Rhodococcus rhodochrous tg1-A6腈水解酶的定向改造

摘要

来自Rhodococcus rhodochrous tg1-A6的腈水解酶具有较高的催化腈化合物的能力,对其重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-Nit,本文采用定向进化的方法对该腈水解酶进行改造以提高腈水解酶的活力。从重组质粒pET-Nit出发,利用不同浓度的锰离子对腈水解酶基因进行易错PCR并构建随机突变库。根据腈水解酶催化羟基乙腈可导致反应体系pH值降低的特性,建立了简便的突变酶筛选方法。经过两轮的随机突变和筛选,从5000多个克隆中筛选得到了一株活性提高的突变菌BL21(DE3)/pET-NitMut2,其催化羟基乙腈的活力达到原始重组菌的4倍。NitMut2经DNA测序,发现腈水解酶基因发生了Asp27Glu、Asn97Lys和Leu246Phe等3个位点的突变。