病毒拯救

摘要： 为了获得背景明确清晰的禽白血病病毒K亚群(ALV-K)毒株,对地方性ALV-K毒株HB2018003采用酶切和同源重组两种方法进行感染性克隆构建及病毒拯救。使用PCR方法获得目的基因,经酶切、连接和同源重组后成功构建重组质粒Topo-003-ABC和Topo-003-K12,测序结果表明无任何突变,进而将重组质粒转染进鸡胚成纤维细胞(DF-1)中,经群特异性抗原P27 ELISA、PCR和间接免疫荧光(IFA)鉴定,结果均表明成功拯救出病毒,将其命名为R-rHB2018003(同源重组法)和E-rHB2018003(酶切法)。本研究为深入探讨ALV-K的致病机制奠定了基础。

摘要： 鸡传染性贫血病毒(CIAV)感染鸡引起免疫抑制性疾病,严重危害养禽业。为了构建CIAV Cux-1株的感染性克隆,本试验通过PCR扩增CIAV全基因组序列,与pcDNA3.1载体同源重组,得到重组质粒pcDNA3.1-Cux-1。进一步通过对pcDNA3.1-Cux-1酶切、环化得到CIAV Cux-1环状DNA。将环状DNA电转染导入MSB1细胞并连续传代,用Western blot和间接免疫荧光进行重组病毒的鉴定。结果显示,本试验成功拯救出CIAV重组病毒rCux-1(recombinant Cux-1),重组病毒rCux-1携带有特定的遗传标记,并且与亲本株复制能力和蛋白表达水平基本一致。本试验成功构建的CIAV Cux-1株感染性克隆为进一步研究CIAV的致病机理和研制新型疫苗提供了试验基础。

摘要： 鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)是研究冠状病毒的模式病毒,但传统的病原学研究方法局限于自然界分离的病毒,不利于研究的开展。反向遗传操作系统可快速获得研究所需的重组病毒,为研究MHV及其他冠状病毒的基因组功能开辟了新途径。本研究通过反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)将MHV的原始毒株A59全长基因组分成6个片段进行扩增,分别克隆到质粒载体,经酶切、体外连接和转录获得全长基因组RNA,然后电转细胞并进行病毒扩增。结果显示,重组病毒rA59与原始毒株的复制特性相似,其为研究MHV的生物学特性提供了实验工具。为方便检测病毒的复制水平,在病毒基因组开放阅读框4(open reading frame 4,ORF4)内分别插入绿色荧光蛋白ZsGreen(Zoanthus sp.green fluorescent protein)和荧光素酶Nluc(NanoLuc luciferase)报告基因,获得rA59-ZsGreen和rA59-Nluc重组报告病毒。结果显示,报告病毒所携带的报告基因并不影响病毒复制,可很好地反映病毒的复制特性。使用这两种病毒验证瑞德西韦(remdesivir)的抗病毒活性,分别检测药物处理后病毒的荧光亮度和荧光素酶活性。结果表明,rA59-ZsGreen和rA59-Nluc重组报告病毒适用于高通量药物筛选,具有重要的应用前景。综上所述,本研究成功建立了MHV A59毒株六质粒反向遗传操作系统,为研究MHV的生物学特性和测试抗病毒药物等提供了有力的工具。

摘要： 目的利用定点突变技术突变Pdm/09 H1N1流感病毒的NA基因119位点并拯救,研究其生物特性。方法利用重叠PCR的方法进行定点突变,再应用反向遗传学体系中的pBD-NA质粒后在293T细胞中转染拯救流感病毒,通过血凝试验和RT-PCR方法鉴定病毒拯救结果,通过细胞学和攻毒试验研究该位点变异的生物学意义。结果定点突变测序结果显示,突变的pBD-NA质粒核苷酸第336位由A突变为G,使氨基酸位点发生E(核苷酸:GAA)到G(核苷酸:GGA)的变化,而其他位置的氨基酸均未发生改变。拯救的病毒转染后的细胞悬液接种MDCK细胞连续传代3代后突变毒株(rMT)血凝效价为27,亲本毒株(rWT)为26。神经氨酸酶的二级结构预测结果显示,rMT与rWT相比,Alpha Helix分值明显下降,均值同比下降约为10.62%,经突变后的rMT Alpha Helix结构分值表现为下降趋势。用rWT和rMT病毒攻毒BABL/c小鼠后第3天的小鼠肺组织、鼻甲骨、脾和肾的病毒滴度,rMT攻毒组均比rWT攻毒组高,鼻甲组织与肺脏中的病毒滴度相比差异不显著,脾和肾的差异显著。结论NA119位点的定点突变对病毒的复制能力没有明显影响,突变株对BABL/c小鼠的致病力有一定增强,临床症状明显,神经氨酸酶活性下降。

摘要： 【目的】为探明引起禽白血病病毒K亚型(ALV-K)两不同毒株之间致瘤性差异的原因,进一步探索ALV-K的致病机理,实现两株ALV-K重组病毒感染性克隆的构建及病毒拯救。【方法】以前期构建的ALV-K毒株HB2018003和HB2015032的感染性克隆为模板,PCR扩增分别获取两毒株单独的5′-端长末端重复序列(5′-LTR)基因片段和剩余目的基因片段。切胶回收目的片段后将两毒株的5′-LTR互换,通过同源重组的方法获得连接产物。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后涂布Amp抗性平板过夜培养,挑取PCR鉴定为阳性的菌落提取重组质粒TOPO-003-032和TOPO-032-003并送检测序。将PCR和测序鉴定正确的重组质粒转染至易感细胞DF-1中盲传3代,使用群特异性抗原P27 ELISA、多重PCR和间接免疫荧光等方法对拯救的病毒进行检测。【结果】测序和重组感染性克隆PCR鉴定的结果表明成功构建了5′-LTR互换的重组质粒,多重PCR结果显示在目的片段大小处出现ALV-K预期条带,未出现ALV-A和ALV-J条带,间接免疫荧光试验结果显示接种拯救病毒的DF-1细胞出现明显的亮绿荧光,阴性对照则没有出现荧光。综合以上结果,说明两株重组病毒拯救成功,并将其分别命名为rHB2022050(TOPO-032-003)和rHB2022051(TOPO-003-032)。【结论】本研究采用同源重组的方法构建了5′-LTR互换的感染性克隆TOPO-003-032和TOPO-032-003,并成功拯救出病毒rHB2022050(TOPO-032-003)和rHB2022051(TOPO-003-032)。

摘要： 目的 研究3D聚合酶(3D polymerase,3Dpol)突变对肠道病毒A组71型(Enterovirus A71,EV-A71)复制的影响.方法 扩增EV-A71病毒基因组并克隆至TOPO-XL2-PCR载体;应用体外点突变方法在病毒3Dpol 区引入N16S和I256V突变;采用T7聚合酶转录病毒基因组RNA并转染RD细胞,获得N16S和I256V病毒突变株.观察亲本病毒与突变病毒株的增殖特征以及病毒RNA含量.结果 RNA转染RD细胞后可获得具有感染性的病毒.体外增殖试验显示,正常培养条件下(36.5°C)3株病毒增殖趋势一致,感染细胞72 h后病毒滴度和RNA拷贝数均达到峰值且组间差异无统计学意义.温度敏感性试验显示,与正常培养条件比较,病毒在高温(39.5°C)的滴度和RNA拷贝数均大幅下降,并且高温对N16S和I256V突变株的增殖抑制较亲本株更为显著.结论 成功构建EV-A71感染性克隆并获得病毒突变株,3Dpol的N16S和I256V突变在高温条件下可能进一步降低病毒复制能力.

摘要： 猪繁殖与呼吸综合征是世界规模化猪场的主要疫病之一,主要由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起.本研究旨在构建PRRSV高致病性毒株HN07-1反向操作系统.通过将基因组进行分段克隆和测序的方法获得HN07-1毒株全长基因组序列.运用反向遗传学技术将全基因组分段克隆至载体上,构建含有全长HN07-1毒株cDNA的感染性克隆pcDNA3.2-rHN07-1,并以此为骨架,构建在PRRSV基因组ORF1b和ORF2a间插入增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的重组克隆pcDNA3.2-rHN07-1-EGFP;将构建的质粒转染Marc-145细胞拯救病毒.采用免疫荧光实验(immune fluorescence assay,IFA)和Western blot进行表达鉴定并对重组病毒进行滴度测定与分析.结果表明,PRRSV毒株HN07-1基因组全长15345 nt,转染Marc-145细胞盲传一代后培养48 h出现典型的细胞病变效应,IFA和Western blot检测结果表明,拯救病毒与亲本毒株HN07-1一致,都能检测到PRRSV N蛋白表达.并且拯救病毒与亲本毒株具有相似的生长动力特性.综上所述,本研究成功构建了HN07-1感染性克隆,可用于反向遗传操作,为PRRSV致病机制研究及疫苗研发提供了参考.

摘要： 目的 构建并拯救增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记的EGFP-EV-A71重组病毒.方法 利用重叠PCR技术,以pMD19T-SDLY107全长质粒为模板,将2A蛋白酶识别序列加入到结构蛋白VP4的5'端;以pEGFP-N1质粒作为模板,扩增获得EGFP目的片段,将其插入到上述重组质粒中,得到重组质粒pMD19T-107-EGFP.经酶切和体外转录后,转染横纹肌细胞肉瘤(RD),拯救获得重组病毒EGFP-EV-A71.采用Karber法计算细胞培养半数感染量(CCID50)以测定病毒滴度.利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同时间点的病毒复制水平,并绘制病毒复制曲线,比较重组病毒与母本病毒的复制力有无差异.乳酸脱氢酶(LDH)和细胞增殖(CCK-8)实验分别测定被感染细胞的细胞损伤率和存活率.结果 包含EGFP的重组EV-A71感染性cDNA克隆被成功构建;转染RD细胞后,出现典型的细胞病变并且表达出较强的绿色荧光;重组病毒与母本病毒具有相似的复制动力学特征和致细胞病变效应.结论 成功拯救了EGFP标记的重组病毒EGFP-EV-A71.

摘要： 本研究建立了国内首个基因4型戊型肝炎病毒(HEV)上海分离株(SAAS-FX17)的全长cDNA克隆.将cDNA体外转录成RNA后,转染Huh7细胞,经IFA可检测到病毒ORF2蛋白的表达.将RNA经肝内注射SD大鼠后,在注射后的第23-30d采用RT-PCR方法检测大鼠粪便HEV RNA呈阳性,并持续至注射后第45d.在注射后的30-40d采用ELISA方法检测大鼠血清HEV抗体呈现阳性,并持续至第52d.本研究结果首次用HEV的cDNA克隆的体外转录物RNA经肝内注射大鼠并成功拯救病毒,提示大鼠可以作为HEV研究的动物模型.

摘要： 将本实验室保存的一株La Sota病毒用有限稀释法接种鸡胚进行纯化,连续传代五次后筛选到一株高血凝效价的纯培养克隆株,命名为La Sota C5,并对其进行全基因组测序;参照La Sota C5株全基因序列单酶切位点,用RTPCR的方法将基因组分8段扩增,并按照病毒基因组的结构顺序,将克隆片段定向插入到TVT转录载体中,至此含有病毒全长cDNA的转录载体TVT-La Sota C5成功构建。将TVT-La Sota C5与构建的辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCIL按照5:3:2:1的比例共转染BSR-T7/5细胞,成功拯救出了具有感染性的La Sota1株新城疫病毒。病毒的成功拯救为后续基因功能和疫苗载体开发等方面的研究提供了平台。

摘要： 近年来，3型鸭甲肝病毒(DHAV-3)已流行于我国许多养鸭地区，故开展该型病毒研究具有重要意义。国内学者已建立1型DHAV的感染性克隆，本文旨在以C-GY株为材料，构建DHAV-3的感染性克隆，为深入研究DHAV-3的分子致病机制提供必要的技术平台。

摘要： 目的：口蹄疫(FMD)是当前危害猪、牛、羊等偶蹄动物的重要传染病，为了有效防控消灭该病，我国采取的是以免疫为主的综合防控措施，制苗毒株的选择是疫苗生产过程中考虑的最重要因素之一，因此本文旨在筛选或构建一株低致病力，免疫原性与田间流行毒株相匹配的制苗毒株。 方法：T7RNA聚合酶表达质粒，质粒p43-CHA90-LL由猪源O型口蹄疫制苗种毒p43-CHA90缺失Lpro构建而成。猪源流行毒株结构蛋白基因(P1区)由广东省动物疫控中心扩增提供。试验以构建成功的缺失Lpro基因的口蹄疫病毒毒株OZK/93为基础，删除结构蛋白VPl、VP2和VP3的编码基因，引入多克隆位点，构建成口蹄疫病毒的通用载体p43-CHA90-LL-Vector，在此载体的多克隆位点处插入广东省猪源流行毒株(GD16) Pl区基因中VP3、 VP2、VPl基因序列，拯救嵌合病毒，并传了3代，通过蚀斑试验、PT-PCR及测序检测病毒。 结果：通用载体p43-CHA90-LL-Vector构建成功；含流行毒株GD16的嵌合病毒构建成功；拯救出活病毒；RT-PCR及测序分析嵌合病毒未发生变异。

摘要： 用PCR法扩增猪圆环病毒1型(PCV1)全长基因组，将2个基因组顺式连接插入到pUC19质粒载体中构建感染性分子克隆。通过引物设计替换碱基，在病毒基因组内插入SalⅠ酶切位点作为分子靶标，拯救出带有分子标记的克隆病毒，命名为recPCV1/G株。通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)在病毒感染细胞中检出病毒抗原，其抗原性仅与PCV1/Cap蛋白单价特异性抗体发生反应，而与抗PCV2/Cap蛋白抗体无交叉。克隆毒株基因组内插入一个SalⅠ酶切位点，可用PCR结合限制性片断长度多态性分析法(PCR-RFLP)与亲本病毒相鉴别。该毒株经细胞连续传10代，体外培养增殖性能稳定，病毒滴度达104.8TCID50/mL。构建的PCV1感染性克隆，为今后开展该病毒的起源与演化、遗传变异规律、分子鉴别诊断等研究奠定了基础。

摘要： 猪圆环病毒2型(PCV2)感染引起的相关疾病日益严重，流行毒株基因不断发生变异，根据病毒基因组差异分为PCV2a、PCV2b和PCV2c三个基因型，还有PCV2d基因型新报道，这些不同基因型PCV2毒株的致病性差异有待阐明。采用感染性克隆技术构建了不同基因型代表性毒株，对拯救的毒株进行体外生物学特性试验。本研究构建了4个不同基因型的PCV2感染性分子克隆，经转化细胞后拯救4个克隆毒株，经核酸序列分析、病毒形态学观察、免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)等证实属于不同基因型的PCV2毒株;拯救的毒株均通过细胞连续传10代，病毒增殖能力稳定，毒价均可达到105.0TCID50/ml;rn 用具有中和病毒活性的单克隆抗体(1D2株)进行抗原捕获ELISA检测，拯救的PCV2a/rCL毒株与该单抗产生特异性反应，另3个克隆毒株(PCV2b/rYJ、rJF和PCV2d/rBDH)与该单抗均无反应，表明它们属于不同基因型代表毒株。这表明我国猪群中PCV2流行毒株存在不同基因型，其病毒抗原特性各异，构建和拯救了4个代表不同基因型PCV2克隆毒株，为进一步研究其致病性差异奠定了基础。

摘要： 猪圆环病毒2型(PCV2)感染引起的相关疾病日益严重，流行毒株基因不断发生变异，根据病毒基因组差异分为PCV2a、PCV2b和PCV2c三个基因型，还有PCV2d基因型新报道，这些不同基因型PCV2毒株的致病性差异有待阐明。采用感染性克隆技术构建了不同基因型代表性毒株，对拯救的毒株进行体外生物学特性试验。本研究构建了4个不同基因型的PCV2感染性分子克隆，经转化细胞后拯救4个克隆毒株，经核酸序列分析、病毒形态学观察、免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)等证实属于不同基因型的PCV2毒株;拯救的毒株均通过细胞连续传10代，病毒增殖能力稳定，毒价均可达到105.0TCID50/ml;rn 用具有中和病毒活性的单克隆抗体(1D2株)进行抗原捕获ELISA检测，拯救的PCV2a/rCL毒株与该单抗产生特异性反应，另3个克隆毒株(PCV2b/rYJ、rJF和PCV2d/rBDH)与该单抗均无反应，表明它们属于不同基因型代表毒株。这表明我国猪群中PCV2流行毒株存在不同基因型，其病毒抗原特性各异，构建和拯救了4个代表不同基因型PCV2克隆毒株，为进一步研究其致病性差异奠定了基础。

摘要： 猪圆环病毒2型(PCV2)感染引起的相关疾病日益严重，流行毒株基因不断发生变异，根据病毒基因组差异分为PCV2a、PCV2b和PCV2c三个基因型，还有PCV2d基因型新报道，这些不同基因型PCV2毒株的致病性差异有待阐明。采用感染性克隆技术构建了不同基因型代表性毒株，对拯救的毒株进行体外生物学特性试验。本研究构建了4个不同基因型的PCV2感染性分子克隆，经转化细胞后拯救4个克隆毒株，经核酸序列分析、病毒形态学观察、免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)等证实属于不同基因型的PCV2毒株;拯救的毒株均通过细胞连续传10代，病毒增殖能力稳定，毒价均可达到105.0TCID50/ml;rn 用具有中和病毒活性的单克隆抗体(1D2株)进行抗原捕获ELISA检测，拯救的PCV2a/rCL毒株与该单抗产生特异性反应，另3个克隆毒株(PCV2b/rYJ、rJF和PCV2d/rBDH)与该单抗均无反应，表明它们属于不同基因型代表毒株。这表明我国猪群中PCV2流行毒株存在不同基因型，其病毒抗原特性各异，构建和拯救了4个代表不同基因型PCV2克隆毒株，为进一步研究其致病性差异奠定了基础。

摘要： 猪圆环病毒2型(PCV2)感染引起的相关疾病日益严重，流行毒株基因不断发生变异，根据病毒基因组差异分为PCV2a、PCV2b和PCV2c三个基因型，还有PCV2d基因型新报道，这些不同基因型PCV2毒株的致病性差异有待阐明。采用感染性克隆技术构建了不同基因型代表性毒株，对拯救的毒株进行体外生物学特性试验。本研究构建了4个不同基因型的PCV2感染性分子克隆，经转化细胞后拯救4个克隆毒株，经核酸序列分析、病毒形态学观察、免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)等证实属于不同基因型的PCV2毒株;拯救的毒株均通过细胞连续传10代，病毒增殖能力稳定，毒价均可达到105.0TCID50/ml;rn 用具有中和病毒活性的单克隆抗体(1D2株)进行抗原捕获ELISA检测，拯救的PCV2a/rCL毒株与该单抗产生特异性反应，另3个克隆毒株(PCV2b/rYJ、rJF和PCV2d/rBDH)与该单抗均无反应，表明它们属于不同基因型代表毒株。这表明我国猪群中PCV2流行毒株存在不同基因型，其病毒抗原特性各异，构建和拯救了4个代表不同基因型PCV2克隆毒株，为进一步研究其致病性差异奠定了基础。

摘要： 猪圆环病毒2型(PCV2)感染引起的相关疾病日益严重，流行毒株基因不断发生变异，根据病毒基因组差异分为PCV2a、PCV2b和PCV2c三个基因型，还有PCV2d基因型新报道，这些不同基因型PCV2毒株的致病性差异有待阐明。采用感染性克隆技术构建了不同基因型代表性毒株，对拯救的毒株进行体外生物学特性试验。本研究构建了4个不同基因型的PCV2感染性分子克隆，经转化细胞后拯救4个克隆毒株，经核酸序列分析、病毒形态学观察、免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)等证实属于不同基因型的PCV2毒株;拯救的毒株均通过细胞连续传10代，病毒增殖能力稳定，毒价均可达到105.0TCID50/ml;rn 用具有中和病毒活性的单克隆抗体(1D2株)进行抗原捕获ELISA检测，拯救的PCV2a/rCL毒株与该单抗产生特异性反应，另3个克隆毒株(PCV2b/rYJ、rJF和PCV2d/rBDH)与该单抗均无反应，表明它们属于不同基因型代表毒株。这表明我国猪群中PCV2流行毒株存在不同基因型，其病毒抗原特性各异，构建和拯救了4个代表不同基因型PCV2克隆毒株，为进一步研究其致病性差异奠定了基础。

摘要： 本发明公开了一种重组病毒，即表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的重组新城疫病毒核苷酸序列及其在肿瘤抑制方面的应用。本发明提供的肿瘤治疗药物，具有良好的肿瘤抑制效果，同时本发明为重组新城疫病毒治疗肿瘤的提供了依据。

摘要： 本发明公开了一种用于拯救腮腺炎病毒的系统及拯救方法，属于反向遗传学应用领域。所述系统，包括以下组成：包含腮腺炎病毒全基因组cDNA的重组转录载体；包含腮腺炎病毒NP基因的辅助质粒Ⅰ；包含腮腺炎病毒P基因的辅助质粒Ⅱ；以及包含腮腺炎病毒L基因的辅助质粒Ⅲ。本发明利用3+1质粒拯救系统(表达MuV‑S79株N蛋白、P蛋白、L蛋白的辅助质粒和重组转录载体)能够有效地从体外拯救出腮腺炎病毒，重组腮腺炎病毒可用细胞培养的方法来大量扩增，且不需任何处理可直接用于疫苗的制造，克服了传统疫苗生产费时费力、工艺复杂等问题。另外，为以后运用分子克隆技术改造腮腺炎病毒开发新型疫苗提供了解决方案。

摘要： 本发明公开了一种用于拯救麻疹病毒及表达GFP的重组麻疹病毒的系统、方法及用途，本发明的系统包括如下成分：1)含有麻疹病毒反基因组全长的转录质粒pT7MV

摘要： 一种肠道病毒71型3C嵌合病毒及其拯救方法和应用，拉丁文学名：(Human？enterovirus？713C？chimeric？virus)，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学校内，保藏日期：2015年6月24日，保藏编号：CCTCC？NO.V201521。肠道病毒71型3C嵌合病毒的拯救提供了一个研究平台。EV71的3C嵌合病毒株为研究3C编码区在病毒致病机制中的作用、抗病毒药物研究和疫苗研制均提供了研究平台。并为其他同类病毒的拯救提供了技术方法。

摘要： 一种肠道病毒71型5’UTR嵌合病毒，拉丁文学名：(Human？enterovirus？71？5’UTR？chimeric？virus)，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学校内，保藏日期：2015年6月24日，保藏编号：CCTCC？NO.V201524。非编码区的研究一直存在一个瓶颈问题，就是它无法像编码区的研究一样，可以通过构建表达载体进而表达出相应的蛋白进行研究。反向遗传技术为非编码区的研究提供了新的思路，我们构建的EV71的5’UTR区的嵌合毒株为研究EV71的5’UTR区在致病机制中的作用提供了研究平台。

摘要： 一种肠道病毒71型3CD嵌合病毒及其拯救方法和应用，拉丁文学名：(Human？enterovirus71？3CD？chimeric？virus)，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学校内，保藏日期：2015年6月24日，保藏编号：CCTCC？NO.V201523。肠道病毒71型3CD嵌合病毒的拯救提供了一个研究平台。EV71的3CD作为一个前体蛋白在病毒的复制和致病中均发挥重要作用，因此嵌合病毒株SDLY107(1-3CD)的构建为研究3CD编码区在病毒致病机制中的作用、抗病毒药物研究和疫苗研制均提供了研究平台。

摘要： 本发明公开了一种重组病毒，即表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的重组新城疫病毒核苷酸序列及其在肿瘤抑制方面的应用。本发明提供的肿瘤治疗药物，具有良好的肿瘤抑制效果，同时本发明为重组新城疫病毒治疗肿瘤的提供了依据。

摘要： 本发明提供了一种副粘病毒拯救方法，包括以下步骤：(1)将副粘病毒基因组质粒、N质粒、P质粒、L质粒、pT7‑T7RNAP质粒、pCDIBP‑T7RNAP质粒和动物细胞混合；(2)使用物理或化学方法介导多质粒共转染；(3)培养细胞；(4)收集病毒。所述pT7‑T7RNAP质粒是带有T7启动子和T7RNA聚合酶DNA序列的质粒；所述pCDIBP‑T7RNAP质粒是带有CMV启动子和T7RNA聚合酶DNA序列的质粒。本发明可以高效拯救出副粘病毒，并且能够适用于人用副粘病毒减毒活疫苗的生产。

摘要： 本发明涉及一种猪圆环病毒2型(PCV2)双拷贝感染性克隆的病毒拯救方法，通过采用适当的基因工程技术方法，基于临床分离得到的PCV2基因组DNA，设计特异性引物，经聚合酶链式反应(PCR)获得全长基因，将两个拷贝的PCV2全长基因以首尾相连的方式串联连到pEGFP-N1载体上，形成PCV2双拷贝全基因重组质粒，转染ST细胞后连续盲传60代，借助PCR检测方法以及间接免疫荧光实验技术(IFA)对其在ST细胞上的感染性以及病毒增殖稳定性进行鉴定，为进一步研究圆环病毒的致病机理及诊断技术等研究打下基础。

摘要： 本发明公开了一种马立克氏病病毒弱毒疫苗814株的反向遗传操作系统及其在病毒拯救中的应用。本发明通过将马立克氏病病毒弱毒疫苗814株的基因组剪切后分段克隆入Fosmid粘粒载体pCC1Fos，构建了814疫苗株基因组Fosmid文库。在对该文库进行基因组测序的基础上，从中挑选出5个克隆有814疫苗株基因组片段，且相互含有重叠区域，并可以拼接覆盖814株全基因组的重组粘粒。用这5个粘粒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，成功拯救出与原MDV疫苗株生物学特性相同的病毒。应用本发明建立的反向遗传操作系统，一是可以拯救出该弱毒疫苗株，作为疫苗用于MDV的预防；更重要的是，利用该反向遗传操作系统可以实现在细菌中进行病毒改造，从而用于MDV活载体疫苗的研制。