永生化饲养层细胞株的构建方法、永生化饲养层细胞株及应用

摘要

本发明公开了一种永生化饲养层细胞株的构建方法、永生化饲养层细胞株及应用，本发明选择将至少两种永生化基因感染进饲养层细胞中，两种永生化基因通过不同的促进细胞永生化的途径对饲养层细胞永生化实现协同促进作用，并得到永生化饲养层细胞株，弥补了饲养层细胞永生化方法的空白，为评价药物治疗肿瘤或控制肿瘤细胞增殖效果以及确定细胞增殖或衰老机理提供了广泛的细胞资源。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物和细胞培养技术领域，具体而言，涉及永生化饲养层细胞株的构建方法、永生化饲养层细胞株及应用。

背景技术

细胞永生化是指体外培养的细胞经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离，从而具有无限增殖能力的过程。正常情况下，细胞自发永生化的几率非常小，啮齿类动物为10

细胞永生化是细胞癌变的必经途径，为了研究治疗肿瘤、控制肿瘤细胞增殖以及完善器官移植方法，需要人为干预使细胞永生化，同时，对于传代困难、增殖慢或易衰老的细胞来讲，细胞永生化也是获得充足细胞资源进而了解细胞增殖与衰老机制的重要途径。

随着基因工程技术的发展，目前发现的细胞永生化的可行方法为，通过基因转染等技术将外源性永生化基因如病毒、原癌基因或抑癌基因突变体等，导入目的细胞内，以增加细胞永生化的发生率，进而建立永生化细胞株，以达到使体外培养的细胞具有无限增殖能力且细胞间无差异。例如，利用病毒的SV40 large T抗原能够实现细胞的高效永生化。但是，外源病毒的感染导致细胞基因组非常不稳定，产生不可预见的突变，以及细胞表型的改变，因此，该永生化方法无法用于饲养层细胞。

现阶段已报道的永生化基因多达十种以上，包括c-MYC、bFGF、TERT、BMI-1和SV40T等，但上述基因均无法在单独使用的情况下，使饲养层细胞永生化。

饲养层细胞通常指在干细胞培养过程中，预先铺设于干细胞下的单层细胞，其作用在于促进干细胞生长，同时分泌一些能够抑制干细胞分化的组分。饲养层细胞的永生化成功率低，对原代细胞感染率更加低。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供永生化饲养层细胞株的构建方法和永生化饲养层细胞株，弥补了目前缺少饲养层细胞永生化方法的空白。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供一种永生化饲养层细胞株的构建方法，所述构建方法包括将至少两种永生化基因导入饲养层细胞中，得到永生化饲养层细胞株。

需要说明的是，在本发明中，“永生化基因”指的是，当两种或多种在饲养层细胞中成功表达或表达量增大后，能够促使饲养层细胞永生化的基因。

在可选的实施方式中，所述永生化基因包括c-MYC、bFGF、TERT、BMI-1或SV40 T。

c-MYC基因在BL细胞中往往出现c-MYC基因位点与Ig基因位点之间的易位，即c-MYC易位到Ig位点的高活性转录区，从而组成一个高转活性的重排基因，启动c-MYC转录，使c-MYC表达增强，促进细胞恶变，最后导致肿瘤的发生，而c-MYC基因的正常值为不表达或低表达，将c-MYC基因感染进饲养层细胞，并促使其成功表达，能够提高饲养层细胞永生化几率。

bFGF最早发现于1940年，是一种含155个氨基酸的促有丝分裂的阳离子多肽，其氨基酸序的55％和aFGF相同，分子量为16～18.5KD。bFGF分子结构中有4个半胱氨基酸，以此形成分子的三维空间结构，是一种促细胞分裂的肝素结合蛋白，可诱导多种细胞的增殖与分化，其在饲养层细胞中的大量表达，可以提高饲养层细胞的永生化几率。

TERT是一种核糖核蛋白聚合酶，通过添加端粒重复序列TTAGG来维持端粒末端。这种酶由一种具有逆转录酶活性的蛋白质成分和一种作为端粒重复模板的RNA成分组成。TERT的表达在细胞衰老中起作用，因为它通常在出生后的体细胞中被抑制，导致端粒逐渐缩短。体细胞TERT表达的放松调控可能与肿瘤发生有关。对小鼠的研究表明TERT也参与染色体修复，因为端粒重复序列的从头合成可能发生在双链断裂处。TERT在饲养层细胞中的高表达，将组织端粒的缩短，进而促进饲养层细胞永生化。

BMI-1基因是PcG家族中的核心成员之一，对胚胎期哺乳动物骨骼、造血及神经的发育发挥重要作用。在肿瘤细胞中，BMI-1呈高度表达状态，使肿瘤细胞不断更新成为癌症干细胞，其表达水平与肿瘤的发生、发展、侵袭、预后等病理指标相关。多肿瘤抑制基因(INK4a/ARF/INK4b即CDKN2a位点，人类位于9p21)可同时编码三种蛋白质即p16、p14和p15，前两种蛋白正常有序的表达是维持细胞周期平衡的重要因素。p16通过cyclinD-CDK4/6-pRb-E2F使细胞停滞于G0/G1期，无法进入S期。p14则通过MDM2-P53通路来调控细胞周期。BMI-1是INK4a/ARF的上游调节因子，在转录水平负向调控INK4a/ARF的表达。当BMI-1基因发生改变而导致INK4a/ARF基因功能失活时，将使上述通路永无休止的进行，最终可能导致细胞的癌变并维持癌细胞不断更新。当饲养层细胞中高表达BMI-1基因后，p16和p14的表达收到抑制，放松细胞周期调控，从而促进饲养层细胞的永生化。

SV40 T是SV40(simian virus 40)病毒编码的一个调控蛋白，SV40病毒是上世纪60年代分离出来的猿猴肾细胞病毒。SV40病毒基因组早期基因编码两种肿瘤抗原(Tumorantigen，T抗原)，其分子量分别为94000(LT抗原)和17000(s t抗原)。T抗原的作用是:①SV40T抗原能启动细胞永生化程序；②SV40 T抗原能维持转化细胞的表型。因此，SV40T大抗原能使细胞进入永生化的增殖状态，在生命科学研究中属于常用工具之一。但越来越多研究表明SV40 T会导致细胞基因组不稳定，从而进入肿瘤转化阶段。

上述5种基因中的任意两种以上在饲养层细胞中的高表达均能够提高饲养层细胞的永生化几率，尤其是，当TERT基因和BMI-1基因在饲养层细胞中同时实现高表达时，BMI-1基因使得饲养层细胞的细胞周期不断循环，显著地提高了饲养层细胞的增殖能力，同时TERT基因又避免了饲养层细胞的端粒缩短，延长了饲养层细胞的寿命，两种基因有效配合、协同作用，实现饲养层细胞的永生化。

在可选的实施方式中，所述感染的方法包括，将重组质粒包装成的病毒感染至饲养层细胞中，其中重组质粒载有永生化基因。

在可选的实施方式中，所述重组质粒采用的载体质粒包括慢病毒质粒、逆转录病毒质粒或两种质粒的组合。

优选地，所述慢病毒质粒包括PLV-EF1a-Puro。

优选地，所述重组质粒包括pBABE-Puro-hTERT-HA质粒。

优选地，所述饲养层细胞来源于成纤维细胞。

在可选的实施方式中，采用293T细胞将重组质粒包装成病毒。

在可选的实施方式中，所述永生化基因包括BMI-1和hTERT；所述BMI-1插入慢病毒质粒。

慢病毒质粒作为载体具有广泛的宿主范围，对于非周期性和有丝分裂后的细胞均能够有效感染，并且能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上，并随细胞基因组的分裂而分裂，从而达到持久性表达目的序列的效果。由于常态下，Bmi-1基因是作为INK4a/ARF基因的上游调节因子发挥作用的，因此，将Bmi-1基因高效地整到饲养层细胞染色体上，将进一步提高Bmi-1基因对饲养层细胞永生化的促进效果，因此，本发明选择慢病毒质粒作为Bmi-1基因的载体质粒。

本发明优先选择逆转录病毒表达hTERT，其原因在于，逆转录病毒载体较小，可以装载基因的大小比慢病毒大。当采用慢病毒包装hTERT时，重组质粒过大，包装病毒的效率大大降。

在可选的实施方式中，所述慢病毒质粒的包装方法包括，将带有BMI-1基因的慢病毒质粒、慢病毒原件PMD2G和PSPAX质粒按照质量比例5:2:3混合，利用PEI转染到293T细胞中，收集上清即为慢病毒。

在可选的实施方式中，所述逆转录病毒质粒的包装方法包括，将带有hTERT基因的逆转录病毒质粒、逆转录病毒原件pRetro-Gal-Pol和pRetro-VSVG质粒按照质量比例10:7～9:1～2混合，利用PEI转染到293T细胞中，收集上清即为逆转录病毒；

优选地，所述带有hTERT基因的逆转录病毒质粒、逆转录病毒原件pRetro-Gal-Pol和pRetro-VSVG质粒的质量比例为10:9:1。

在可选的实施方式中，所述感染方法包括将病毒与polybrene的混合液加入到opti-MEM中孵育后，滴加到饲养层细胞中培养，再将培养基更换为无病毒完全培养基，继续培养，然后加入Puromycin进行阳性克隆筛选。

优选地，所述慢病毒和逆转病毒的加入质量比例为1：1～3，优选为1：2；

优选地，所述polybrene的加入量为4～10μg/ml，优选为8μg/ml；

优选地，更换无病毒完全培养基前培养时间为24～26h；

优选地，更换无病毒完全培养基后继续培养时间为72h；

优选地，所述Puromycin的加入量为1～3μg/ml，优选为2μg/ml。

第二方面，本发明提供前述实施方式任一项所述的构建方法得到的永生化饲养层细胞株。

第三方面，本发明提供了前述实施方式获得的永生化饲养层细胞株在如下(A)～(C)中任一项的应用：

(A)评价药物治疗肿瘤或控制肿瘤细胞增殖效果；

(B)确定细胞增殖或衰老机理；

(C)人源原代组织细胞的功能鉴定。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种永生化饲养层细胞株的构建方法，由于饲养层细胞不同于其他种类细胞，通常具有不分裂的特点，常规的细胞永生化方法无法实现饲养层细胞的永生化，本发明选择将至少两种永生化基因感染进饲养层细胞中，两种永生化基因通过不同的促进细胞永生化的途径对饲养层细胞永生化实现协同促进作用，并得到永生化饲养层细胞株，弥补了饲养层细胞永生化方法的空白，为评价药物治疗肿瘤或控制肿瘤细胞增殖效果以及确定细胞增殖或衰老机理提供了广泛的细胞资源。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1中构建的PLV-EF1a-BMI-1-puro重组质粒图谱示意图；

图2为实施例1中的pBABE-Puro-hTERT-HA质粒图谱示意图；

图3为实验例1中永生化饲养层细胞株与未永生化饲养层细胞株镜检结果图；

图4为实验例2中Western-blot法检测结果；

图5为实验例3中获得的未永生化饲养层细胞的免疫荧光检测结果；

图6为实验例3中获得的永生化饲养层细胞的免疫荧光检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了将BMI-1基因和hTERT基因感染进来源于成纤维细胞的饲养层细胞中获得永生化饲养层细胞株的方法，具体包括以下步骤：

1.1重组质粒的获取

(1)PLV-EF1a-BMI-1-puro质粒的构建

利用PCR引物从293T细胞中克隆BMI-1基因，所得BMI-1基因序列如SEQ ID No.1所示，而后将所得BMI-1基因连接到PLV-EF1a-Puro慢病毒质粒中，构建PLV-EF1a-BMI-1-puro重组质粒，PLV-EF1a-BMI-1-puro重组质粒图谱如图1所示，具体步骤如下：

①PCR反应扩增目的基因

上述PCR引物序列为：

正向引物序列：CGGGATCCATGCATCGAACAACGAGAATCAAGA(SEQ ID No.2)

反向引物序列：TGCTCTAGATCAACCAGAAGAAGTTGCTGATGAC(SEQ ID No.3)

PCR反应体系为：94℃、5min；94℃、30s；60℃、30s；72℃、1min；72℃、5min；重复30个循环。

②凝胶电泳分离目的基因

PCR反应结束后，采用1％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，并以DNAMarker 6ul做对照。在120V恒压条件下电泳30min后，于凝胶成像系统下观察并用刀片切下目的条带，并采用DNA凝胶回收试剂盒对目的基因进行回收。

③目的基因与载体质粒双酶切

在1.5ml离心管中加入酶切体系，振荡混匀，短暂离心后，于37℃下温育1小时，而后采用回收试剂盒分别回收目的基因和载体质粒的酶切产物。

所述酶切体系为：

所述带酶切样本为步骤②得到的PCR产物，或者，载体质粒。

④目的基因与载体质粒连接

取步骤③中得到的酶切后的载体质粒产物和目的基因产物，加入连接反应体系中，在16℃下连接过夜，而后65℃下灭活10min，将目的基因连接于载体质粒上。

所述连接反应体系如下：

⑤转化感受态DH5α细菌

将5μl DNA含量为100ng的连接好目的基因的载体质粒，加入到50μl感受态DH5α细菌中，热休克后，再加入500μl不含抗生素的LB培养基，经离心后，取混合菌液加入到含有抗生素的LB平板培养皿筛选阳性菌。

⑥阳性克隆鉴定

每个平板挑3-5个单克隆，分别培养在装有20ml LB液体培养基的试管中，250rpm条件下培养过夜。而后收集菌液，取700ul菌液加入300ul过滤的50％甘油到EP管中，混合后-80℃下保存。

剩下的细菌提取质粒进行酶切，以1％琼脂糖凝胶电泳，并以DNAMarker 6ul做对照。在120V恒压条件下电泳20min后，于凝胶成像系统下观察是否含有目的条带。

(2)从Addgene中购买pBABE-Puro-hTERT-HA质粒，质粒图谱如图2所示。

1.2病毒的包装

(1)慢病毒质粒包装

将质粒pLV-CMV-BMI1-puro以及慢病毒原件PMD2G和PSPAX质粒按照质量比例5:2:3混合，利用PEI转染到293T细胞中，于48小时和72小时后分别收集病毒上清，并合并上清液，即为慢病毒。

(2)逆转录病毒质粒包装

将质粒pBABE-Puro-hTERT-HA以及逆转录病毒原件pRetro-Gal-Pol和pRetro-VSVG质粒按照质量比例10:9:1混合，利用PEI转染到293T细胞中；于48小时和72小时后分别收集病毒上清，并合并上清液，即为逆转录病毒。

1.3病毒感染及克隆筛选

将上述包装得到的慢病毒、逆转录病毒与8μg/ml的polybrene混合后加入opti-MEM中孵育5min，滴加到饲养层细胞中，24h后更换为无病毒完全培养基，再继续孵育72h后加入2μg/mL的Puromycin进行阳性克隆筛选，即得到永生化饲养层细胞株RW1。

实施例2

本实施例提供了实施例1得到的永生化饲养层细胞株在人源原代组织细胞功能鉴定中的应用，具体包括以下步骤：

将实施例1得到的永生化饲养层细胞株经过4ug/mL的丝裂霉素药物处理后与人源原代组织细胞混合培养，混合培养后可成功为人源原代细胞提供营养，支持原代细胞的生长。

实验例1

将实施例1得到的永生化饲养层细胞株与未永生化饲养层细胞株同时进行传代，统计最大传代次数，结果显示，实施例1得到的永生化细胞株最大传代次数可达到25代以上，取未永生化饲养层细胞株传代5代后(如图3中a所示)，与永生化饲养层细胞株传代3代(如图3中b所示)和20代(如图3中c所示)得到的细胞株在显微镜下观察，结果如图3所示，由图中可以看出，永生化后的细胞与未永生化相比，细胞形态没有区别，状态良好，并且传代20代时的细胞状态与3代时细胞状态无差异。

实验例2

以未永生化的饲养层细胞作为阴性对照WT，以293T功能细胞为阳性对照，通过Western-blot法验证实施例1获得的永生化饲养层细胞株RW1是否表达hTERT及BMI-1蛋白，实验结果如图4所示，由图中可以看出，在实施例1获得的永生化细胞株RW1中hTERT与BMI-1基因同时表达成功。

实验例3

按照如下步骤，对未永生化饲养层细胞WT和实施例1得到的永生化细胞RW1进行细胞免疫荧光检测：

3.1在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；

3.2用4％的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；

3.3使用0.5％Triton X-100(PBS配制)室温通透20min；

4.4使用PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；

4.5吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；

4.6加荧光二抗：PBST浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20～37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；

4.7复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min洗去多余的DAPI，重复清洗4次；

4.8用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

未永生化细胞WT组的检测结果如图5所示，永生化饲养层细胞RW1的检测结果如图6所示，由图中可以看出，永生化前后细胞没有变化，还保留成纤维细胞的特性，并表达Vimentin抗体。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。