增强型绿色荧光蛋白

摘要： 为探寻伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)基因缺失株rPRV-bc-8基因组UL4-UL3基因间区域是否可作为外源基因的插入位点,在实验室已构建的含有增强型绿色荧光蛋白(Enhance Green fluorescent protein,EGFP)基因的转移质粒pMD-US6+7-EGFP-US2的基础上,通过DNA体外分子克隆技术将UL4序列替换左同源臂US6+7序列,UL3序列替换右同源臂US2序列,并将PolyA引入转移质粒,得到转移质粒pMD-UL4-EGFP-UL3。利用脂质体转染法将转移质粒pMD-UL4-EGFP-UL3与亲本毒rPRV-bc-8共转染PK-15细胞,经蚀斑纯化成功得到一株能够稳定表达EGFP基因的重组伪狂犬病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3。通过倒置荧光显微镜观察以及PCR鉴定确定EGFP基因已成功插入到伪狂犬基因组的UL4-UL3之间,并通过细胞传代试验分析得到重组毒的遗传稳定性良好。通过体外增殖试验分析得到重组病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3在细胞内的增殖速度较快,接种后12 h内滴度始终高于亲本毒rPRV-bc-8,接种后40 h达到最高滴度108.3 TCID50/mL,与亲本毒的最高滴度接近,但是最高滴度的出现时间晚于亲本毒,并且在达到平台期后病毒滴度下降的比亲本毒快。通过对病毒培养液中荧光蛋白浓度进行测定,结果显示在接种后56 h时荧光蛋白浓度达到最高值4793.9 ng/mL,之后进入平台期。综上结果表明构建的重组病毒具有良好的遗传稳定性及体外复制能力,并且外源基因EGFP在此位点具有良好的表达效果,为进一步相关重组病毒的构建奠定了基础。

摘要： 目的 构建稳定表达CD63-增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)融合蛋白的膀胱癌细胞株,得到EGFP标记的膀胱癌外泌体,进行外泌体的体外示踪。方法 将CD63基因通过分子克隆插入pLVXEGFP-puro质粒中,构建CD63-EGFP融合蛋白的表达载体。通过慢病毒转染得到稳定表达CD63-EGFP融合蛋白的膀胱癌细胞株,超速离心法提取外泌体,使用透射电子显微镜、粒径分析和Western blot鉴定外泌体。通过共培养的方式检测人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1和人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)对膀胱癌外泌体的摄取情况。结果 构建了稳定表达CD63-EGFP融合蛋白的膀胱癌细胞株,其分泌的外泌体符合外泌体经典特征,并发现SV-HUC-1细胞和PBMC中的单核细胞可在体外摄取膀胱癌外泌体。结论 表达CD63-EGFP融合蛋白的膀胱癌细胞能分泌出荧光外泌体,可用于外泌体的体外示踪。

摘要： 旨在利用显微注射法对早期家蝇(Musca domestica L.)卵注射含有增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的转座子载体,实现活体基因稳定表达并对其进行验证,为开展家蝇基因功能的研究奠定基础.文中自制适用于显微注射家蝇卵的硼硅酸盐玻璃微量注射针,摸索出家蝇卵壳的软化处理条件,以NanojectIII高精度微量注射器为主体构建适用于家蝇的显微注射技术平台;将含有眼部特异表达的3×P3启动子、EGFP的重组质粒PiggyBac-[3xP3]-EGFP与稳定遗传表达辅助质粒pHA3pig helper显微注射到处理过的家蝇卵中,待羽化观察眼部发光情况,检测EGFP的表达及转录水平.结果表明,将家蝇卵在漂白水中漂洗35s时卵的正常孵化率为55％,处理35 s的卵壳其硬度适宜注射且注射针头不易破碎;羽化后的家蝇眼部带有绿色荧光的占比约为3％,通过分子检测,家蝇的DNA和RNA中均扩增出EGFP特异片段,大小为750 bp.通过该技术平台,能够便捷、有效地实现报告基因在家蝇中的稳定表达,建立以家蝇为主体的生物反应器,为后续家蝇基因功能的研究提供一定参考价值.

摘要： 目的 比较四种不同血清型腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)介导增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞(guinea pig scleral fibroblast,GSF)的转染效率及安全性,筛选合适的基因转染载体.方法 原代分离培养GSF并鉴定,利用AAV2、AAV5、AAV8、AAV9介导EGFP基因并按不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)10、100、1000、10000转染GSF,空白对照组加入空白培养基,转染后2 d、3 d、4 d、5 d荧光显微镜下观察GFP表达强度及细胞生长状态,流式细胞术检测细胞转染率及凋亡率,CCK-8法检测细胞活力.结果 AAV感染GSF后2 d各组均可见弱荧光,荧光强度随时间延长及MOI值增大而增强,而AAV9-EGFP组全程弱荧光,空白对照组全程无荧光.转染后5 d,MOI=10000时各组荧光最强,基因转染率组间整体比较,差异具有统计学意义(P0.05).各组在450 nm波长处光密度值与空白对照组比较,差异均无统计学意义(均为P>0.05).结论 AAV8能有效地转染GSF,且对细胞凋亡、细胞活力无明显影响,是安全可行的.

摘要： 猪瘟兔化弱毒疫苗C株是我国自主研发的,用于预防猪瘟(CSF)的最好弱毒活疫苗.然而,现阶段的C株不具备标记功能,无法区分野毒感染与疫苗接种.本研究旨在将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)编码基因插入猪瘟病毒(CSFV)C株将其构建为报告病毒,为C株的基础研究提供病毒示踪工具,同时提供构建标记C株疫苗的方法.本研究中,笔者在CSFV C株中引入EGFP基因,分别构建了表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的报告CSFV rHCLV-EGFP,以及用CSFV强毒Shimen(SM)株Npro基因替换C株Npro基因后再引入EG FP基因的嵌合报告病毒rHCLV-Npro(SM)-EGFP.通过猪瘟抗原ELISA检测,直接观察荧光及Western blot检测EGFP的蛋白表达等方法对拯救的病毒进行鉴定,并在细胞和家兔上评价这两株病毒的生物学特性.结果显示,两株报告病毒的抗原ELISA结果均为阳性;在感染rHCLV-EGFP的细胞中并未观察到绿色荧光也未检测到EGFP蛋白,但在感染rHCLV-Npro(SM)-EGFP的细胞中观察到EGFP的绿色荧光并检测到EGFP蛋白;细胞试验结果表明,两株报告病毒与亲本病毒具有相似的生长特性且遗传稳定;家兔试验发现,rHCLV-Npro(SM)-EGFP保留了C株的在家兔体内的生物学特性,但rHCLV-EGFP失去了C株诱导家兔定型热反应的能力.构建的嵌合报告病毒rHCLV-Npro(SM)-EGFP可以作为C株的报告病毒进行应用:可以对病毒示踪,用于研究C株的复制过程、病毒与细胞的相互作用;同时,该嵌合报告病毒也具备发展为标记C株疫苗的潜力.

摘要： 目的 构建并拯救增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记的EGFP-EV-A71重组病毒.方法 利用重叠PCR技术,以pMD19T-SDLY107全长质粒为模板,将2A蛋白酶识别序列加入到结构蛋白VP4的5'端;以pEGFP-N1质粒作为模板,扩增获得EGFP目的片段,将其插入到上述重组质粒中,得到重组质粒pMD19T-107-EGFP.经酶切和体外转录后,转染横纹肌细胞肉瘤(RD),拯救获得重组病毒EGFP-EV-A71.采用Karber法计算细胞培养半数感染量(CCID50)以测定病毒滴度.利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同时间点的病毒复制水平,并绘制病毒复制曲线,比较重组病毒与母本病毒的复制力有无差异.乳酸脱氢酶(LDH)和细胞增殖(CCK-8)实验分别测定被感染细胞的细胞损伤率和存活率.结果 包含EGFP的重组EV-A71感染性cDNA克隆被成功构建;转染RD细胞后,出现典型的细胞病变并且表达出较强的绿色荧光;重组病毒与母本病毒具有相似的复制动力学特征和致细胞病变效应.结论 成功拯救了EGFP标记的重组病毒EGFP-EV-A71.

摘要： 目的:构建一种能够检测生活饮用水和污水中生物有效性铜离子的微生物报告菌株.方法:首先采用交叉PCR将增强型绿色荧光蛋白与铜离子"外排泵"基因copA的启动子融合构建响应铜离子的CopAp::gfpmut2-pET28a感应元件.然后利用Red重组系统分别敲除野生型大肠杆菌(E.coli)MC4100体内负责外排转运铜离子的基因,并将感应元件转化至突变菌中完成菌株的构建.最后优化出最佳检测条件,并将其初步应用于检测水环境中铜离子.结果:相对野生型菌株,E.coliΔcusA-ΔcopA-ΔcueO突变菌对铜离子的敏感性提高了64倍,从而使报告菌株的荧光信号显著增强,且荧光信号强度与铜离子浓度呈剂量依赖关系;报告菌株的线性检测范围为0.05～2.5μmol/L(0.0032～0.16 mg/L)Cu2+;与原子吸收光谱法相比,其对生活饮用水中0.05 mg/L和1 mg/L铜离子的回收率分别为87.90％和104.37％.结论:本研究构建报告菌株的灵敏度能够有效覆盖国标中针对生活饮用水和污水中铜离子的限制,从而为报告菌株的应用奠定了技术基础.

摘要： 目的:构建一种能够检测生活饮用水和污水中生物有效性铜离子的微生物报告菌株。方法:首先采用交叉PCR将增强型绿色荧光蛋白与铜离子“外排泵”基因copA的启动子融合构建响应铜离子的CopAp::gfpmut2-pET28a感应元件。然后利用Red重组系统分别敲除野生型大肠杆菌(E.coli)MC4100体内负责外排转运铜离子的基因,并将感应元件转化至突变菌中完成菌株的构建。最后优化出最佳检测条件,并将其初步应用于检测水环境中铜离子。结果:相对野生型菌株,E.coliΔcusA-ΔcopA-ΔcueO突变菌对铜离子的敏感性提高了64倍,从而使报告菌株的荧光信号显著增强,且荧光信号强度与铜离子浓度呈剂量依赖关系;报告菌株的线性检测范围为0.05~2.5μmol/L(0.0032~0.16 mg/L)Cu2+;与原子吸收光谱法相比,其对生活饮用水中0.05 mg/L和1 mg/L铜离子的回收率分别为87.90%和104.37%。结论:本研究构建报告菌株的灵敏度能够有效覆盖国标中针对生活饮用水和污水中铜离子的限制,从而为报告菌株的应用奠定了技术基础。

摘要： 口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒引起的偶蹄动物的一种急性热性高度接触性传染病：羊痘(capripox,CP)是由绵羊痘病毒和山羊痘病毒引起的绵羊和山羊的一种急性、热性、接触性传染病。口蹄疫和羊痘均因危害严重而被世界动物卫生组织列为A类重大传染病。

摘要： 口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒引起的偶蹄动物的一种急性热性高度接触性传染病：羊痘(capripox,CP)是由绵羊痘病毒和山羊痘病毒引起的绵羊和山羊的一种急性、热性、接触性传染病。口蹄疫和羊痘均因危害严重而被世界动物卫生组织列为A类重大传染病。

摘要： 口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒引起的偶蹄动物的一种急性热性高度接触性传染病：羊痘(capripox,CP)是由绵羊痘病毒和山羊痘病毒引起的绵羊和山羊的一种急性、热性、接触性传染病。口蹄疫和羊痘均因危害严重而被世界动物卫生组织列为A类重大传染病。

摘要： 口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒引起的偶蹄动物的一种急性热性高度接触性传染病：羊痘(capripox,CP)是由绵羊痘病毒和山羊痘病毒引起的绵羊和山羊的一种急性、热性、接触性传染病。口蹄疫和羊痘均因危害严重而被世界动物卫生组织列为A类重大传染病。

摘要： 口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒引起的偶蹄动物的一种急性热性高度接触性传染病：羊痘(capripox,CP)是由绵羊痘病毒和山羊痘病毒引起的绵羊和山羊的一种急性、热性、接触性传染病。口蹄疫和羊痘均因危害严重而被世界动物卫生组织列为A类重大传染病。

摘要： 目的:研究新型免疫荧光检测试剂SPA-EGFP在免疫诊断中的应用表现.方法:(1)将SPA-EGFP代替EUROIMMUN抗核抗体检测试剂盒中的FITC标记的羊抗人IgG抗体,通过间接免疫荧光法检测已确诊为系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)的病人血清,并与使用FITC-IgG获得的荧光图像进行对比;(2)用SPA-EGFP代替EUROIMMUN抗肺炎支原体IgG抗体检测试剂盒中的FITC标记的羊抗人IgG抗体,通过间接免疫荧光法检测试剂盒自带的阳性血清,并与使用FITC-IgG获得的荧光图像进行对比;(3)用SPA-EGFP代替FITC标记的羊抗人IgG抗体,通过直接免疫荧光法检测天疱疮患者病损周围正常皮肤的冰冻组织切片.结果:使用SPA-EGFP获得的荧光模型与使用FITC标记的羊抗人IgG抗体的结果相同,并且灵敏度较其为高,荧光更强且稳定.结论: SPA-EGFP作为一种新型免疫荧光检测试剂在免疫诊断中的应用是可行的,并且初步体现了其相对传统荧光检测试剂的优势,本研究为其推广应用提供了实验依据.

摘要： 目的:研究新型免疫荧光检测试剂SPA-EGFP在免疫诊断中的应用表现.方法:(1)将SPA-EGFP代替EUROIMMUN抗核抗体检测试剂盒中的FITC标记的羊抗人IgG抗体,通过间接免疫荧光法检测已确诊为系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)的病人血清,并与使用FITC-IgG获得的荧光图像进行对比;(2)用SPA-EGFP代替EUROIMMUN抗肺炎支原体IgG抗体检测试剂盒中的FITC标记的羊抗人IgG抗体,通过间接免疫荧光法检测试剂盒自带的阳性血清,并与使用FITC-IgG获得的荧光图像进行对比;(3)用SPA-EGFP代替FITC标记的羊抗人IgG抗体,通过直接免疫荧光法检测天疱疮患者病损周围正常皮肤的冰冻组织切片.结果:使用SPA-EGFP获得的荧光模型与使用FITC标记的羊抗人IgG抗体的结果相同,并且灵敏度较其为高,荧光更强且稳定.结论: SPA-EGFP作为一种新型免疫荧光检测试剂在免疫诊断中的应用是可行的,并且初步体现了其相对传统荧光检测试剂的优势,本研究为其推广应用提供了实验依据.

摘要： 目的:研究新型免疫荧光检测试剂SPA-EGFP在免疫诊断中的应用表现.方法:(1)将SPA-EGFP代替EUROIMMUN抗核抗体检测试剂盒中的FITC标记的羊抗人IgG抗体,通过间接免疫荧光法检测已确诊为系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)的病人血清,并与使用FITC-IgG获得的荧光图像进行对比;(2)用SPA-EGFP代替EUROIMMUN抗肺炎支原体IgG抗体检测试剂盒中的FITC标记的羊抗人IgG抗体,通过间接免疫荧光法检测试剂盒自带的阳性血清,并与使用FITC-IgG获得的荧光图像进行对比;(3)用SPA-EGFP代替FITC标记的羊抗人IgG抗体,通过直接免疫荧光法检测天疱疮患者病损周围正常皮肤的冰冻组织切片.结果:使用SPA-EGFP获得的荧光模型与使用FITC标记的羊抗人IgG抗体的结果相同,并且灵敏度较其为高,荧光更强且稳定.结论: SPA-EGFP作为一种新型免疫荧光检测试剂在免疫诊断中的应用是可行的,并且初步体现了其相对传统荧光检测试剂的优势,本研究为其推广应用提供了实验依据.

摘要： 目的:研究新型免疫荧光检测试剂SPA-EGFP在免疫诊断中的应用表现.方法:(1)将SPA-EGFP代替EUROIMMUN抗核抗体检测试剂盒中的FITC标记的羊抗人IgG抗体,通过间接免疫荧光法检测已确诊为系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)的病人血清,并与使用FITC-IgG获得的荧光图像进行对比;(2)用SPA-EGFP代替EUROIMMUN抗肺炎支原体IgG抗体检测试剂盒中的FITC标记的羊抗人IgG抗体,通过间接免疫荧光法检测试剂盒自带的阳性血清,并与使用FITC-IgG获得的荧光图像进行对比;(3)用SPA-EGFP代替FITC标记的羊抗人IgG抗体,通过直接免疫荧光法检测天疱疮患者病损周围正常皮肤的冰冻组织切片.结果:使用SPA-EGFP获得的荧光模型与使用FITC标记的羊抗人IgG抗体的结果相同,并且灵敏度较其为高,荧光更强且稳定.结论: SPA-EGFP作为一种新型免疫荧光检测试剂在免疫诊断中的应用是可行的,并且初步体现了其相对传统荧光检测试剂的优势,本研究为其推广应用提供了实验依据.

摘要： 目的:研究新型免疫荧光检测试剂SPA-EGFP在免疫诊断中的应用表现.方法:(1)将SPA-EGFP代替EUROIMMUN抗核抗体检测试剂盒中的FITC标记的羊抗人IgG抗体,通过间接免疫荧光法检测已确诊为系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)的病人血清,并与使用FITC-IgG获得的荧光图像进行对比;(2)用SPA-EGFP代替EUROIMMUN抗肺炎支原体IgG抗体检测试剂盒中的FITC标记的羊抗人IgG抗体,通过间接免疫荧光法检测试剂盒自带的阳性血清,并与使用FITC-IgG获得的荧光图像进行对比;(3)用SPA-EGFP代替FITC标记的羊抗人IgG抗体,通过直接免疫荧光法检测天疱疮患者病损周围正常皮肤的冰冻组织切片.结果:使用SPA-EGFP获得的荧光模型与使用FITC标记的羊抗人IgG抗体的结果相同,并且灵敏度较其为高,荧光更强且稳定.结论: SPA-EGFP作为一种新型免疫荧光检测试剂在免疫诊断中的应用是可行的,并且初步体现了其相对传统荧光检测试剂的优势,本研究为其推广应用提供了实验依据.

摘要： 本发明涉及一种携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体及其构建方法，以南瓜花叶病毒基因组RNA2所对应的侵染性克隆pSqMV‑RNA2为模板，将增强型绿色荧光蛋白报告基因插入到MP和LCP之间，获得pSqMV‑RNA2‑EGFP重组载体，该载体可与南瓜花叶病毒基因组RNA1所对应的侵染性克隆pSqMV‑RNA1一起通过农杆菌共浸润的方法接种甜瓜，获得能够表达增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒。本发明为研究该病毒的侵染过程、揭示该病毒的种传机制提供了新的方法和手段，也为其他外源基因的表达或应用多肽的大量获得特供了新的工具。

摘要： 本发明提供了一种比EGFP更增强型的绿色荧光蛋白GFPspark，其特征在于由SEQ.ID.NO：13所示EGFP的氨基酸序列中包含了Q81K，V164A，I168V这3个位点的突变。本发明还提供了编码所述蛋白质的多核苷酸序列SEQ.ID.NO：6。本发明中增强型绿色荧光蛋白的荧光亮度比EGFP强1.25倍，蛋白成熟速度比EGFP快2.1倍，光成熟速度比EGFP强1.2倍。该增强型荧光蛋白可应用于多个领域的研究，例如作为监测活细胞内基因表达、蛋白定位、细胞分化发育的良好标记。用GFPSpark融合目的蛋白基因的表达可以获得更明显的亮度照片，更易于目的蛋白表达的定位和相互作用。

摘要： 本发明涉及一种携带增强型绿色荧光蛋白标记的转基因家兔及其构建方法，转基因家兔表达的EGFP标记家兔个体的全部细胞，在蓝色光激发下发出绿色荧光，这种显著的遗传标记的样本用于区分非标记样本。其构建方法是：将启动子优化的重组EGFP编码基因导入家兔受精卵中，获得EGFP转基因兔；对仔兔进行EGFP基因检测或绿色荧光检测，阳性为首建兔。首建兔与正常家兔杂交，可得到遗传稳定的EGFP转基因兔品系，建系的家兔组织和培养细胞均被激发出绿色荧光。本发明通过优化启动子序列，应用EGFP制作出了转基因家兔，EGFP标记的家兔可提供从宏观(个体)到微观(细胞)层次的直观可见的显著生物标记样本。

摘要： 本发明涉及植物病理学技术领域，具体涉及一种增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法及其菌株和应用。本发明提供的一种增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法构建了mig2－5－1启动子调控EGFP表达的载体PHD3－mig2－5－1－EGFP，利用原生质体遗传转化法将载体转入玉米丝黑穗菌内，并且采用PCR方法和荧光检验可以发现mig2－5－1启动子能诱导EGFP在菌株中获得大量且高效地荧光表达，同时能稳定地遗传表达。本发明提供的增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株，能够用于抗玉米丝黑穗病的玉米品种的筛选与鉴定方面，鉴定结果可靠，操作方便，简单易行，鉴定周期短，不受环境影响，重复性高。

摘要： 本发明公开了一种表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的鸭瘟病毒重组疫苗株及其构建方法和应用。具体地，本发明利用重组克隆技术，将包含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和CMV启动子序列的基因片段CMV‑EGFP替换鸭瘟病毒的US10基因，构建获得缺失US10基因并在其相应位置插入CMV‑EGFP表达盒的重组EGFP鸭瘟病毒，该重组病毒能够稳定表达EGFP基因。本发明的一种鸭瘟病毒重组疫苗株，命名为rDEVUS10‑EGFP，微生物保藏号是：CGMCC No.8660。本发明还涉及构建稳定表达其他禽类病原外源基因的重组鸭瘟病毒疫苗株的方法，以及重组鸭瘟病毒疫苗株在制备预防鸭瘟和其他禽类传染病的疫苗中的应用。

摘要： 本发明涉及基因敲入技术领域，特别是公开了一种选育斑马鱼心脏组织特异表达增强型绿色荧光蛋白敲入实验模型构建及其应用的方法。利用DNA双链断裂引起的同源重组修复机制，建立基于CRISPR/Cas9基因编辑技术斑马鱼心脏组织特异表达增强型绿色荧光蛋白敲入实验模型（vmhcEGFP‑KI模型）。本发明一方面能精确反映内源性vmhc时空表达模式及水平，有助于直接观察胚胎发育过程中心脏的位置和形态；另一方面，基于vmhc心室特异表达与心脏调控因子nkx2.5的调控作用有关，本发明建立斑马鱼敲入实验模型能反映出nkx2.5的表达水平，这将能应用于心脏疾病相关药物筛选及作用机理探究，在医学上对疾病发生与诊疗方案研究具有深远意义。

摘要： 本发明涉及一种携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体及其构建方法，以南瓜花叶病毒基因组RNA2所对应的侵染性克隆pSqMV‑RNA2为模板，将增强型绿色荧光蛋白报告基因插入到MP和LCP之间，获得pSqMV‑RNA2‑EGFP重组载体，该载体可与南瓜花叶病毒基因组RNA1所对应的侵染性克隆pSqMV‑RNA1一起通过农杆菌共浸润的方法接种甜瓜，获得能够表达增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒。本发明为研究该病毒的侵染过程、揭示该病毒的种传机制提供了新的方法和手段，也为其他外源基因的表达或应用多肽的大量获得特供了新的工具。

摘要： 本发明涉及植物病理学技术领域，具体涉及一种增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法及其菌株和应用。本发明提供的一种增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法构建了mig2－5－1启动子调控EGFP表达的载体PHD3－mig2－5－1－EGFP，利用原生质体遗传转化法将载体转入玉米丝黑穗菌内，并且采用PCR方法和荧光检验可以发现mig2－5－1启动子能诱导EGFP在菌株中获得大量且高效地荧光表达，同时能稳定地遗传表达。本发明提供的增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株，能够用于抗玉米丝黑穗病的玉米品种的筛选与鉴定方面，鉴定结果可靠，操作方便，简单易行，鉴定周期短，不受环境影响，重复性高。

摘要： 本发明涉及一种携带增强型绿色荧光蛋白标记的转基因家兔及其构建方法，转基因家兔表达的EGFP标记家兔个体的全部细胞，在蓝色光激发下发出绿色荧光，这种显著的遗传标记的样本用于区分非标记样本。其构建方法是：将启动子优化的重组EGFP编码基因导入家兔受精卵中，获得EGFP转基因兔；对仔兔进行EGFP基因检测或绿色荧光检测，阳性为首建兔。首建兔与正常家兔杂交，可得到遗传稳定的EGFP转基因兔品系，建系的家兔组织和培养细胞均被激发出绿色荧光。本发明通过优化启动子序列，应用EGFP制作出了转基因家兔，EGFP标记的家兔可提供从宏观(个体)到微观(细胞)层次的直观可见的显著生物标记样本。

摘要： 本发明提供了一种比EGFP更增强型的绿色荧光蛋白GFPspark，其特征在于由SEQ.ID.NO：13所示EGFP的氨基酸序列中包含了Q81K，V164A，I168V这3个位点的突变。本发明还提供了编码所述蛋白质的多核苷酸序列SEQ.ID.NO：6。本发明中增强型绿色荧光蛋白的荧光亮度比EGFP强1.25倍，蛋白成熟速度比EGFP快2.1倍，光成熟速度比EGFP强1.2倍。该增强型荧光蛋白可应用于多个领域的研究，例如作为监测活细胞内基因表达、蛋白定位、细胞分化发育的良好标记。用GFPSpark融合目的蛋白基因的表达可以获得更明显的亮度照片，更易于目的蛋白表达的定位和相互作用。