定向进化

摘要： 以分子伴侣skp修饰的蒙古黄芪病程相关蛋白AmPR-10(Astragalus membranaceus pathogenesis-related protein-10)全基因为模板,通过易错PCR定向进化技术构建突变体文库,以酵母tRNA为底物建立高通量筛选方法,获得了核酸酶活性提高的AmPR-10突变体。经一轮定向进化后,突变体A4的核酸酶活性比野生型提高45%;测序结果显示,突变体A4基因序列在465位增加了1个碱基A,进而由移码突变引起了多肽序列的提前终止,使得突变体A4 C末端缺失了3个氨基酸;从空间上看,AmPR-10基因的突变减小了其C末端α螺旋对空腔的遮蔽作用,有利于目的蛋白与配体或底物的结合。该研究结果对AmPR-10核酸酶活性机制的探讨具有重要意义,为抗病抗逆黄芪植株的培育奠定了理论基础。

摘要： 2’-岩藻糖基乳糖在婴幼儿配方奶粉、保健品和医药等产品开发方面极具应用价值。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori NCTC11639)来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶(FutC)是目前合成2’-岩藻糖基乳糖的重要生物催化剂,但是天然酶存在异源表达量低、催化活性差等缺陷。针对α-1,2-岩藻糖基转移酶定向进化过程中缺少高通量筛选方法的问题,发展了基于荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting,FACS)的FutC超高通量筛选方法。对FutC进行了定向进化实验,通过对FutC的随机突变库进行了3轮筛选,从库容量为5.4×10^(5)突变文库中成功筛选出活力提高2.6倍、2.7倍、3倍的3种突变体(K282E,K102E,R105C),证明了此筛选方法的有效性。本研究为α-1,2-岩藻糖基转移酶的分子活性改造奠定了良好基础。

摘要： 研究海栖热袍菌木聚糖酶B(TmXynB)的定向进化、高效表达和应用。构建突变文库后经两轮筛选,获得一个在酸性高温下具有高比活力的突变体(mTmXynB)。突变体mTmXynB的最适pH值和最适温度为5.5和90°C,较野生型的最适pH值和最适温度分别下降了0.5和10°C,对小麦阿拉伯木聚糖的比活力由529 U/mg提高至1565 U/mg。序列比对表明,mTmXynB中3个氨基酸发生突变,分别为Asn91Ser、Trp129Arg和Arg143Glu。经定点突变实验,Arg143Glu通过改变局部蛋白表面的电荷分布提高了其耐酸性,Trp129Arg通过打破疏水平台降低了酶的最适温度,而Asn91Ser可能通过改变底物结合位点Trp89的构象提高该酶的催化活力。进一步将mTmXynB表达至毕赤酵母,经高密度发酵酶活力达18000 U/mL。突变体mTmXynB和野生型TmXynB分别添加至麦芽糖化过程中,结果表明mTmXynB在150 U/g麦芽添加量时效果最好,可降低45%的过滤时间和8.7%的料液黏度。而TmXynB在600 U/g麦芽添加量时效果最好,分别降低39%和8.1%的过滤速度和料液黏度。因此,突变体mTmXynB在啤酒工业中具有很好的应用前景。

摘要： 目的:对嗜热杜邦菌来源α-淀粉酶进行分子改造,以提高其耐热性和产酶水平。方法:基于易错PCR技术构建嗜热杜邦菌来源α-淀粉酶(Td-amy)的随机突变文库,高通量筛选耐热性和比酶活提高的突变体,通过定点突变及同源结构模拟对突变体进行分析,并将其在毕赤酵母中表达。结果:筛选得到一个正向突变体(mTdamy)。该突变体最适温度(60°C)较野生型(55°C)提高了5°C,比酶活(466.3 U/mg)较野生型(227.9 U/mg)提高至2.0倍。经序列对比,mTd-amy有四个氨基酸发生了变化,分别为Ala4Val、Ala122Val、Lys194Arg和Ala468Asp,定点突变结果表明Ala122Val和Ala468Asp位点为影响其比酶活和最适反应温度的关键。进一步将突变体mTd-amy在毕赤酵母中高效表达,经高密度发酵其酶活达64696 U/mL。结论:定向进化获得了嗜热杜邦菌来源α-淀粉酶的正向突变体,该突变体的最适温度和比酶活力均明显提高,为α-淀粉酶的分子改造以及工业化应用等提供了理论参考。

摘要： 为提高米黑根毛霉甘露聚糖酶(RmMan5A)对魔芋粉的水解效率,利用定向进化技术对该酶进行分子改造,经两轮筛选获得了一个对甘露聚糖酶催化效率显著提升的突变体(RmMan5AM2)。该突变体的最适pH为7.0,最适温度为65°C,较野生型甘露聚糖酶提高了10°C。该突变体继承了野生型甘露聚糖酶的高比酶活力,对槐豆胶的比酶活力达10371.4 U/mg。在最适条件下,该突变体对槐豆胶、魔芋粉和瓜尔胶的催化效率分别提高了37.4%、28.9%和34.4%。进一步将该突变体在毕赤酵母中进行高效表达,经过156 h高密度发酵,发酵液胞外酶活力达176000 U/mL,是目前产甘露聚糖酶的最高水平。利用该突变体水解魔芋粉成功制备魔芋甘露寡糖,产物主要为聚合度2~6的甘露寡糖(相对峰面积>85%),总得率为88.5%。该突变体具有优良的酶学性质,对魔芋粉的水解效率显著提升,在魔芋甘露寡糖的酶法制备中具有很大的应用潜力。

摘要： 新生多肽链通常需要折叠成独特的三维结构来发挥其生物学功能。天然存在的蛋白质仅具有边缘稳定性,少量突变或轻微环境扰动就可能影响蛋白质的正确折叠。蛋白质组的稳定性,即蛋白质稳态,由蛋白质组中较不稳定的蛋白质决定,因而也具有边缘稳定性。蛋白质以及蛋白质组的边缘稳定性决定了细胞内存在着复杂的质量控制机制,用来帮助蛋白质正确折叠、修复或降解错误折叠的蛋白质。本文详细介绍了以热休克蛋白家族为代表的分子伴侣协助蛋白质折叠的内部机制,并回顾了通过过量表达分子伴侣、转录因子等手段提高蛋白质稳态的研究。蛋白质在保持稳定性的同时也在不断进化,本文介绍了蛋白质稳定性与可进化性关系的研究。实验证明,稳定性增强的蛋白质提高了对随机突变的包容度,有助于积累更多突变。相较于野生型蛋白质,这些蛋白质突变体在不同环境的选择下,会产生更多功能适应性突变体,即发生进化。因而蛋白质的稳定性是影响其进化的重要因素。分子伴侣作为蛋白质折叠的参与者,直接协助了蛋白质的定向进化。本文围绕蛋白质折叠的稳定性、蛋白质稳态和蛋白质进化的问题,讨论了以分子伴侣为主的分子机器帮助维持蛋白质稳定、促进蛋白质进化的相关研究。鉴于生物系统的复杂程度,我们对生物进化的理解仍然有限。希望关于影响蛋白质稳定性和可进化性的研究能够为理解蛋白质结构功能的构效关系提供独特见解,同时也为探究蛋白质相关疾病致病机理提供理论基础。

摘要： 目的基于定向进化的新特性蛋白质合成研究的关键在于基因变体库的生成以及目标蛋白质的筛选,而目标蛋白质筛选的成功率取决于基因变体库的多样性,针对采用从头寡核苷酸合成策略的基于基因芯片技术的基因变体库合成生物技术,本文研究并设计一种旨在提高基因变体库多样性的寡核苷酸设计方法。方法采用了逆翻译算法提高基因序列的一致性,并利用在高同源区域的片段切割来提高基因合成过程中的重组率,从而提高基因变体库的多样性。结果与DNAWorks和TmPrime设计后的基因序列相比,本文方法能够达到更高的一致性,同时基因片段切割结果显示该方法能够使切割后的前后片段末端具有非常高的相似度。最后设计的寡核苷酸经过基因芯片合成筛选得到了目标蛋白质。结论本文提出的寡核苷酸设计方法充分利用了DNA序列间的基因重组,设计出的寡核苷酸序列经过基因芯片的合成证实了可行性,说明本文提出的寡核苷酸设计算法能够有效提高基因变体库的多样性。

摘要： 嗜热酸性Ⅲ型普鲁兰水解酶TK-PUL在液化条件下可完全水解淀粉为淀粉糖,在“液化糖化一步法”的淀粉制糖工艺中具有巨大的应用潜力。本研究拟采用易错聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术提高TK-PUL的催化活性。经过两轮易错PCR及高通量筛选,获得了催化活性提高的突变体L538D。与TK-PUL相比,L538D以可溶性淀粉为底物的比酶活力提高了50%,以普鲁兰多糖为底物的比酶活力提高了21%;L538D以可溶性淀粉、普鲁兰多糖为底物的k/K值分别提高了44%、27%。即L538D的α-1,4-糖苷键水解活性和α-1,6-糖苷键水解活性均明显提高,并且其α-1,4-糖苷键水解活性的提高幅度更大。同源模建得到的蛋白质分子结构显示,将TK-PUL中Leu538替换为Asp,可能通过缩短氨基酸残基侧链的长度和减弱氨基酸残基的疏水性,提高了催化活性位点Glu538所在loop结构的柔性,从而提高酶的催化活性。本研究结果表明,TK-PUL中Leu538是影响其催化活性的重要氨基酸残基。

摘要： 三萜化合物是一类具有重要生物活性的天然产物,其生物合成途径受到极大的关注,在植物中它们都是由异戊二烯代谢途径,经过2,3-氧化鲨烯环化及羟基化和糖基化修饰产生,2,3-氧化鲨烯环化酶(OSC)催化底物环化生成三萜骨架是三萜结构多样和生物活性的基础。本综述对植物OSC基因的研究方法、克隆和功能鉴定、进化及酶结构和催化机制等各个方面的研究进展进行了综述,为植物三萜代谢途径解析,特别是OSC功能的研究提供了依据。最后,从酶挖掘、结构预测和定向进化三个方面展望了植物OSC今后的发展和突破。

摘要： 定向进化米曲霉β-半乳糖苷酶(AoBgal35A),以提高其水解乳糖的效率,通过易错PCR构建米曲霉β-半乳糖苷酶的突变体文库,高通量筛选水解乳糖效率高的突变体,将其在毕赤酵母中高效表达,并用于制备无乳糖牛奶。筛选得到一个正向突变体(mAoBgal35A),经高密度发酵酶活力达4760 U/mL。纯化后,mAoBgal35A的最适pH和温度分别为5.0和55°C,比野生型AoBgal35A分别提高了0.5和降低了5°C。mAoBgal35A在室温下能高效水解牛奶中的乳糖,加酶量为2 U/mL时,水解72 h后牛奶中的乳糖质量浓度为0.38 g/dL,达到无乳糖牛奶标准。而野生型AoBgal35A的加酶量为20 U/mL时,在相同条件下水解后,乳糖质量浓度为0.6 g/dL。由此表明,定向进化明显提高了米曲霉β-半乳糖苷酶水解乳糖的效率,所得正向突变体在制备无乳糖乳品中具有很大的应用潜力。

摘要： 生物催化剂己广泛应用于化学原料药与医药中间体的绿色生物合成,但天然生物催化剂尚存在催化效率低、底物范围窄、立体选择与区域选择较差等问题,因此对生物催化剂催化性能的改善与提高以满足新的更高的需求备受青睐. 定向进化技术可有效改造生物催化剂使其实现新的功能，但筛选是其应用的瓶颈，尤其对于手性催化很难建立高通量筛选方法。

摘要： 本文以酶催化水解2-苯基丙酸对硝基苯酚酯为模型反应，对BSLA催化三联体附近的重要位点进行定向进化，通过多轮的突变，最终得到的产物ee值可以提高到90%，优先选择R构型。同时，具有反转的S-构型选择性的突变株则可以催化获得ee值达到70%的S-构型产物。这两类突变株也具有较好的底物谱。最后，利用分子动力学模拟也对两类突变株的选择性差异进行了解释。

摘要： 本文对实验室前期通过宏基因组文库筛选得到的一个全长为906bp的新型脂肪酶基因LIP906进行定向进化研究,通过易错PCR技术对其分子结构进行改造来提高脂肪酶的稳定性,使其能够尽快被应用.

摘要： 定向进化是重要的蛋白质工程技术,在优化酶催化活性、稳定性、选择性等关键功能中有重要应用.但在利用定向进化对酶分子进行改造时,筛选通量是决定酶改造效率的关键.近年来,实验室发展了一系列超高通量酶活性筛选方法,通过使用单个大肠杆菌、或者包裹了单个大肠杆菌细胞的微液滴作为"酶微反应器",结合流失细胞术或微流控技术,在单细胞水平对大容量酶突变库进行定量筛选.

摘要： 具有高度立体选择性的酶在手性化学品合成方面具有重要应用价值,具有高效、高选择性、环境友好等优势,是化学手性拆分方法的理想替代品.定向进化技术通过模拟自然界达尔文进化原理,人工构建突变库并施加选择压力进行筛选,能够快速改善酶的各方面性质,是开发高度立体选择性酶的有效途径.

摘要： 定向进化是改造蛋白质分子的一种有效的新策略,已经被广泛应用于修饰和加强蛋白质性能的研究.但其构建的文库非常大,待筛选的克隆的数量常常会达到105-1013.同时在目的蛋白筛选中,至关重要的是找到高灵敏度、高选择性和高通量的筛选方法.近年来,许多新的高通量筛选方法不断涌现并被报道.

摘要： 阿魏酸酯酶是参与木质纤维素降解的重要酶类之一,能够水解半纤维素中的羟基肉桂酸与阿拉伯木聚糖和某些胶质形成的酯键.其中,来源于黑曲霉的阿魏酸酯酶A(AnFaeA)是目前研究和应用最多的阿魏酸酯酶.为了提高AnFaeA的热稳定性以促进其在工业上的应用,本课题通过PoPMuSiC和ep-PCR方法,以实验室合成的阿魏酸2-氯对硝基苯酚酯作为底物进行高通量筛选,获得了11个热稳定性有不同程度提高的突变子.整合所有位点构建突变体Mll,与木聚糖酶突变体FC06T在60°C联合作用水解气爆玉米秸秆释放阿魏酸的效率提高220倍.我们又利用DNA家族改组的方法对随机突变库进行有效补充,筛选到4个在65°C的热失活半衰期比Mll提高1.8倍的突变子.以上结果表明，Cys235位突变体在低温处理时，酶失活率更高，而在高温下可能形成更容易复性的中间体。

摘要： 本文利用迭代组合突变(Iterative Combinatorial Mutagenesis)对棒状链霉菌来源的青霉素扩环酶进行定向进化。利用迭代组合突变的方法对9株活性提高的突变体进行理性组合。制备了ScbR/ScbR2的单抗，利用单抗进行了Western-blot及Chip-qPCR的实验，从蛋白质水平和体内DNA的水平去寻找时序性调控scbA的机制。

摘要： 来自Rhodococcus rhodochrous tg1-A6的腈水解酶具有较高的催化腈化合物的能力,对其重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-Nit,本文采用定向进化的方法对该腈水解酶进行改造以提高腈水解酶的活力。从重组质粒pET-Nit出发,利用不同浓度的锰离子对腈水解酶基因进行易错PCR并构建随机突变库。根据腈水解酶催化羟基乙腈可导致反应体系pH值降低的特性,建立了简便的突变酶筛选方法。经过两轮的随机突变和筛选,从5000多个克隆中筛选得到了一株活性提高的突变菌BL21(DE3)/pET-NitMut2,其催化羟基乙腈的活力达到原始重组菌的4倍。NitMut2经DNA测序,发现腈水解酶基因发生了Asp27Glu、Asn97Lys和Leu246Phe等3个位点的突变。

摘要： β-葡萄糖苷酶是一类重要的糖苷水解酶,既具有水解活性,同时还具有合成转糖苷活性.基于其特殊的催化特性,β-葡萄糖苷酶可广泛应用于食品、饲料、能源、生物转化等领域.本文主要针对微生物来源β-葡萄糖苷酶的来源、性质、基因克隆与表达、酶的定向改造及应用进行综述.

摘要： 本发明提供了OsALS1的定向突变及农作物内源基因定向进化的方法。OsALS1的氨基酸序列为将序列78发生第一突变、第二突变和第三突变中的至少一种，第一突变为P171F、P171S和P171L中的一种，第二突变为L158F，第三突变为R190H。方法包括如下步骤：选定农作物的内源基因为靶基因；基于靶基因设计若干靶核苷酸序列，得到若干定向进化克隆序列并分别克隆到含有gRNA的质粒上，得到定向进化gRNA质粒库；将所述定向进化gRNA库中的相关序列与Cas9表达盒整合到同一载体上，转化所述农作物中，得到所述农作物的突变库；从所述农作物的突变库中筛选与所述靶基因相关的所需性状。

摘要： 本发明属于实验仪器设备领域，具体涉及一种多功能高通量定向进化系统及定向进化方法。所述定向进化系统，包括：恒温装置、培养液单元、诱导剂单元、微生物培养单元、进化单元、信号检测单元、信号读取装置、空气过滤器、泵；培养液单元与微生物培养单元无菌连通；诱导剂单元和进化单元无菌连通；微生物培养单元和进化单元无菌连通；进化单元和信号检测单元无菌连通；信号检测单元和信号读取装置电连接；所述培养液单元、诱导剂单元、微生物培养单元和进化单元上分别设置有空气过滤器。本发明的设备及使用方法，可以实现在生物体内对目标基因自动进化，避免文库的建立以及大量的筛选工作和过多的人工干预，实现自动、高通量的定向进化。

摘要： 本发明涉及膜蛋白定向进化领域，特别涉及一种质粒以及噬菌体辅助的连续定向进化系统和定向进化方法。一种质粒，包括AP1质粒和AP2质粒中的一种或两种；AP1质粒携带gIII基因，并且该质粒的启动子与核糖体结合位点之间设置有功能蛋白识别位点；AP2质粒携带功能蛋白基因。本发明设计新的辅助质粒AP1和AP2，将目标蛋白对胞内外底物分子的转运活性与AP1上的gIII表达偶联，通过这种间接的方式将SP的繁殖能力与目标蛋白的活性偶联，达到连续定向进化目的蛋白的效果。

摘要： 本发明提供了OsALS1的定向突变及农作物内源基因定向进化的方法。OsALS1的氨基酸序列为将序列78发生第一突变、第二突变和第三突变中的至少一种，第一突变为P171F、P171S和P171L中的一种，第二突变为L158F，第三突变为R190H。方法包括如下步骤：选定农作物的内源基因为靶基因；基于靶基因设计若干靶核苷酸序列，得到若干定向进化克隆序列并分别克隆到含有gRNA的质粒上，得到定向进化gRNA质粒库；将所述定向进化gRNA库中的相关序列与Cas9表达盒整合到同一载体上，转化所述农作物中，得到所述农作物的突变库；从所述农作物的突变库中筛选与所述靶基因相关的所需性状。

摘要： 本发明公开了一种基于定向进化改造的角蛋白酶突变体及其应用，本发明提供了一种基于易错PCR技术，定向进化获得高酶活突变体的方法。本发明共获得了9个酶活提高的突变体，其中突变体T8(R72S/F107Y/N291S/N295D)的酶活水平最高，为2382U/mL，是对照菌酶活的2.1倍。采用培养基组分优化及7L发酵罐扩大培养的发酵研究策略，实现了突变菌产酶量的提升，角蛋白酶活力可达8448U/mL，本发明为角蛋白酶的高效表达及产酶研究提供了一种有效的策略。采用角蛋白酶与胰蛋白酶复配降解角蛋白废弃物，探究酶解法的最佳条件，为实际生产中高效利用羽毛、提高蛋白利用率提供了理论基础。

摘要： 本发明公开了进行转录依赖性定向进化(TRADE)的方法和使用此类方法选择的新型AAV衣壳。本发明还提供了新型AAV衣壳突变体。TRADE技术被用于鉴定在静脉施用后介导脑中的神经元转导的新型AAV载体。TRADE在体内的应用导致鉴定出在施用新型AAV衣壳后在脑中可以比AAV9更有效、更特异性地转导神经元的新型AAV衣壳。TRADE技术可用于鉴定靶向各种细胞群的AAV衣壳。

摘要： 本发明提供一种噬菌体辅助的纤维寡糖转运蛋白连续定向进化系统和定向进化方法，该进化系统包含AV1质粒、AV2质粒和噬菌体，AV1质粒、AV2质粒的核酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。对纤维寡糖转运蛋白定向进化方法包括：将AV1质粒和AV2质粒共转化宿主菌，得到进化用工程菌；将噬菌体和步骤1获得的进化用工程菌在含有纤维寡糖的培养基中经过多轮进化培养，在多轮进化培养过程中，纤维寡糖在培养基中的浓度递减以增加筛选压力，获得突变体蛋白。本发明设计了一种可视化噬菌体辅助持续定向进化系统，该系统包括AV1质粒和AV2质粒，采用该进化系统进化纤维寡糖转运蛋白，可以实现纤维寡糖转运蛋白的可视化高通量进化过程，并避免过多人为干预，进化效率更高更灵敏，进而大大提高LacY对纤维寡糖的转运能力。

摘要： 本发明涉及生物工程技术领域，公开了一种漆酶定向进化方法及突变漆酶基因、表达载体、重组菌株及其脱毒黄曲霉毒素应用，所述漆酶的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，所述SEQ ID No:1中第235位氨基酸由Ser变为Pro得到突变漆酶，所述突变漆酶的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示。本发明的有益效果在于：本发明以在Pichiapastoris中异源表达的漆酶为基础，通过定点饱和突变，并在P.pastoris中异源表达突变漆酶基因，构建了一个“小而精”的饱和突变体文库；最终通过筛选获得了一株重组毕赤酵母突变菌株，其发酵产生的酶蛋白脱毒AFB1的效率提升至1.34倍，突变体蛋白可应用于生物乙醇制备过程中干酒糟及其可溶物(DDGS)中AFB1的同步脱毒。

摘要： 本发明提供了一种酶的定向进化方法及装置，以及一种计算机可读存储介质。该定向进化方法包括下步骤：确定提升起始酶的性能的多个单点突变位点；根据各所述单点突变位点，生成多种组合突变；根据所述多种组合突变，构建对应的组合突变描述张量；根据所述起始酶及各所述组合突变的催化活力、特异性及耐受性，构建性能描述矩阵；以及根据所述组合突变描述张量以及所述性能描述矩阵进行数学拟合，以确定符合进化方向的解。通过执行这些步骤，该定向进化方法能够通过数字化方法高效、可靠、客观地构建及筛选突变体，从而以更短的周期、更低的成本来确定性能显著提高的进化酶。

摘要： 本发明提供一种AP质粒，其特征为：所述质粒表达gIII‑neg蛋白，且在其核糖体结合位点后部插入了一个或多个SEQ ID No.1所示的RyhB结合序列。还公开了其在PAP I酶的PACE定向进化中的应用及PAP I酶的PACE定向进化系统。并公开了筛选得到的PAP I酶突变体、编码基因、原核表达载体及原核表达系统。本发明在PACE定向进化方法中引入了大肠杆菌非编码RNA RyhB sRNA，抑制gIII‑neg蛋白的翻译，解除gIII‑neg蛋白对子代噬菌体包装的不利影响。聚腺苷化活性越强的PAP I，越能延长RyhB的半衰期，促进后者对gIII‑neg蛋白的翻译抑制作用。噬菌体在多次传代后形成种群优势并被分离测序，最终获得活力显著提升的PAP I。