反向遗传学

摘要： 随着作物基因组测序工作的陆续完成,大量影响作物重要农艺性状的基因功能等待挖掘。由于缺少高效的遗传转化方法,多种作物的基因功能研究进展缓慢。病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术不依赖遗传转化,通过病毒载体接种即可在当代植物体内实现对靶向基因的沉默。VIGS技术因其起效时间快、沉默效率高、操作成本低、便于高通量和应用植物范围广等特点,被越来越多地应用于不同作物基因功能和代谢通路解析的反向遗传学研究中。介绍了VIGS的技术原理及其发展过程,系统归纳了VIGS在不同作物中的应用,总结和讨论了现有VIGS应用的局限性以及影响其沉默效率的几个关键因素,并对VIGS技术在未来植物生物学研究中的应用进行了展望,以期为VIGS技术的进一步应用和发展提供参考。

摘要： 小反刍兽疫(PPR)是由小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的山羊、绵羊等小反刍动物的急性、高度接触性传染病。反向遗传学是在获得生物基因信息的基础上,对基因进行突变、缺失等操作,进而研究基因变化对表型的影响。本文综述了包括PPRV在内的单股负链RNA病毒反向遗传学的最新研究进展,以期为PPRV及同科属病毒的反向遗传操作系统的建立提供新的思路。

摘要： 克隆牛病毒性腹泻病毒Singer_Arg株全长cDNA,并获得其感染性RNA。将病毒基因组分段克隆后再拼接成全长cDNA;通过巨细胞病毒即早期启动子控制病毒cDNA转录,5'-UTR上游的锤头状核酶和3'-UTR下游的丁肝病毒核酶控制转录产物5'-UTR和3'-UTR的完整性和准确性,以获得不经体外转录,直接转染细胞产生病毒感染性RNA的反向遗传操作系统;并通过Western blot、RT-PCR技术、免疫荧光等方法对子代病毒进行了一系列鉴定与遗传稳定性分析。获得了Singer_Arg株全基因组序列并通过反向遗传拯救出该毒株。成功构建了基于Singer_Arg株的BVDV反向遗传操作系统,为BVDV疫苗研发和基础研究提供了技术平台。

摘要： 雄性不育是指植物雄蕊不能正常生长和产生有活力花粉粒的现象.利用雄性不育突变体开展杂交育种工作,是快速提高作物单产的有效途径.目前,通过杂种制种已大幅度提高了水稻(Oryza sativa L.)、玉米(Zea mays L.)和小麦(Triticum aestivum L.)等作物的产量.大豆(Glycine max(L.)Merr.)作为自花授粉作物,通过人工去雄生产杂交种子不仅困难而且经济上不可行.由于适用于杂交种生产的不育系资源短缺,目前大豆还没有实现大规模杂种优势利用.因此,快速实现大豆杂种优势利用迫切需要鉴定稳定的大豆雄性不育系统.本文总结了大豆细胞核雄性不育(genic male sterility,GMS)突变体及不育基因研究进展,同时结合拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻和玉米中已报道的细胞核雄性不育基因,从反向遗传学的角度,为大豆核雄性不育基因的鉴定提供依据.

摘要： 诺如病毒是导致人类急性胃肠炎的主要食源性致病原,由于变异快且缺乏稳健的体外细胞培养体系及小动物感染模型,限制了我们对该病原体的深入研究.近年来,可培养鼠源诺如病毒的发现、人源诺如病毒肠道细胞培养体系的开发,以及诺如病毒反向遗传操作体系的构建为系统研究该病原提供了有力工具,加深了我们对其复制机制、致病机理、病毒-宿主相互作用等的了解.本文主要综述了反向遗传学技术用于诺如病毒研究的工作进展,并讨论了该技术在诺如病毒分子病毒学研究、药物筛选和疫苗制备中的应用及发展前景,以期为诺如病毒防控策略的制定及药物靶点的挖掘提供有益参考,推进我国食品安全风险防控工作.

摘要： D型流感病毒是近年来新发现的一种流感病毒,宿主范围、地域分布广泛,可与其它呼吸道病毒一起引起严重的牛呼吸道疾病,给家畜养殖业造成了威胁,并存在跨越种间屏障向人类传播的风险。国外的D型流感疫苗研究结果虽然并不理想,但已经在灭活苗和DNA疫苗两个方向都有所涉及,而国内对于D型流感疫苗的研究尚未有报道。D型流感病毒基因组由7个RNA片段组成,共编码9种蛋白。血凝素酯酶融合蛋白(hemagglutinin-esterase-fusion,HEF)是D型流感病毒唯一的糖蛋白,具有A型流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)蛋白的功能,同时有较强的免疫原性,是开发预防性疫苗的关键免疫原。本研究采用反向遗传学技术拯救了表达HEF蛋白的重组新城疫病毒,命名为rNDV-F-HEF(NDV97 F裂解位点替换为Lasota裂解位点的突变病毒);传代测序验证重组病毒的遗传稳定性,结果显示HEF基因在重组新城病毒rNDV-F-HEF中可以稳定遗传;Western-blot试验和间接免疫荧光试验表明rNDV-F-HEF能成功表达外源蛋白HEF;rNDV-F-HEF在鸡胚和雏鸡体内的毒力和生长能力与其亲本毒株NDV-F基本一致;rNDV-F-HEF肌肉注射免疫BALB/c小鼠的血清中含有HEF特异性Ig G抗体,其含量在三免后的第7天既能达到较高水平(约1800 ng/m L),说明rNDV-F-HEF具有防控IDV的潜质。重组病毒株rNDV-F-HEF可以用于IDV的预防性疫苗研发。

摘要： 引起猪腹泻疾病的病因较多,病毒性腹泻是最严重的一个类型,它是由腹泻病毒引起的急性传染性的疾病。近年,猪流行性病毒腹泻在世界范围内爆发,为控制该病毒,研究人员建立病毒的靶向RNA重组技术、细菌培养技术、细菌人工染色载体系统等猪流行性腹泻病毒的遗传学研究技术,对猪流行性腹泻病毒的致病机理和疫苗开发有重要意义。该文总结了猪流行性腹泻病毒反向遗传操作技术研究现状及生产实践中的应用情况,为新型疫苗的研究提供参考。

摘要： 为探究ERD15基因功能,利用反向遗传学,通过PCR及半定量PCR筛选鉴定出拟南芥(Arabidopsis thaliana)ERD15基因的T-DNA插入纯合突变体,并对其表型进行观察分析.结果 表明,erd15突变体莲座叶数目显著增多,提前3～4 d开花,突变体比野生型更早从营养生长转向生殖生长.拟南芥野生型植株主茎为圆柱体,平均直径1.29 mm,而erd15突变体主茎扁平,平均直径达到2.27 mm,具极显著差异.与野生型相比,erd15突变体果实心皮发育受到影响,隔膜上排列有多排种子,果荚顶端膨大,长度缩短37.67％,但角果平均结籽数升高.因此,ERD15基因参与了调控拟南芥植株的生殖生长过程.

摘要： 为进一步解析玉米如何通过调控丁布类化合物的合成进而调控植物抗虫的分子机理,近期,中国科学院昆明植物研究所研究员吴建强团队利用反向遗传学手段与比较转录组分析,鉴定了两条负调控关键丁布化合物DIMBOA和DIMBOA-GIc合成的信号途径,即ZmMPK6和乙烯介导的信号途径。

摘要： 猪繁殖与呼吸综合征病毒对养猪业危害巨大,未有有效的药物和疫苗,猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因编码RNA依赖的RNA聚合酶,在病毒复制中发挥重要作用.为了探索NSP9基因与病毒的毒力、复制能力及细胞嗜性的相关性，本研究利用反向遗传学技术将疫苗毒CH-lR的NSP9基因进行克隆，酶切后连接到强毒株XH-GD的感染性克隆上，进行病毒的拯救。结果成功构建替换了CH-lR NSP9基园的重组病毒。对重组病毒的生物学特性进行研究，发现拯救病毒的生长速度和病毒滴度明显高于亲本毒株XH-GD，但是低于疫苗毒CH-IR，重组毒株的噬斑大小与CH-IR相似，初步推测疫苗株CH-IR的聚合酶有助于提高病毒的滴度，为进一步研究NSP9基困对病毒毒力的影响奠定基础。

摘要： 正向(经典)遗传学是通过生物的表型来推测其遗传物质的组成、分布和传递规律等，而反向遗传学是在已知基因序列的基础上，利用现代生物理论和技术，通过核苷酸序列的定点突变、缺失和插入等创造突变体并研究突变所造成的表型效应。随着基因组测序技术、侵染性克隆的构建技术、定点突变技术和报告基因的使用等，反向遗传学技术在研究植物病毒基因功能、侵染过程和致病机理等方面的应用越来越广泛。本文报道了该技术在研究马铃薯Y病毒(PVY)HC-Pro和甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)P22功能方面的部分结果。

摘要： 随着1998年RNA干扰(RNAinterference,RNAi)现象在秀丽隐杆线虫中发现以来,RNAi作为一项在分子生物学及细胞生物学研究的新技术得到了快速发展.伴随着人类基因组计划(humangenomeproject,HGP)的基本完成,以及一系列组学概念的提出,作为反向遗传学研究的工具-RNAi在基因功能研究、基因治疗、以及基因工程等方面发挥着巨大的作用并存在着巨大的优势.该文就近几年来RNAi的机制、基因功能研究和基因治疗方面的研究进展综述。

摘要： 本研究在前期构建的兔出血症病毒(Rabbithemorrhagicdiseasevirus,RHDV)全长cDNA分子的基础上,利用SP6RNA聚合酶系统,在体外转录合成了病毒RNA.然后用转染试剂将病毒RNA导入RK13细胞,12h后可见明显致细胞病变(CPE),用间接免疫荧光方法在RK13细胞中也检测到了病毒抗原的产生.将收获的细胞培养物再次接种RK13细胞,仍然能产生明显病变,其半数组织感染量(TCID50)可达104.6/ml.最后大量收取细胞培养物,经差速离心法纯化病毒后,在电镜下可观察到RHD病毒粒子.上述实验结果证明我们利用反向遗传学技术首次获得了可适应于RK13培养的RHDV,为将来研究RHDV的分子致病机理和新型疫苗等提供了有利的工具.

摘要： 新城疫是由新城疫病毒引起的一种禽类急性高度接触性传染病.新城疫在世界各地广泛存在和发生,给养禽业带来了巨大的经济损失,并且危害人类的健康.随着反向遗传学操作技术的快速发展,重组新城疫病毒载体成为新城疫研究的重点,也是当今病毒载体系统研究的热点之一.本文就新城疫病毒载体在疫苗研究中的应用概况进行了综合讲述.

摘要： 本文对细胞培养疫苗生产方式的特征和优点，以及近年来利用Vero、MDCK和PER.C6细胞生产流感疫苗的研究进展综述。针对反向遗传学应用于流感疫苗生产的研究是流感疫苗未来发展研究的重要方向。通过细胞适应培养或者基因工程改造获得一株在细胞上稳定高产的流感病毒株，然后通过反向遗传学技术将该病毒株的六个内部基因与流行株的HA和NA进行"6+2"基因重配，从而快速获得可以在细胞上稳定高产并且具有流行株血和NA抗原的流感病毒株，这不仅解决了病毒在细胞上的产量问题，还缩短了流感疫苗的研发周期。

摘要： 目的：前期从临床患者分离得到6株肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71),4株接种小鼠后致使动物后肢麻痹并死亡(重株),2株接种后仅引起轻微症状最终痊愈(轻株),测序显示两组病毒编码区内存在8处氨基酸的变异.本实验选取位于VP1上的变异位点(P639 S/G),构建突变体拯救病毒,比较病毒突变前后在细胞上的复制差异.rn 方法：利用反向遗传学手段,在EV71感染性全长cDNA的基础上构建突变体病毒的全长感染性cDNA,转染获得拯救病毒并传代验证;病毒全基因测序、RT-PCR、蛋白免疫印迹、免疫荧光检测拯救病毒;绘制拯救病毒的生长曲线.rn 结果：RT-PCR检测到EV71 VP1特异性核酸片段;蛋白免疫印迹、免疫荧光检测到EV71特异蛋白;突变前后拯救病毒的生长曲线没有发生明显改变.rn 结论：突变体病毒拯救成功且能稳定传代;EV71-P639变异不影响病毒的复制.

摘要： 口蹄疫是严重危害中国畜牧业发展的重大动物疫病,疫苗免疫和精准区分免疫和自然感染动物,筛查并淘汰染毒家畜,是预防和控制口蹄疫的关键措施,也是中国口蹄疫防控的主要策略.针对目前广泛使用的传统口蹄疫灭活疫苗,因纯化不完全,免疫后,以检测病毒非结构蛋白抗体为金标准的鉴别技术,难以精准区别免疫和感染动物,既使使用先进的纯化技术,也不能完全清除与灭活病毒大小相同的非结构蛋白复合物,多次免疫后,仍能检测到病毒非结构蛋白抗体,给精准区别免疫动物和感染动物带来了困难,严重阻碍口蹄疫流行病学监测和疫源净化,已成为全球口蹄疫控制计划实施的技术障碍,引起了世界动物卫生组织和口蹄疫控制机构的关注.鉴于此,能精准区别免疫动物和感染动物的标记疫苗成为了研究热点.采用反向遗传学技术,构建带有口蹄疫病毒非结构蛋白优势表位缺失的标记病毒,是研制口蹄疫标记疫苗的最优途径.

摘要： 兔出血症病毒(RHDV)的基因组仅编码两个结构蛋白，其中一种为衣壳蛋白( VP60)，另一种为次结构蛋白(VP2)。目前，对衣壳蛋白的生物学功能已基本清楚。但是，关于次结构蛋白的生物学功能还不是很清楚。为此，本研究利用反向遗传学技术结合体外表达技术，系统研究了该蛋白的生物学功能。研究结果表明，RHDV的基因组缺失次结构蛋白(VP2)后，病毒的侵染性有所降低，但是病毒基因组的复制能力和衣壳蛋白的表达水平有所提高，说明VP2不是维持RHDV侵染性所必需的蛋白。体外研究也表明，VP2的缺失并不影响病毒样颗粒的组装，提示该蛋白不是组成病毒衣壳的组成成分。通过对接种VP2的细胞进行DAPI染色和DNA片断分析研究，发现VP2具有诱导宿主细胞凋亡的功能。由此，可以推测VP2可能在RHDV的致病机制过程发挥重要作用。

摘要： 分子生物学研究的早期,人们对基因的了解都是通过基因突变而获得的.正向遗传学的优点是可以通过突变现象来揭示基因功能.随着大规模基因组测序的成功,人们鉴定出成千上万个基因,但是却不能全部清楚其功能.近来,反向遗传学技术是最有效的研究基因功能的技术,但基因重组技术又耗时又耗费.反义技术,如反义核酸技术、核酶技术也被用于反向遗传学,由于其效率低、专一性差、较大的毒性且用药量过大、成本过高等原因,使它们的应用存在一定的限制.最近,利用由双链RNA引起转录后基因沉默机制,又称RNA干涉(RNAi),成为分析基因功能的又一种方法,得到了广泛的认可.利用小干涉性RNA技术来抑制(或敲低)脊椎动物细胞中任何基因的表达开始了反义遗传学的革命.本文介绍了RNA干涉在哺乳动物中的应用。

摘要： 本公开内容描述了一种患者注册数据系统，其可用于汇总涉及疾病发生、进展和对治疗的反应的临床、分子和免疫参数。本公开内容可允许参与者、研究者和医师基于诸如参与者人口统计数据和免疫系统数据等参数来使数据可视化。

摘要： 本发明公开基于反向遗传学构建的RSV反基因组质粒，所述RSV反基因组质粒为如序列表SEQ ID No.1所示的质粒pBRB‑RSV‑rLong/A2cp、如序列表SEQ ID No.2所示的质粒pBRB‑RSV‑rLong/A2cpts或如序列表SEQ ID No.3所示的质粒pBRB‑RSV‑rLong/A2cptsΔSH。本发明构建的重组质粒经拯救获得的重组RSV病毒具有明显的减毒效果，可用于制备RSV减毒活疫苗。

摘要： 本发明公开了一种双向转录/表达质粒及其在流感病毒反向遗传学中的应用。本发明的一种双向转录/表达质粒是以真核表达载体pEF4/myc‑His B为骨架进行改造得到的。为了建立马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)的反向遗传操作系统，本发明使用构建得到的双向转录/表达质粒双向分别表达马流感病毒PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、NS以及M基因，通过共转染、测序、生长曲线的绘制和酶切鉴定，成功拯救得到一株EIV及其突变体。同时与现有的pBD系统进行产毒量的比较，表明本发明建立的反向遗传操作系统优于pBD系统。本发明的提出为流感病毒的反向遗传研究提供了一种新的技术手段，同时也为日后深入研究马流感病毒的传播，致病机理，乃至疫苗候选株的筛选奠定了坚实基础。

摘要： 本发明涉及以痘苗病毒载体为基础的反向遗传学系统建立及应用，尤其涉及一种重组冠状病毒及其应用。本发明提供的蛋白，来源于含鼠肝炎冠状病毒(mouse hepatitis virus，MHV)A59株，命名为mNSP1，是如下1)或2)的蛋白：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白；2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白。本发明的实验证明，通过缺失突变获得的重组痘苗病毒的DNA，将其DNA通过反转录导入BHK-21细胞中，再与17CL-1共培养，获得MHV的突变体，是一个很好的疫苗候选株。

摘要： 本发明公开了一种利用反向遗传学筛选苹果矮化砧木的方法，属于苹果育种技术领域。其包括以下步骤：将具有无融合生殖特性的平邑甜茶种子进行Co60辐射诱变，将诱变的种子进行播种，在群体后代中筛选具有矮化特性的后代，并对后代进行外源GA处理，筛选对GA不敏感的后代，然后通过MhGAI1抗体检测，筛选得到DELLA突变体。本发明首次通过辐射诱变的方法，首次通过反向遗传学手段，将经过辐射诱变的平邑甜茶用特异抗体检测，筛选对GA不敏感的植株，并进一步筛选具有矮化性状、同时能够保持无融合生殖能力的种质资源。

摘要： 本发明公开基于反向遗传学构建的RSV反基因组质粒，所述RSV反基因组质粒为如序列表SEQ ID No.1所示的质粒pBRB‑RSV‑rLong/A2cp、如序列表SEQ ID No.2所示的质粒pBRB‑RSV‑rLong/A2cpts或如序列表SEQ ID No.3所示的质粒pBRB‑RSV‑rLong/A2cptsΔSH。本发明构建的重组质粒经拯救获得的重组RSV病毒具有明显的减毒效果，可用于制备RSV减毒活疫苗。

摘要： 本发明公开了一种高效的双向转录/表达质粒及其在流感病毒反向遗传学中的应用。本发明的一种双向转录/表达质粒是以真核表达载体pEF4/myc‑His B为骨架进行改造得到的。为了建立马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)的反向遗传操作系统，本发明使用构建得到的双向转录/表达质粒双向分别表达马流感病毒PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、NS以及M基因，通过共转染、测序、生长曲线的绘制和酶切鉴定，成功拯救得到一株EIV及其突变体。同时与现有的pBD系统进行产毒量的比较，表明本发明建立的反向遗传操作系统优于pBD系统。本发明的提出为流感病毒的反向遗传研究提供了一种新的技术手段，同时也为日后深入研究马流感病毒的传播，致病机理，乃至疫苗候选株的筛选奠定了坚实基础。

摘要： 本发明涉及一种水貂肠炎病毒反向遗传学操作系统及其应用。本发明提供的水貂肠炎病毒基因，其核苷酸序列以下1）或2）所示：1）SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；2）由SEQ ID No.1自3’端第2323-4577位所示的核苷酸序列。本发明建立的水貂肠炎病毒反向遗传学操作系统可以用于水貂肠炎病毒蛋白的毒力分析，并据此可以制备新型灭活苗或弱毒疫苗；也可根据突变位点作为遗传标志，检测病貂体内的病毒是野毒还是由于疫苗引起的，在生产实践中意义重大。

摘要： 本文提供了包含三种双义基因组节段的基因工程化的皮钦德病毒。第一基因组节段包含编码Z蛋白的编码区和编码L RdRp蛋白的编码区。第二基因组节段包含编码核蛋白(NP)的编码区，并且第三基因组节段包含编码糖蛋白的编码区。所述第二基因组节段和第三基因组节段中的每个任选地包含可编码抗原或可检测标志物的另外编码区。本文还提供了用于制造基因工程化的皮钦德病毒的反向遗传学系统，以及可于产生基因工程化的皮钦德病毒的载体集合。还提供了使用反向遗传学系统的方法，以及用于在受试者中产生免疫应答的方法。

摘要： 本发明涉及以痘苗病毒载体为基础的反向遗传学系统建立及应用，尤其涉及一种重组冠状病毒及其应用。本发明提供的蛋白，来源于含鼠肝炎冠状病毒(mouse hepatitis virus，MHV)A59株，命名为mNSP1，是如下1)或2)的蛋白：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白；2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白。本发明的实验证明，通过缺失突变获得的重组痘苗病毒的DNA，将其DNA通过反转录导入BHK-21细胞中，再与17CL-1共培养，获得MHV的突变体，是一个很好的疫苗候选株。