3D聚合酶突变对肠道病毒A组71型复制影响的研究

摘要

目的 研究3D聚合酶(3D polymerase,3Dpol)突变对肠道病毒A组71型(Enterovirus A71,EV-A71)复制的影响.方法 扩增EV-A71病毒基因组并克隆至TOPO-XL2-PCR载体;应用体外点突变方法在病毒3Dpol 区引入N16S和I256V突变;采用T7聚合酶转录病毒基因组RNA并转染RD细胞,获得N16S和I256V病毒突变株.观察亲本病毒与突变病毒株的增殖特征以及病毒RNA含量.结果 RNA转染RD细胞后可获得具有感染性的病毒.体外增殖试验显示,正常培养条件下(36.5°C)3株病毒增殖趋势一致,感染细胞72 h后病毒滴度和RNA拷贝数均达到峰值且组间差异无统计学意义.温度敏感性试验显示,与正常培养条件比较,病毒在高温(39.5°C)的滴度和RNA拷贝数均大幅下降,并且高温对N16S和I256V突变株的增殖抑制较亲本株更为显著.结论 成功构建EV-A71感染性克隆并获得病毒突变株,3Dpol的N16S和I256V突变在高温条件下可能进一步降低病毒复制能力.