重组腺病毒载体

摘要： 目的构建及鉴定携带小鼠PTG基因(NM_016854)的过表达重组腺病毒载体,为深入研究PTG的功能奠定基础。方法化学合成小鼠PTG基因的编码序列,经聚合酶链式反应(PCR)扩增、酶切,后插入GV314载体(CMV-MCS-3FLAG-SV40-EGFP),得到重组穿梭质粒pGV314-PTG;进一步BamHⅠ/AgeⅠ双酶切,产物交换入线性化表达载体pDC315,构建重组腺病毒Ad-PTG,将其转染HEK293T细胞包装成重组病毒颗粒,经在HEK293T细胞反复扩增数代后,进行纯化及滴度检测,最后利用PCR、Western blot及测序验证重组腺病毒。结果经PCR、Western blot及测序后,结果显示成功构建pGV314-CMV-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-PTG过表达腺病毒载体(Ad-PTG),终点稀释法测得病毒滴度为4×10^(10)PFU/ml,Western blot和荧光定量PCR显示PTG的蛋白和mRNA表达水平显著升高。结论成功构建携带小鼠PTG基因的重组过表达腺病毒载体,且能有效上调肝细胞中PTG基因的表达。

摘要： 目的 观察斯钙素2(STC2)蛋白在胃癌腹腔侵袭转移中的作用.方法 2018年6月至2019年4月利用腺病毒载体将短发夹RNA(shRNA)转染人胃癌SGC7901细胞(湖北省重点实验室提供)以沉默STC2,构建沉默STC2的SGC7901细胞株,分为实验组(STC2-shRNA组)及对照组(SGC7901组),并用蛋白质印迹法(Western blot)验证沉默STC2效果.构建裸鼠胃癌模型:选取6～8周龄雌性裸鼠36只(购自武汉大学动物实验中心),实验组及对照组各18只.经胃前壁大弯侧直接注射胃癌细胞SGC7901悬液接种构建鼠胃癌转移模型.接种后两组裸鼠成瘤数量、瘤体大小及重量比较采用t检验;两组裸鼠腹腔各脏器成瘤率、抑瘤率、裸鼠生存时间、存活率、生命延长率等比较采用x2检验,最后Western blot检测两组胃癌肿瘤的血管内皮生长因子-C(VEGF-C)、白细胞介素-10(IL-10)蛋白表达水平.结果 Western blot实验显示,沉默STC2基因后,实验组细胞STC2蛋白量的表达较对照细胞明显减少,说明STC2沉默成功.接种8～15d后裸鼠均有肿瘤生长,术区可触及质硬且活动不良结节.STC2-shRNA组裸鼠瘤体(0.76±0.14) mm3、重量(1.23±0.14)g、数目(5.25±1.17)个,与SGC7901组[(3.61 ±0.44) mm3、(3.98±0.21)g、(18.65±2.39)个]比较,差异有统计学意义(t=2.364、3.022、2.523,P＜0.05).STC2-shRNA组裸鼠胃、肝脏、脾、肾、肠及肠系膜、腹膜的成瘤率依次为50.0％、33.3％、11.1％、16.7％、22.2％、5.6％,SGC7901组成瘤率依次为100.0％、100.0％、55.6％、67.7％、72.2％、67.7％,STC2-shRNA组抑瘤率达到69.1％,两组各指标比较差异有统计学意义(x2=5.464、5.995、7.281、5.462、9.826,P＜0.05);STC2-shRNA组组裸鼠存活时间上明显延长,30 d后裸鼠存活14只,存活率77.8％,生命延长率达到64.5％,差异有统计学意义(x2=6.044,P＜0.05).免疫组织化学结果显示,STC2-shRNA组VEGF-C、IL-10蛋白蛋白表达水平明显弱于胃癌细胞组,抑瘤率分别达到70.7％、71.4％.结论 沉默STC2后的胃癌细胞SGC7901侵袭转移潜能下降,提示STC2可能有促进胃癌发生侵袭转移的作用.

摘要： 目的:构建猪活化转录因子6-短发夹RNA(ATF6-shRNA)重组腺病毒干扰载体,观察其对猪瓣膜间质细胞(VIC)增殖与凋亡的影响. 方法:针对猪ATF6序列设计3个shRNA干扰靶点,构建质粒,包装后进行病毒扩增,使用腺病毒转染VIC,通过定量PCR检测腺病毒对VIC中ATF6的干扰效率,通过Western blot法测定下调ATF6后VIC中胱天蛋白酶(caspase)-3的表达情况,并通过CCK-8法检测VIC增殖情况. 结果:成功构建靶向ATF6的shRNA重组腺病毒载体.腺病毒转染VIC后,腺病毒对VIC中ATF6干扰效率提高;而ATF6、caspase-3表达显著降低;自第2天起VIC存活率升高,差异均有统计学意义(P均＜0.05). 结论:成功构建靶向ATF6的shRNA重组腺病毒载体,通过降低VIC中ATF6的表达水平,减少VIC凋亡并促进细胞存活.

摘要： 目的 探讨PTEN基因过表达对大鼠骨髓来源间充质干细胞(BMSCs)迁移的影响.方法 构建PTEN过表达的重组腺病毒载体,病毒扩增后,感染BMSCs,并设阴性对照组(Ad),感染48 h后,荧光定量PCR和western blot分别检测细胞中PTEN mRNA和蛋白水平的表达变化.同时,通过划痕实验检测PTEN基因过表达后,BMSCs迁移的变化.结果 重组腺病毒载体经酶切鉴定证明构建正确.PTEN基因过表达后,BMSCs迁移受到明显抑制.结论 体外实验证明,PTEN基因过表达后,BMSCs迁移受到明显抑制,为深入研究PTEN基因对BMSCs的迁移机制奠定一定的基础.

摘要： 目的:构建并鉴定可稳定抑制miR-327表达的重组腺病毒载体。方法:根据miR-327成熟体反向互补序列,合成寡核苷酸链,构建抑制miR-327表达的质粒载体,并对阳性克隆子进行测序鉴定。miR-327shRNA重组质粒载体经包装、扩增、纯化获得miR-327shRNA重组腺病毒,测定滴度。结果:获得最终滴度为1×1011 PFU/mL的大鼠miR-327shRNA重组腺病毒载体。结论:成功构建具备一定滴度的大鼠miR-327shRNA重组腺病毒载体,为后期揭示miR-327在心血管疾病中的作用及机制提供了基础。

摘要： 目的:构建并鉴定可稳定抑制miR-327表达的重组腺病毒载体.方法:根据miR-327成熟体反向互补序列,合成寡核苷酸链,构建抑制miR-327表达的质粒载体,并对阳性克隆子进行测序鉴定.miR-327 shRNA重组质粒载体经包装、扩增、纯化获得miR-327 shRNA重组腺病毒,测定滴度.结果:获得最终滴度为1×1011 PFU/mL的大鼠miR-327 shRNA重组腺病毒载体.结论:成功构建具备一定滴度的大鼠miR-327 shRNA重组腺病毒载体,为后期揭示miR-327在心血管疾病中的作用及机制提供了基础.

摘要： 目的:构建携带ephrinA1-caspase-3基因的重组腺病毒载体,通过包装、扩增、鉴定,为后续开展目的基因靶向治疗乳腺癌研究奠定基础.方法:以pMD18T-Casp3、pMD18T-EphrinA1为模板扩增caspase-3、EphrinA1基因,以pET28a为载体,通过双酶切、连接、转化、测序鉴定,构建pET28a-EphrinA1-Casp3.然后以质粒pEC3.1(+)为载体,获得pEC3.1-EphrinA1-Casp3.采用LR体外同源重组,构建pAd-EphrinA1-Casp3,以HEK293包装和放大培养.结果:成功将PCR扩增的EphrinA1胞外端基因和人活性型caspase-3基因定向克隆入质粒pET28a,并将EphrinA1-caspase-3融合基因转移到穿梭质粒pEC3.1(+),获得pEC3.1-EphrinA1-Casp3载体;经过体外同源重组,成功构建携带EphrinA1-caspase-3基因的重组腺病毒载体pAd-EphrinA1-Casp3;并在HEK 293细胞中完成包装和扩增;获得重组腺病毒rAd-EphrinA1-Casp3.结论:利用GatewayTM技术成功构建重组腺病毒载体pAd-EphrinA1-Casp3,经HEK293细胞包装,获得重组腺病毒rAd-EphrinA1-Casp3.

摘要： 目的 构建人 Bcl2 拮抗1(Bak1)基因重组表达腺病毒 pAd-Bak1,并感染人成骨肉瘤细胞MG63建立过表达Bak1的细胞模型,检测其对细胞活性的影响.方法 利用qPCR扩增Bak1全长cDNA,利用穿梭质粒pENTER构建载有Bak1基因的重组穿梭质粒pENTER -Bak1,通过基因测序鉴定载体序列.将重组载体PmeⅠ线性化、脱磷酸化后,转入含有腺病毒骨架质粒pAd-Amp的感受态BJ5183细胞中进行基因同源重组.将重组腺病毒质粒pAD-Bak1经PacⅠ酶切线性化后,用Lipofectamine 2000脂质体转染到HEK-293细胞中进行包装扩繁,荧光定量PCR法测定病毒滴度.感染MG63细胞,qPCR和Western blot检测Bak1的表达,MTT检测细胞活性.结果 测序及酶切验证 pENTER-Bak1构建成功. pAD-Bak1 感染MG63 细胞,qPCR检测到细胞中Bak1基因过表达(与NC对照组和空白对照组相比P＜0.01、P＜0.01),Western blot检测到细胞中Bak1蛋白过表达. MTT检测显示与 NC对照组相比,细胞活性减弱(P＜0.05).结论 成功构建了Bak1重组表达腺病毒,验证了其能够感染MG63细胞表达Bak1蛋白,证明了过表达Bak1可以减弱细胞的活性.为进一步研究Bak1的功能奠定了基础.%Objective To construct a recombinant BCL2-antagonist/killer 1 (Bak1)-expressed adenovirus , thus to establish a cell model by infecting human osteosarcoma MG 63 cells, and to study the effect of recombinant Bak 1 adenovirus on MG63 cells.Methods The full-length cDNA of Bak1 was prepared through qPCR .Plasmid pENTER-Bak1 containing Bak1 gene was constructed by using adenovirus shuttle plasmid pENTER , and the sequence was identified by restriction enzyme digestion method .After linearized by Enzyme digestion of Pme I , it was recombined with BJ5183 cells which contained adenoviral back -bone plasmid pAd -Amp.The recombinant adenovirus vector was linearized by Pac I enzyme and transfected into HEK -293 cell.Bak1 recombinant adenovirus was extracted by repeated centrifugation and low temperature cracking .Real -time PCR was applied to measure the adenovirus titer .MG63 cells were infected with recombinant adenovirus .The expression of Bak1 was assessed with qPCR and Western blot .The cell activity was de-termined by MTT.Results It was proved by gene sequencing and enzyme digestion that pENTER -Bak1 was successful-ly constructed.The expression of Bak1 gene was confirmed by qPCR , and the expression of Bak1 protein was confirmed by Western blot.MTT showed that the recombinant expression of Bak 1 adenovirus could weaken the viability of MG 63 cells. Conclusion Bak1 recombinant adenovirus vector is successfully constructed , and the recombinant adenovirus vector could infect MG63 cells and express Bak1 protein.Bak1 adenovirus could weaken the viability of MG 63 cells.

摘要： 目的 构建大鼠shRNA-TRPC4重组腺病毒载体并观察其在大鼠内皮祖细胞(EPCs)中的转染效率.方法 针对大鼠TRPC4序列设计4个RNA干扰靶点序列并合成双链DNA oligo,连接入干扰载体后转入大肠杆菌感受态细胞,培养后挑取转化子进行PCR鉴定及测序比对.利用Admax包装系统获得重组腺病毒Ad-shRNA-TRPC4小量扩增并测定病毒滴度,检测重组腺病毒对TRPC4表达的影响,最后将获得的重组腺病毒转染EPCs,在荧光显微镜下观察并用流式细胞仪测定其转染效率.结果 4组干扰质粒经培养后的转化子中均有阳性克隆,且阳性克隆与设计的干扰靶点序列一致;4组目的质粒均可抑制TRPC4蛋白的表达,合成的Ad-shRNA-TRPC4病毒滴度为5×1010 ifu/mL;倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测重组腺病毒在大鼠EPCs的转染效率分别为(85.47±2.05)％和(67.27±2.94)％.结论 本实验成功构建Ad-shRNA-TRPC4载体,其在EPCs的转染效率高.

摘要： 目的 观察重组腺病毒载体Ad-Nucleolin-SiRNA联合表柔比星对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的抑制作用.方法 构建重组腺病毒载体Ad-Nucleolin-SiRNA,鉴定后将质粒转染HEK293A细胞,得到Nucleoli-SiRNA重组腺病毒.病毒体外转染MCF-7细胞,采用Western Blot检测Nucleolin蛋白的表达情况.将细胞分正常细胞、 表柔比星、Ad-SiRN-、Ad-Nucleolin-SiRNA、 表柔比星+Ad-SiRN-、 表柔比星+Ad-Nucleolin-SiRNA共6组,MTT法检测6组细胞的增殖能力.结果 酶切和测序鉴定均证实重组腺病毒载体Ad-Nucleolin-SiRNA构建成功,插入序列正确无误.Western Blot检测结果显示,转染Nucleolin-SiRNA的MCF-7细胞核仁素表达明显受到抑制.与其他各组比较,应用Ad-Nucleolin-SiRNA联合表柔比星能明显抑制MCF-7细胞的增殖(P<0.01).结论 重组腺病毒载体Ad-Nucleolin-SiRNA能增强表柔比星抑制人乳腺癌细胞MCF-7增殖的能力.

摘要： 目的:构建人RNA结合蛋白(QKI6)基因的重组腺病毒载体,并在心肌细胞中表达.方法:利用PCR技术,从原始质粒中扩增出QKI6目的基因片段,酶切后连接到pShuttle-GFP-CMV重组穿梭质粒上.再将pShuttle-GFPQKI6转移到pAdxsi载体上,得到带有QKI6目的基因及GFP荧光指针的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-QKI6.酶切、PCR鉴定重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-QKI6,并完成扩增与纯化.经Pacl线性化后,转染HEK 293细胞进行腺病毒包装,并测定病毒的滴度及目的基因的表达.以包装好的重组腺病毒感染大鼠新生心肌细胞,通过GFP表达观察病毒感染效率.用PCR检测目的基因QKI6在感染的心肌细胞中的表达.结果:含QKI6基因及GFP荧光指针的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-QKl6构建成功,酶切、PCR鉴定及DNA测序证实了其正确性.重组腺病毒可重复感染HEK 293细胞,荧光显微镜下可见GFP表达,且QKI6基因的表达明显升高.包装的重组腺病毒可有效感染新生心肌细胞,并表达目的基因Qm6.结论:成功地构建QKI6基因重组腺病毒载体,以其感染293细胞及新生心肌细胞后,可有效地表达QKI6基因,为进一步研究QKI6基因在糖尿病心肌细胞凋亡的机制以及在糖尿病性心肌病治疗中的应用奠定实验基础.

摘要： 本研究观察携带X染色体连锁凋亡抑制蛋白基因的重组腺病毒载体(Ad-XIAP)感染C57BL/6J老年鼠听皮层与小鼠听力的相关性。

摘要： 研究ApoA-I对于脂多糖(LPS)诱导的小鼠系统性炎症和多器官损伤的保护作用。用重组腺病毒载体(AdV-AI)建立了人ApoA-I基因过表达的小鼠模型。组织形态学检查显示，给予AdV-AI显著降低了LPS诱导的小鼠急性肺、肾损伤。AdV-AI治疗还显著抑制了LPS诱导的血浆中和肺灌洗液中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-6、IL-1β(血浆中分别为P<0.01、P<0.05、P<0.05，肺灌洗液中均为P<0.05)，AdV-AI能降低血浆中肌酐激酶和肌酸水平(分别为P<0.05)。AdV-AI治疗能显著降低由LPS诱导的肝和肺中CD14表达的增加(分别为P<0.05、P<0.01)。小鼠体内腺病毒介导的ApoA-I过表达对LPS诱导的系统性炎症和多器官损伤具有保护作用。此作用可能部分由于抑制炎症细胞因子的释放和降低CD14的表达。

摘要： 下肢深静脉血栓是血管外科常见病、多发病，可能导致股青肿、血栓后综合征以及严重的肺栓塞，是危害人类健康和影响生活质量的疾病。近年，随着腔内血管外科技术的飞速发展，ATD消融，超声消融，Oasis吸栓术，straub消融术等腔内介入治疗技术相继在该病的治疗中得到广泛应用，这些方法对7天之内的急性期血栓疗效较好，但对于慢性期血栓，不论介入、手术取栓还是药物溶栓都难以获得很好效果，仍然存在较高的血栓后综合征的发生率，其症状的改善还是靠其漫长的自身机化和再通过程。因此，这类疾病患者的治疗一直是困扰血管外科医生的难题。本研究目的是利用pAdEasy系统构建携有血管内皮生长因子165(VEGF165)的重组腺病毒载体：Ad-VEGF165。Ficoll法分离骨髓单个核细胞，EBM-2MV培养基培养扩增大鼠骨髓源性EPCs并对其进行鉴定。观察EPCs体外培养特点和生物学特性。rn Ad-VEGF165体外转染兔EPCs，并观察细胞内VEGF蛋白表达情况及Ad-VECF165对EPCs的生长影响。转染Ad-VEGFl65的EPCs移植于慢性深静脉血栓模型，观察基因转染组在促进血栓机化和再通方面是否优于未转染组及空白对照组。rn 本研究成功地构建了携带VEGF165基因的重组腺病毒载体。通过Ficoll法分离骨髓单个核细胞，EBM-2MV培养基成功培养扩增大鼠骨髓源性EPCs，培养的EPCs生长状态良好，增殖活性强，并能保持内皮细胞特性。rn Ad-VEGF165能有效转染EPCs，并有较强的促EPC:增殖和分化的能力，基因在细胞内和细胞外均能有效表达。转染VEGF165能促进移植EPCs在血栓局部存活，并能改EPCs质量，能明显促进血拴新生血管生成，加快血栓机化和再通，较单独EPCs移植具有更大的优越性。

摘要： 本发明公开了重组溶瘤腺病毒、用于制备该重组溶瘤腺病毒的重组溶瘤腺病毒载体及其构建方法和应用，所述重组溶瘤腺病毒载体的构建方法包括以下步骤：在腺病毒质粒中引入编码RGD肽的基因，构成靶向性骨架质粒；将shRNA抗肿瘤干细胞标志分子ALDH1A1的基因序列以及促凋亡基因PUMA的基因序列连接至第一穿梭质粒，构成第二穿梭质粒；将人端粒逆转录酶启动子连接至第二穿梭质粒，构成第三穿梭质粒；将第三穿梭质粒与靶向性骨架质粒在大肠杆菌中重组为重组溶瘤腺病毒载体；该方法构建出的重组溶瘤腺病毒载体线性化后转染至病毒包装细胞中进行包装、扩增、纯化后获得重组溶瘤腺病毒，从而能够有效的识别并杀死多种恶性肿瘤的肿瘤干细胞和普通肿瘤细胞。

摘要： 本发明公开了重组溶瘤腺病毒、用于制备该重组溶瘤腺病毒的重组溶瘤腺病毒载体及其构建方法和应用，所述重组溶瘤腺病毒载体的构建方法包括以下步骤：在腺病毒质粒中引入编码RGD肽的基因，构成靶向性骨架质粒；将shRNA抗肿瘤干细胞标志分子ALDH1A1的基因序列以及促凋亡基因PUMA的基因序列连接至第一穿梭质粒，构成第二穿梭质粒；将人端粒逆转录酶启动子连接至第二穿梭质粒，构成第三穿梭质粒；将第三穿梭质粒与靶向性骨架质粒在大肠杆菌中重组为重组溶瘤腺病毒载体；该方法构建出的重组溶瘤腺病毒载体线性化后转染至病毒包装细胞中进行包装、扩增、纯化后获得重组溶瘤腺病毒，从而能够有效的识别并杀死多种恶性肿瘤的肿瘤干细胞和普通肿瘤细胞。

摘要： 本发明提供一种构建重组腺病毒载体的方法，用C亚型人腺病毒基因组的E4基因序列改造AdC6的E4基因序列以提高重组腺病毒产量。以本发明的方法可构建得到非复制型腺病毒载体，可用作疫苗载体，实验证明可在其E1/E3/E4/Fiber/Hexon等区域插入外源基因，用于疫苗开发或基因治疗。以本发明的方法还可构建得到条件复制型腺病毒载体，即溶瘤病毒载体，并可在其△E3或E1或E4等区域插入了各种促进溶瘤的外源基因以增强溶瘤作用：实验证明所得重组溶瘤病毒可在多种肿瘤细胞中复制，并裂解肿瘤细胞；动物实验中重组溶瘤病毒都可有效抑制肿瘤进展，甚至清除肿瘤，表明其具有治疗肿瘤的潜力，可进一步向临床推进。

摘要： 本发明公开了一种表达非洲猪瘟病毒p72、B602L蛋白的重组腺病毒载体、重组腺病毒及构建方法，该重组腺病毒感染细胞后可以同步表达非洲猪瘟p72、B602L蛋白，B602L通过自裂解2A信号肽与p72串联表达。本发明构建了能同时表达p72、B602L蛋白的重组腺病毒载体，使用该载体与腺病毒骨架系统共转染细胞后获得可表达非洲猪瘟病毒p72、B602L蛋白的重组腺病毒，使用该重组腺病毒免疫试验动物后可以刺激试验动物产生特异性的抗体，为非洲猪瘟疫苗的开发提供了新的试验数据。

摘要： 本发明公开了一种表达非洲猪瘟病毒p34基因的重组腺病毒载体、重组腺病毒、方法及应用，其中，所述表达非洲猪瘟病毒p34基因的重组腺病毒载体包括腺病毒骨架载体和插入腺病毒骨架载体多克隆位点的非洲猪瘟病毒p34基因，所述p34基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述腺病毒骨架载体为pAd5；其中，所述重组腺病毒由本发明所公开的重组腺病毒载体转染哺乳动物细胞所获得。本发明首次利用重组腺病毒表达系统表达非洲猪瘟病毒的p34蛋白，实现了p34蛋白的高水平表达，为非洲猪瘟病毒核酸疫苗的研制提供了病毒模型，为进一步开发基因工程疫苗奠定了基础。

摘要： 本发明提供了一种表达非洲猪瘟病毒EP402R基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法，属于基因工程技术领域。本发明提供一种表达EP402R基因重组腺病毒质粒pAD‑EP402R，以pAD‑EF1α‑GFP腺病毒表达载体为基础，在多克隆位点处引入EP402R基因。本发明还提供了表达EP402R基因的重组腺病毒的制备方法，利用构建得到的pAD‑EP402R质粒与腺病毒包装体系PEI混合，实现腺病毒包装过程，得到能够直接感染真核细胞的重组腺病毒，从而实现了EP402R基因在真核细胞中正常表达的目的，为研究表达EP402R基因重组腺病毒载体候选疫苗奠定基础。

摘要： 本发明提供了一种表达非洲猪瘟病毒EP153R基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法，属于基因工程技术领域。该方法利用腺病毒穿梭载体 pKO‑FH、pAD‑EF1a‑GFP，经一系列中间过程，得到重组腺病毒表达质粒pAD‑EP153R。将最后得到的线性化重组腺病毒载体质粒转染 HEK293 细胞；根据腺病毒感染形成的细胞病变筛选重组病毒，最终实现腺病毒包装过程，并通过扩增、浓缩和鉴定得到能够直接感染真核细胞的重组腺病毒，从而实现了EP153R基因在真核细胞中正常表达的目的，为研究基于表达EP153R的腺病毒载体疫苗奠定基础。

摘要： 本发明提供了一种表达非洲猪瘟病毒B646L基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法，属于基因工程技术领域。该方法利用腺病毒穿梭载体pKO‑FH、pAD‑EF1a‑GFP，经一系列中间过程，得到重组腺病毒表达质粒pAD‑B646L。将最后得到的线性化重组腺病毒载体质粒转染HEK293细胞；根据腺病毒感染形成的细胞病变筛选重组病毒，最终实现腺病毒包装过程，并通过扩增、浓缩和鉴定得到能够直接感染真核细胞的重组腺病毒，从而实现了B646L基因在真核细胞中正常表达的目的，为研究基于表达B646L的腺病毒载体疫苗奠定基础。

摘要： 本发明提供了一种表达非洲猪瘟病毒CP204L基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法，属于基因工程技术领域。该方法利用腺病毒穿梭载体pKO‑FH、pAD‑EF1a‑GFP，经一系列中间过程，得到重组腺病毒表达质粒pAD‑CP204L。将最后得到的线性化重组腺病毒载体质粒转染HEK293细胞；根据腺病毒感染形成的细胞病变筛选重组病毒，最终实现腺病毒包装过程，并通过扩增、浓缩和鉴定得到能够直接感染真核细胞的重组腺病毒，从而实现了CP204L基因在真核细胞中正常表达的目的，为研究基于表达CP204L的腺病毒载体疫苗奠定基础。

摘要： 本发明提供了一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法，属于基因工程技术领域。本发明提供一种表达E183L基因重组腺病毒质粒pAD‑E183L，以pAD‑EF1α‑GFP腺病毒表达载体为基础，在多克隆位点处引入E183L基因。本发明还提供了表达E183L基因的重组腺病毒的制备方法，利用构建得到的pAD‑E183L质粒与腺病毒包装体系PEI混合，实现腺病毒包装过程，得到能够直接感染真核细胞的重组腺病毒，从而实现了E183L基因在真核细胞中正常表达的目的，为研究表达E183L基因重组腺病毒载体候选疫苗奠定基础。