因经linker与TAX2基因连接后，得到制备永生化树突状细胞的基因；所述ST40基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述TAX2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。采用本发明提供的基因制备得到的永生化树突状细胞，除包括HLA‑A0201以外，还涵盖了中国人群常见的HLA‑A1101、HLA‑A2402、HLA‑A0301等近9种类型，大大增加了应用范围。

摘要： 本发明提供一种构建永生化猪肝星状细胞系的方法、永生化猪肝星状细胞系和应用，涉及永生化细胞技术领域，本发明所述方法从猪肝脏中分离得到正常的猪肝星状细胞，以SV40LT过表达慢病毒转染，得到永生化的猪肝星状细胞系。本发明采用包含SV40LT序列的慢病毒载体对猪肝星状细胞进行永生化，具有可感染非分裂期细胞、容纳外源性基因片段大，可长期表达等优点。本发明所述方法构建的永生化猪肝星状细胞系呈伸展状态生长，有伪足，细胞轮廓清晰，细胞完整，具有与原代猪肝星状细胞类似的典型形态学特征；所得永生化猪肝星状细胞系传代10代后，细胞形态和特征与第1代细胞无明显差别，该构建的永生化猪肝星状细胞系可在药物筛选中应用。

摘要： 本申请公开了一种永生化猪骨髓巨噬细胞、其构建方法及应用。所述构建方法包括：以包含SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一重组质粒转染猪骨髓巨噬细胞，再培养转染后的细胞，并分离出细胞单克隆。进而，本申请还通过以包含SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二重组质粒、第三重组质粒转染永生化猪骨髓巨噬细胞的方式对其进行了改造。本申请提供的永生化猪骨髓巨噬细胞系的构建及改造方法均简单易操作，所获永生化猪骨髓巨噬细胞系具有可以持续传代的显著特点，其经改造后对病毒的敏感性高。

摘要： 本发明公开一种永生化人喉环后区细胞，所述永生化人喉环后区细胞是在人喉腔环后区来源细胞中导入Bmi1基因构建而成，所述永生化人喉环后区细胞拥有体外无限增殖或接近于无限增殖的能力。本发明将Bmi1基因导入人喉环后区上皮原代细胞，从而构建永生化人喉环后区上皮细胞株，并经过试验研究发现，构建所得永生化人喉环后区细胞株能够减缓喉环后区上皮细胞衰老，保持细胞活性，为咽喉环后区良恶性疾病致病机制研究提供稳定可靠的细胞模型。同时，本发明还公开了一种取材方便、可重复性强、便于操作的永生化人喉环后区细胞构建方法。

摘要： 本发明公开一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法，包括以下步骤：S1、小鼠肺微血管内皮原代细胞分离：分离新生小鼠边缘肺组织，用眼科剪刀将组织剪成小块，制备单细胞悬液，磁珠阴性选择去除CD45+、CD90.2+和CD326+的细胞，筛选内皮细胞集落进行体外增殖；S2、内皮细胞永生化：转染六种慢病毒并进行筛选，根据细胞的生长速率和形态选择永生化细胞株；S3、囊泡提取：采用超声离心法提取囊泡。本发明通过磁珠阴性选择和圈选手段，避免了传统磁珠阳性选择提取细胞的损害，极大改善内皮细胞的损耗；本发明通过转染慢病毒至原代细胞，构建永生化细胞，永生化细胞分泌囊泡保留了原代细胞分泌囊泡的特性，极大降低囊泡提取成本。

摘要： 包含编码至少一种永生化蛋白的序列的合成的、自我复制型RNA载体，以及自我复制型RNA载体延长原代细胞群体的寿命和扩增所述原代细胞群体的用途。

摘要： 本发明公开了一种自发永生化的胎猪肾小球系膜细胞系及其应用。该细胞系名称为PMC‑3，保藏编号为：CGMCC No.23099。该细胞系第60代的细胞仍保持原代细胞的形态特征，核型分析表明连续传代后细胞没有发生染色体变异。该细胞系对猪乙型脑炎病毒高度易感，接毒后72h，细胞病变达到70％～80％，收获的病毒液病毒含量为107.5PFU/ml，比Vero细胞培养的猪乙型脑炎病毒相比，具有收毒时间快、效价高的特点。同时该细胞系还可以用于猪瘟病毒和流行性腹泻病毒的培养及流行性腹泻病毒的分离等，具有广泛的应用价值。