稳定表达

摘要： 【目的】通过建立过表达T7 RNA聚合酶(T7 RNA polymerase,T7 RNAP)的慢病毒系统,构建可稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞株。【方法】根据GenBank中公布的大肠杆菌BL21(DE3)基因组中T7 RNAP基因序列(登录号:NZ_CP081489.1)设计引物,并采用PCR扩增T7 RNAP基因片段,将其克隆至慢病毒载体中,构建pCDH-CMV-T7 RNAP重组质粒。筛选阳性克隆及测序鉴定后,利用脂质体将包含重组质粒pCDH-CMV-T7 RNAP的包装系统和辅助包装质粒共转染至HEK-293T细胞,进行慢病毒的包装及纯化,获得高病毒滴度的重组慢病毒。将收集的病毒液分别以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为1、5、10和20感染BHK-21细胞,72 h后观察荧光情况,筛选最佳MOI。将重组慢病毒在最佳MOI条件下感染BHK-21细胞,通过绿色荧光蛋白copGFP的表达观察感染细胞的阳性率。使用4μg/mL嘌呤霉素作为抗性筛选物进行多轮筛选,最终筛选得到BHK-21-T7 RNAP细胞株。进一步对所筛选的细胞株设计3对检测引物进行RT-PCR检测,并通过检测试验组与空白对照组细胞中海肾荧光素酶(hRluc)报告基因的活性差异来反映T7 RNAP驱动T7启动子下游基因的能力。【结果】本研究成功扩增了大肠杆菌BL21(DE3)细胞基因组中T7 RNAP基因,成功构建重组慢病毒载体,并获得了滴度为1.0×10^(8)TU/mL的重组慢病毒。成功筛选到BHK-21-T7 RNAP细胞株,此重组细胞株经RT-PCR扩增能够检测到T7 RNAP的特异性DNA序列。将含有T7启动子驱动的hRluc的质粒(pT7-hRluc)转染此细胞株后发现,BHK-21-T7 RNAP细胞株中hRluc的活力与空白对照组BHK-21细胞相比极显著升高(P<0.01)。【结论】本研究获得了稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞株,且所筛选的BHK-21-T7 RNAP细胞株中的T7 RNAP能够驱动pT7启动子下游基因hRluc的转录,研究结果为RNA病毒的反向遗传学平台建立奠定了细胞基础。

摘要： 目的分别构建稳定表达细胞色素P450家族2亚家族A成员13(cytochrome P450 family 2 subfamily A member 13,CYP2A13)的Flp-In CHO细胞系(CYP2A13-CHO)和稳定表达CYP2A13和细胞色素P450氧化还原酶(POR)的Flp-In CHO细胞系(CYP2A13-POR-CHO),并从中筛选代谢活性较好的细胞系。方法课题组前期通过慢病毒转染构建了稳定表达POR的Flp-In CHO细胞系(POR-Flp-In CHO)。该文构建了pcDNA5/FRT-CYP2A13重组质粒,利用Lipofectamine^(TM) 2000转染试剂将pcDNA5/FRT-CYP2A13重组质粒分别转染到Flp-In CHO细胞和POR-Flp-In CHO细胞中。通过荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western blot和黄曲霉素B1(AFB1)/4-甲基亚硝胺-1-3-吡啶基-1-丁酮(NNK)细胞毒实验来检测CYP2A13的表达及其活性,并比较了CYP2A13-CHO和CYP2A13-POR-CHO两种重组细胞系的代谢活性。结果与未转染的细胞相比,CYP2A13-CHO和CYP2A13-POR-CHO的CYP2A13 mRNA和蛋白的表达量均明显增加。且与CYP2A13-POR-CHO相比,CYP2A13-CHO细胞对AFB1、NNK的敏感度更高。结论建立了稳定表达CYP2A13且代谢活性较好的CYP2A13-CHO细胞系,为后续筛选能被CYP2A13代谢活化的前致癌物提供了工具。

摘要： 为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的间接ELISA检测方法,将构建的GFP基因与CD2v基因串联的重组真核表达质粒pIRES-GFP-CD2v转染CHO-K1细胞,通过嘌呤霉素筛选并结合有限稀释法,筛选稳定表达CD2v的单细胞克隆株。转染细胞经过PCR鉴定后进行扩大培养,收集并纯化细胞培养液,获得目的蛋白,通过Western-blot验证其反应原性。结果表明,ASFV CD2v蛋白在CHO-K1细胞中被成功表达,并能与ASFV抗体阳性血清反应。以纯化的GFP-CD2v重组蛋白为包被抗原建立检测ASFV CD2v蛋白抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定抗原最佳包被质量浓度为1.25μg/mL,待检血清最佳稀释度为1∶100,酶标抗体最佳稀释度为1∶50000,以此建立的ASFVCD2v蛋白的间接ELISA方法临界值为0.31;该方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,而与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒等病毒抗体阳性血清均无交叉反应,表明该方法的特异性较强;用该ELISA方法检测阳性血清敏感性可达1∶1600;批内和批间变异系数均小于10%。结果表明,本试验中建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于ASFV抗体的检测。

摘要： 目的以分子克隆技术建立稳定表达人细胞周期调控蛋白50A(CDC50A)的SKOV3细胞株。方法通过分子克隆技术将CDC50A定向连接到表达载体pLVX-IRES-GFP上。pLVX-CDC50A-GFP表达质粒经慢病毒包装,稳定转染SKOV3,建立稳定表达CDC50A的SKOV3细胞株,通过流式细胞测量术、免疫印迹、免疫荧光分析其Flag标签蛋白表达。结果通过电泳及酶切鉴定证实了pLVX-CDC50A-GFP表达载体的构建,荧光显微镜定性观察病毒感染效率,流式细胞测量术检测感染效率为86.5%,免疫印迹法只检测到pLVX-CDC50A-GFP表达质粒的SKOV3细胞株有Flag标签蛋白表达,阴性对照组无蛋白表达。结论成功构建了CDC50A的表达载体,并通过慢病毒感染建立了过表达CDC50A的SKOV3细胞株,为开展CDC50A在卵巢癌中的机制研究奠定了基础。

摘要： 目的构建稳定表达细胞色素P450家族2亚家族E成员1(CYP2E1)的Flp-In^(TM)CHO细胞系,并进行药物相互作用筛选。方法利用Lipofectamine 2000转染试剂将pcDNA5/FRT-CYP2E1重组质粒和pcDNA5/FRT-空质粒-并转染Flp-In^(TM)CHO细胞,采用潮霉素B(500 mg/L)进行稳定性筛选、聚合酶链式反应(PCR)检测细胞中是否成功插入能够表达CYP2E1酶的目的基因、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中CYP2E1 mRNA和蛋白表达,采用对乙酰氨基酚(APAP)检测CYP2E1酶对APAP的毒性敏感性。结果与Flp-In^(TM)CHO空质粒组比较,PCR结果显示Flp-In^(TM)CHO-CYP2E1细胞分别在2000 bp、200 bp左右有CYP2E1酶目的基因的明显条带;qRT-PCR和Western blot结果显示,Flp-In^(TM)CHO-CYP2E1细胞的CYP2E1 mRNA和蛋白表达水平均明显增加(P<0.001);APAP检测结果显示CYP2E1酶对APAP的毒性敏感性也显著增强。结论成功构建了稳定表达CYP2E1的Flp-In^(TM)CHO细胞模型,且表达的CYP2E1酶对APAP的毒性敏感性增强。

摘要： 目的:构建稳定表达细胞色素P4502A13(CYP2A13)野生型(CYP2A13?1)和5种突变体的Flp-InTM CHO细胞系.方法:构建CYP2A13野生型、各突变体的pcDNA5/FRT重组质粒.将pcDNA5-CYP2A13?1、?2、?5、?6、?8和?9重组质粒分别转染至Flp-InTM CHO细胞中,用实时荧光定量PCR、Western blot和黄曲霉毒素B1(AFB1)细胞毒性实验检测转染细胞中CYP2A13表达量及其活性,筛选稳定表达CYP2A13野生型和各突变体的Flp-InTM CHO细胞.结果:和转染pcDNA5/FRT空质粒的Flp-InTM CHO细胞相比,转染各CYP2A13野生型和各突变体的CHO细胞中CYP2A13 mRNA和蛋白表达水平增加,对AFB1毒性敏感度增加(P<0.05).结论:成功建立了稳定表达CYP2A13?1、?2、?5、?6、?8和?9 Flp-InTM CHO细胞系.

摘要： [背景]禽β防御素6是禽体内分泌的一类抗菌肽,在抵抗病原入侵和免疫调节中发挥着重要作用,但其常规表达方式效率较低,难以在产业化生产中加以应用.[目的]建立稳定表达AvBD6的细胞系,并检测其表达产物对耐药大肠杆菌的抗菌活性,为其他防御素表达提供参考.[方法]利用显微镜观察构建真核重组表达载体pLOV-eGFP-AvBD6转染至293T细胞后的转染效率;收集293T细胞上清液并感染DF-1细胞,通过嘌呤霉素加压筛选稳定表达株;利用RT-PCR和Western Blot分别检测目的基因在转录水平和蛋白水平的表达情况;利用扫描电镜观察细胞培养上清液对耐药大肠杆菌的抗菌效果及其对菌体的损伤.[结果]成功构建重组表达载体pLOV-eGFP-AvBD6,筛选出稳定表达AvBD6的DF-1细胞系,而且目的基因在转录水平和蛋白水平均有表达;细胞培养上清显著降低大肠杆菌和副伤寒沙门菌存活率,对金黄色葡萄球菌的抗菌活性较低.[结论]建立了稳定表达AvBD6的DF-1细胞系,其表达产物对耐药大肠杆菌具有良好的抗菌效果,对推动防御素的应用提供技术支持.

摘要： 旨在建立一株稳定表达禽β防御素2(AvBD2)的细胞系,并检测细胞系分泌产物对耐药菌株的抑制效果.首先,根据同源重组设计方法设计一组含有同源臂的AvBD2基因扩增引物及载体反向扩增引物,将片段连接至pLOV-eGFP真核表达载体,构建真核重组质粒pLOV-eGFP-AvBD2,利用三质粒表达系统将重组质粒与慢病毒包装质粒pSPAX2、外膜质粒pMD2.G共转染293T细胞,收集细胞分泌上清液感染DF-1细胞,嘌呤霉素最适浓度筛选获得阳性克隆细胞系,通过RT-PCR技术和Western Blot方法对该细胞系构建结果加以验证;将细胞系分泌产物与耐药大肠杆菌菌株混合培养后,检测该蛋白抗菌效果,并通过扫描电镜观察菌体的损伤现象.结果表明,已成功构建一种稳定表达AvBD2蛋白的DF-1细胞系,其最适筛选浓度为含有1μg/mL的嘌呤霉素的细胞培养液.该细胞系传递20代后,在mRNA转录水平及蛋白表达水平均验证正确,将细胞系的分泌产物培养耐药大肠杆菌,细菌存活率曲线显示随着培养时间的增加,细胞系上清可明显抑制耐药菌株的增殖,在培养第5小时使供试菌的存活率低于50％.扫描电镜显示供试菌体表面皱缩,存在明显损伤,而对照组菌体光滑饱满.建立了稳定表达AvBD2蛋白的DF-1细胞系,为抗生素替代品的生产制备提供探索方向,同时也为后续评价和研究AvBD2的抗菌作用奠定基础.

摘要： 寻找中国仓鼠卵巢(CHO)细胞染色体上稳定表达位点是解决CHO细胞长期培养表达不稳定问题的有效手段。本课题组前期利用慢病毒转染将示踪基因(Zsgreen1)整合CHO细胞染色体上并发现多个潜在稳定表达位点。本研究验证了其中一个位点稳定表达外源蛋白的能力,该位点位于染色体NW_003614241.1上148052~148157 bp区域。首先观察Zsgreen1基因的表达情况,随后采用CRISPR/Cas9技术将增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因定点整合至该位点,获得3株EGFP基因定点整合的细胞,经60代悬浮培养,细胞荧光强度无明显变化,证明此位点可稳定表达EGFP基因。采用同样方法构建了表达人血清白蛋白(HSA)基因的重组CHO细胞株,经Western blot验证,此位点可分泌表达HSA,表明上述位点可定点整合和稳定表达外源蛋白。

摘要： 为了研究RKIP对新城疫病毒(NDV)复制的影响，从鸡胚成纤维细胞中提取总RNA，采用RT-PCR方法扩增RKIP基因，将其克隆入真核表达载体pEGFP-N1中，经PCR、双酶切和测序鉴定，采用FuGENE HD法将阳性质粒转染Vero细胞，经G418筛选，有限稀释法获取单克隆细胞株，Western blot检测RKIP的表达。利用Real-time PCR测定病毒感染细胞后培养上清的病毒量。结果表明，成功构建鸡RKIP真核表达质粒;转染Vero细胞后经克隆化培养获得稳定表达鸡RKIP的细胞株Vero—RKIP;感染初期，NDV在Vero-RKIP上表现出了更强的复制能力。

摘要： 目的：建立稳定表达乳腺癌耐药蛋白(Breast cancerresistance protein,BCRP)的小鼠成纤维细胞系PA317／BCRP，初步探讨其耐药机制。rn 方法：从乳腺癌耐药细胞系MCF-7／ADR中克隆BCRP基因。将编码序列克隆导入真核表达载体pcDNA3．1，转化感受态E．Coli DH5α，获得重组质粒pcDNA3．1／BCRP，酶切并测序鉴定。用电穿孔法将质粒转染PA317细胞，同时转染pcDNA3．1／EGFP。G418筛选阳性克隆。阳性转染细胞提取细胞总RNA，RT-PCR检测BCRP的mRNA表达，Western blot检测BCRP蛋白表达。MTT法检测耐药克隆PA317／BCRP细胞对米托葸醌(Mitoxantrone，MTZ)耐药性，罗丹明123外排实验验证转染后细胞外排罗丹明123功能。Western blot检测PI3K-AKT信号转导通路下游靶点AKT表达变化。rn 结果：构建质粒pcDNA3．1／BCRP，转染PA317细胞，G418筛选。RT-PCR和Western blot，均检测到细胞中BCRP基因转录及蛋白表达。与空质粒转染细胞、未转染细胞对照组相比，PA317／BCRP细胞对MTZ耐药性增强，且外排罗丹明123能力增强。检测PI3K-AKT途径下游靶点AKT蛋白磷酸化水平在PA317／BCRP细胞内明显增高。rn 结论：rn 1.成功获得稳定表达BCRP的PA317细胞系——PA317／BCRP，经MTT和罗丹明123外排实验证实，其耐药和外排功能增强。rn 2.检测PA317／BCRP细胞PI3K-AKT途径下游靶点AKT的表达，观察到耐药细胞的AKT表达含量明显高于转染空质粒和未转染的PA317细胞。推测BCRP可能通过影响AKT表达上调发挥其耐药作用。

摘要： 目的构建鼠疫杆菌F1抗原结构基因caf1的重组载体pcDNA3.1-hisB-caf1，在NIH3T3细胞中稳定表达，并用表达F1抗原的细胞株作为诊断抗原，探讨间接免疫荧光法(IFA)检测鼠血清中鼠疫杆菌F1抗体的可行性。方法将caf1基因克隆到质粒pCDNA3.1-hisB的多克隆位点上，构建重组载体pcDNA3.1-hisB－caf1，重组载体经脂质体转染至NIH3T3细胞中，G418筛选获得抗性细胞株，并以此细胞株为诊断抗原，IFA检测鼠血清中的F1抗体。结果经IFA证实，pcDNA3.1-hisB－Caf1能在NIH3T3细胞中稳定表达。并能与1例经ELISA检测为F1抗体阳性的鼠血清发生特异性反应。结论NIH3T3细胞稳定表达的F1抗原可作为IFA中的候选抗原，检测鼠血清中的F1抗体。

摘要： 本发明涉及一种基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统及其在真核生物中表达蛋白质的方法。所述稳定T7表达系统包含T7 RNA聚合酶、T7转录单元和病毒加帽酶，所述T7转录单元由T7启动子、T7终止子和目标基因构成。所述方法包括将T7 RNA聚合酶整合到宿主基因组，将T7启动子启动的转录单元构建到载体或基因组，利用病毒加帽酶为T7 RNA聚合酶合成的mRNA加5′Cap结构，帮助T7 RNA聚合酶转录的mRNA运输到细胞质，并在细胞质与核糖体结合，完成翻译和高水平表达目标蛋白质。本发明的基于病毒加帽酶的T7表达系统不随宿主细胞的分裂而丢失，在真核生物中高效稳定地表达外源蛋白。

摘要： 本发明公开了一种CHO细胞高效表达体系，所述的CHO细胞中含有CAG启动子基因‑人干扰素‑α2信号肽基因‑Luc基因的真核表达载体。本发明还公开了一种所述的CHO细胞高效表达体系的筛选方法，所述的方法包括以下步骤：启动子的筛选和信号肽的筛选。本发明还公开了一种所述的CHO细胞高效表达体系在PCV2Cap蛋白表达中的应用，所述的应用是将PCV2Cap蛋白基因替换所述的真核表达载体中的Luc基因。本发明所述的CHO细胞高效表达体系使用时，直接将目的蛋白基因替换Luc基因，即可实现目的蛋白在CHO细胞中稳定高效分泌表达，且使用我们的体系在PCV2Cap蛋白的表达中的应用很成功。

摘要： 本发明提供一种提高真核表达系统表达的ACE2蛋白稳定性的方法，包括：利用真核表达系统表达ACE2蛋白，并纯化ACE2蛋白，向纯化的ACE2蛋白溶液中添加精氨酸，或者，在ACE2蛋白纯化过程中向用于纯化ACE2蛋白的试剂中添加精氨酸。本发明通过向基于真核表达系统制备的ACE2蛋白溶液中添加精氨酸，或在ACE2蛋白纯化过程中引入精氨酸，并从外观澄清度、SEC‑HPLC检测纯度、蛋白收率等方面综合评估真核表达系统所表达的ACE2蛋白的稳定性，结果显示，加入精氨酸后蛋白溶液显著稳定，目测澄清，SEC‑HPLC检测蛋白纯度不变，有利于蛋白冻融，有利于蛋白溶液长期储存，有利于提高蛋白收率。

摘要： 本发明涉及一组稳定高效表达活性融合蛋白的Gateway真核表达系统，其中包括了12xHis‑GFP‑GW(A载体)和12xHis‑GW‑GFP(B载体)两个通用目的载体(Destination vector)，使用者可根据需要选择它们跟入门载体(ENTR vector)进行LR反应，即可得到最终表达目的载体。这两个通用载体的制作分别以pK7WGF2或pK7FWG2载体为起始骨架，利用限制性内切酶SpeI和重组酶MultiS，将12xHis的编码序列分别进行了融合插入。本发明作为对前面申请专利(专利申请号202110472170.X)的必要补充，提供了一种方便快捷的分子克隆系统，用于少数不能在原核系统中表达的真核蛋白的高效准确表达，使蛋白表达纯化系统更全面和完善，功能更强大，可有力促进活性蛋白的纯化工作，为蛋白的功能学研究建立基础。

摘要： 本发明涉及一种稳定表达抗TNF‑α单克隆抗体的细胞表达体系及构建方法和应用，依照细胞密码子偏爱性将抗TNF‑α单克隆抗体的轻、重链编码基因进行优化，构建了以Bak1基因等做为靶标的抗TNFα人鼠嵌合单克隆抗体同源重组载体，同时针对Bak1等靶标基因外显子区域构建具有特异性切割作用的CRISPR/Case9载体，釆用脂质体转染的方式将两种载体共同导入中华仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞，筛选获得稳定表达抗TNF‑α单克隆抗体的阳性细胞株。本发明可用于抗TNF‑α单克隆抗体的高效生产，该抗体可用于类风湿性关节炎、强直性脊柱炎等疾病的治疗。

摘要： 本发明公开了一种提高昆虫细胞瞬时转染和稳定表达蛋白表达量的方法。传统的在昆虫细胞培养时多采用的是磷酸盐缓冲系统，其培养过程中无需添加CO2，目的蛋白的表达量比较低。本发明创造性的发现在昆虫细胞培养时，无论是在瞬时转染还是在稳定细胞池的蛋白表达生产过程中，在培养箱中添加CO2或通过转染后将透气盖子换成密封盖以通过昆虫细胞自身呼吸作用增加瓶中CO2浓度的方法都可以提高蛋白的表达量，并且提升效果显著。在昆虫细胞培养过程中在培养箱中添加CO2或将培养瓶盖子换成密封盖简单易行，成本低，是可以广泛使用的并可显著提高昆虫细胞蛋白表达量的方法。

摘要： 本发明公开了一种表达犬白介素6的重组质粒、稳定表达犬白介素6蛋白的细胞株及其制备方法和应用。本发明首先构建了表达犬白介素6的重组质粒，将所述重组质粒导入中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，筛选得到稳定表达犬白介素6蛋白的细胞株，所述细胞株传代培养20次仍可稳定表达犬白介素6蛋白，且细胞株表达犬白介素6蛋白的能力不受冻存及复苏的影响；所述细胞株表达犬白介素6蛋白是将犬白介素6蛋白分泌至细胞上清，纯化更方便，所得纯化蛋白更接近天然蛋白分子，具备促进淋巴细胞增殖的生物活性，可作为佐剂增强疫苗的免疫效果。

摘要： 本发明涉及一种高效稳定的细胞表达载体、表达系统及其制备方法、应用，属于基因工程技术领域。本发明中的细胞表达载体包含MAR from the DHFR intron序列，该段序列具有普通MAR序列和内含子的双重功能，能更好的提高CHO细胞中外源蛋白表达水平，由其构建得到的表达载体能驱动目的基因高效、持续、稳定表达，同等条件下，与不含MAR from the DHFR intron序列及包含来自CHO细胞的MAR‑6序列的表达载体相比，本发明中表达载体能显著提高外源基因的表达水平，可用于重组蛋白的生产等。

摘要： 本发明涉及一种稳定表达抗TNF‑α单克隆抗体的细胞表达体系及构建方法和应用，依照细胞密码子偏爱性将抗TNF‑α单克隆抗体的轻、重链编码基因进行优化，构建了以Bak1基因等做为靶标的抗TNFα人鼠嵌合单克隆抗体同源重组载体，同时针对Bak1等靶标基因外显子区域构建具有特异性切割作用的CRISPR/Case9载体，釆用脂质体转染的方式将两种载体共同导入中华仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞，筛选获得稳定表达抗TNF‑α单克隆抗体的阳性细胞株。本发明可用于抗TNF‑α单克隆抗体的高效生产，该抗体可用于类风湿性关节炎、强直性脊柱炎等疾病的治疗。

摘要： 本发明公开了一种提高昆虫细胞瞬时转染和稳定表达蛋白表达量的方法。传统的在昆虫细胞培养时多采用的是磷酸盐缓冲系统，其培养过程中无需添加CO2，目的蛋白的表达量比较低。本发明创造性的发现在昆虫细胞培养时，无论是在瞬时转染还是在稳定细胞池的蛋白表达生产过程中，在培养箱中添加CO2或通过转染后将透气盖子换成密封盖以通过昆虫细胞自身呼吸作用增加瓶中CO2浓度的方法都可以提高蛋白的表达量，并且提升效果显著。在昆虫细胞培养过程中在培养箱中添加CO2或将培养瓶盖子换成密封盖简单易行，成本低，是可以广泛使用的并可显著提高昆虫细胞蛋白表达量的方法。