牙鲆

摘要： 为了探究牙鲆感染迟钝爱德华氏菌过程中miRNA的分子调控机制,以牙鲆头肾组织为研究材料,分析其感染迟钝爱德华氏菌后miRNA的差异表达情况.利用高通量测序平台(Illumina HiSeq)分别对感染迟钝爱德华氏菌3 h、6 h以及未感染的牙鲆头肾组织的RNA进行转录组测序,并对数据进行生物信息学分析.将测序结果与斑马鱼miRBase数据库进行比对,共鉴定出牙鲆成熟miRNA 537个.将感染组与对照组数据进行比对,得到12个感染组(3 h)差异显著表达的miRNA(2个显著上调,10个显著下调);32个感染组(6 h)差异显著表达的miRNA(20个显著上调,12个显著下调).对感染组差异显著表达的miRNA的靶基因进行GO seq分析,结果显示,感染组(3 h)的富集通路有2793条(P<0.05),包括2021个生物过程、315个细胞组分和457个分子功能;感染组(6 h)的富集通路有3048条(P<0.05),包括2235个生物过程、342个细胞组分和471个分子功能.KEGG分析结果显示,感染组(3 h)中获得71个富集通路(P<0.05),包括31个有机系统、17个环境信息处理、6个细胞过程、13个人类疾病和4个代谢通路;感染组(6 h)中获得69个富集通路(P<0.05),包括33个有机系统、18个环境信息处理、6个细胞过程、10个人类疾病和2个代谢通路.选取6个差异表达miRNA进行实时荧光定量PCR验证,结果显示,荧光定量结果与转录组测序结果趋势一致.总的来看,在牙鲆感染迟钝爱德华氏菌过程中,差异表达miRNA的靶基因参与的信号通路大部分跟生物过程以及细胞组分中的膜成分有关,生物过程中候选靶基因富集程度最高的GO条目是生物调节,富集程度较高的通路大多跟免疫调节以及分裂分化等生物学过程有关.

摘要： 为研究益生菌制剂对池塘养殖牙鲆(Paralichthys olivaceus)肠道及环境菌群结构的调控效果,采用高通量测序技术和生物信息学分析手段构建牙鲆肠道、养殖水体、饵料和池塘底泥的16S r DNA基因测序文库,分析不同样品中菌群组成和多样性在益生菌制剂调控过程中的变化趋势。结果显示,添加益生菌制剂后,池塘底泥和牙鲆肠道的菌群多样性升高,且池塘底泥的菌群多样性依然最高;而养殖水体的菌群多样性明显下降,并低于牙鲆肠道的。牙鲆肠道中的肠杆菌属(Enterobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)相对丰度呈上升趋势,不动杆菌属(Acinetobacter)、发光杆菌属(Photobacterium)相对丰度先上升后下降;池塘养殖水体中NS3a_marine_group代表的菌属相对丰度先下降后上升;底泥中芽孢杆菌属相对丰度变化最为明显,由最初的3.78%增加到33.64%。养殖牙鲆肠道、养殖水体和底泥中的弧菌属(Vibrio)相对丰度在益生菌制剂添加后出现不同程度的降低。而在水产养殖中,不动杆菌属和弧菌属中的部分菌株通常被认为是重要病原菌。说明益生菌制剂的添加能在一定程度上优化鱼体肠道和环境(养殖水体和池塘底泥)的菌群结构。相似性分析发现,在饵料不变的条件下,牙鲆肠道菌群结构与底泥的更相近;且益生菌产品对池塘底泥和牙鲆肠道菌群的影响较为明显。本研究结果可为池塘养殖过程中微生态制剂筛选和使用提供参考。

摘要： 【目的】改良天津市养殖牙鲆种质,促进当地渔业经济效益和生态效益的提高。【方法】2018年9月—2019年5月对“鲆优2号”牙鲆进行试养,采用性状比较的方法,分析“鲆优2号”牙鲆的生长、体型、抗病和单位增重所产氮、磷量。【结果】“鲆优2号”牙鲆绝对增重率高于普通牙鲆19.41%,绝对增长率高于普通牙鲆16.67%;“鲆优2号”牙鲆平均肥满度低于普通牙鲆22.87%,全长/体长值低于普通牙鲆0.89%,其他体型参数无差别;“鲆优2号”牙鲆体重、全长、体长、头长、体高测量数据的变异系数,分别低于普通牙鲆8.07%、16.03%、16.07%、30.31%、27.88%;“鲆优2号”牙鲆患腹水病的死亡率低于普通牙鲆73.95%,患淋巴囊肿病的死亡率低于普通牙鲆67.14%,试验期间“鲆优2号”牙鲆的终成活率高于普通牙鲆31.07%;试验鱼体重每增长1 kg,“鲆优2号”牙鲆尾水中新增铵态氮、总氮、可溶性磷酸盐、总磷的含量比普通牙鲆分别少48.56%、35.37%、29.68%、37.36%。【结论】“鲆优2号”牙鲆在生长、体型差异以及抗病和单位增重所产氮、磷量等性能方面较普通牙鲆优良,适合在天津市推广。

摘要： 半乳糖凝集素6(Galectin-6)是β-半乳糖苷结合凝集素家族的成员之一。本研究首次分离并鉴定了牙鲆(Paralichthys olivaceus)Galectin-6(PoGalectin-6),分析了其分子特征和表达模式,并对其免疫相关功能进行了研究。PoGalectin-6基因的开放阅读框长为1089 bp,共编码362个氨基酸,其中包含2个糖识别结构域(CRDs)。同源序列比对和系统进化树分析显示,PoGalectin-6与大菱鲆(Scophthalmus maximus)Galectin-4的相似性为80.9%。组织分布结果显示,PoGalectin-6基因主要在肠组织中特异性表达。迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后,PoGalectin-6基因在肠组织中的表达显著升高,感染后12 h表达量最高,随后逐渐降低并恢复至正常水平。细菌结合实验证实,PoGalectin-6重组蛋白(rPoGalectin-6)能够结合枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、迟缓爱德华氏菌和创伤弧菌(Vibrio vulnificus),但并不结合短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。此外,rPoGalectin-6以钙离子依赖的方式对短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、杀鲑气单胞菌和迟缓爱德华氏菌表现出明显的凝集作用。研究表明,PoGalectin-6基因参与了由迟缓爱德华氏菌感染引起的免疫应答,这一发现为探索Galectin-6在硬骨鱼类中的免疫功能奠定了基础。

摘要： 本文采用注射和浸泡灭活鳗弧菌(Vibrio anguillarum)免疫牙鲆(Paralichthys olivaceus),研究其黏液(鳃、皮肤和肠)和胆汁中特异性免疫球蛋白M(IgM)及多聚免疫球蛋白受体同源分子(pIgRL)的变化,分析这两种分子在肠组织中的分布及共定位。研究显示,两种免疫方式均可诱导牙鲆黏液及胆汁中pIgRL和IgM水平升高,pIgRL应答时间早于IgM。浸泡免疫后,牙鲆的鳃、皮肤和肠的黏液及胆汁中pIgRL水平分别于第3、5、7和10天达到峰值,而IgM分别于第7、10、21和21天达到峰值。注射免疫后,上述分泌液中pIgRL分别于第5、7、10和10天达到峰值,而IgM在皮肤和鳃黏液中于第14天达到峰值,在肠黏液和胆汁中于第21天达到峰值。多重染色结果表明:免疫前,pIgRL和IgM阳性信号主要位于肠黏膜固有层;浸泡免疫后,IgM信号增强,随后IgM大量出现于肠上皮层,第14天时荧光最强,pIgRL信号也明显增强且少量出现在肠上皮层,在肠黏膜中观察到代表pIgRL和IgM共定位的橘黄色荧光。ImageJ定量分析显示,二者共定位的像素占比在免疫前为19%,免疫后第3、7、14、21和28天时分别为25%、41%、35%、28%和28%,表明存在IgM-pIgRL复合物的跨上皮转运。研究结果为深入理解pIgRL在黏膜免疫防御中的作用和揭示鱼类黏膜免疫系统功能提供了基础资料。

摘要： 造成牙鲆(Paralichthys olivaceus)工厂化养殖中大规模死亡的主要病原之一是迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda),其有感染力极强、致死率极高的特点,严重影响牙鲆水产养殖产业的健康发展.神经营养因子3(neurotrophin3,NTF3)是一种神经营养因子,可能参与免疫系统的调节.为研究NTF3在牙鲆先天免疫中的功能,本研究克隆了牙鲆NTF3基因的全长cDNA序列,其长度为1411 bp,其中,5'非编码区长89 bp,3'非编码区长428 bp,ORF长894 bp.基因ORF编码297个氨基酸.预测分子量(molecular weight,Mw)约为33.73 ku,理论等电点为9.56.同源比对发现,NTF3基因在不同物种间的相似度较高,牙鲆与高体鰤(Seriola dumerili)NTF3基因的同源性最高,为90.91％.NTF3基因在牙鲆健康组织(血液,肝脏,脾脏,肾脏,肠,皮肤,鳃,心脏和脑)中均有表达,皮肤中的表达量最高,血液中次之.为进一步探究牙鲆感染迟缓爱德华氏菌过程中NTF3相对表达量的变化,本研究对健康牙鲆进行了迟缓爱德华氏菌感染实验,比较了NTF3在4种组织(脾脏,肝脏,肠,肾脏)不同感染时间点的相对表达量,在脾脏、肝脏、肠中,牙鲆感染迟缓爱德华氏菌后NTF3基因的表达量均出现上调,但在肾脏中,NTF3的表达量呈现下调趋势.上述结果表明,NTF3基因参与了牙鲆抵抗迟缓爱德华氏菌感染的免疫过程,而病菌感染后不同组织中NTF3基因的相对表达量差异的结果为今后更深入研究NTF3基因在牙鲆免疫应答过程中发挥的作用提供了基础研究数据.

摘要： 以裂壶藻为饵料强化剂,设置不同的裂壶藻强化剂使用量及强化时间,研究其对繁育期牙鲆苗种生长发育的影响.结果表明,轮虫强化密度为450个/mL,卤幼强化密度为150个/mL.当轮虫强化剂使用量为0.09 g/L,强化时间12 h,卤幼饵料强化剂使用量为0.10 g/L、强化时间20 h时,牙鲆苗种的发育、驯化情况最好,存活率最高,生长速度最快.通过对强化持续期的对比发现,强化饵料投喂20 d时牙鲆苗种变态存活率趋于稳定,无白化、病害发生,个体生长均匀、生长速度快.

摘要： 为研究miR-202-5p在鱼类中作用的靶基因及功能,采用荧光定量PCR和原位杂交技术构建了miR-202-5p在牙鲆(Paralichthys olivaceus)不同组织和雌雄性腺中的表达谱.定量结果发现,miR-202-5p在牙鲆性腺中具有特异性的高表达,且在精巢中的表达水平高于卵巢.原位杂交结果显示,miR-202-5p主要在精巢的精原细胞和精母细胞中表达,而仅在卵巢的Ⅳ和Ⅴ期卵母细胞中有较强烈表达.研究发现色素框同源蛋白2(Chromobox homolog 2,CBX2)在性腺发育中具有重要调节作用,为进一步研究miR-202-5p在牙鲆性腺发育中的功能,采用生物信息学方法预测和双荧光素酶报告基因技术鉴定了二者的靶向关系,结果证实,cbx2为miR-202-5p直接调节的靶基因,为深入阐述miR-202-5p在牙鲆性腺发育中的作用机制提供了基础.

摘要： 文章研究了流水养殖条件下不同投喂频率对牙鲆(Paralichthys olivaceus)成鱼摄食量、生长、消化酶、抗氧化酶和肠道组织的影响,旨在探究牙鲆成鱼的最适投喂频率。实验设置3个处理组,每天分别投喂2(T2)、3(T3)、4(T4)次,持续60 d。结果显示,T3组的日摄食量显著大于T2和T4组(P<0.05);T2和T3组的特定生长率和成活率无显著差异,且均显著高于T4组(特定生长率:P<0.05;成活率:P<0.01);3组间增重率有显著差异(P<0.05);T2和T3组的过氧化氢酶(CAT)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)和脂肪酶(LPS)无显著差异,但均显著高于T4组(CAT、LPS:P<0.01;T-SOD:P<0.05);3组间胃蛋白酶(PPS)有显著差异(P<0.05),T3、T2、T4组依次降低;T4组的肠壁厚度、环肌厚度和杯状细胞数均显著低于T2和T3组(P<0.01),但T2和T3组间无显著差异;T3组的上皮细胞厚度显著高于其他两组(P<0.05),T2和T4组差异不显著。结合研究结果和养殖实际情况,流水养殖条件下牙鲆养成过程中的最适投喂频率为每天3次。

摘要： 本文从牙鲆(Paralichthys olivaceus)中鉴定得到了PI3K家族的成员之一——PIK3R3-like,并分析其可能为PIK3R3的亚型.由于其部分外显子在转录或修饰时被删除,导致该基因会产生一种较短的mRNA(PoPIK3R3-like-Ⅱ),与完整的转录组相比缺失21 nt.对PoPIK3R3-like的可变剪接长链(PoPIK3R3-like-Ⅰ)进行序列分析发现该基因包含一个1425 bp的开放性阅读框,共编码474个氨基酸,编码的蛋白共包含三个结构域,分别是一个nSH2结构域、一个iSH2结构域和一个cSH2结构域.同源性分析结果显示PoPIK3R3-like-Ⅰ、PoPIK3R3-like-Ⅱ均与其它硬骨鱼的PIK3R3-like相似度较高,系统进化分析显示PoPIK3R3-like与硬骨鱼聚为一支,与两栖类、鸟类和哺乳类相距较远.作者通过qRT-PCR检测了PoPIK3R3-like在各组织中的表达分布,发现其在牙鲆的各组织中均有表达,但在鳃和脑中表达量较高,使用迟缓爱德华氏菌侵染牙鲆鳃细胞及单核-巨噬细胞后,PoPIK3R3-like表达量分别呈现先上升再下降和显著上升的趋势,提示该基因在牙鲆抵抗迟缓爱德华氏菌感染相关的免疫应答中可能发挥作用.利用原核表达的方法在大肠杆菌中异源表达了PoPIK3R3-like-Ⅰ的重组蛋白,SDS-PAGE结果显示得到的重组蛋白与预测大小一致,蛋白纯化结果显示得到的蛋白纯度较高,可用于下一步PIK3R3-like基因功能的相关研究.

摘要： 本研究旨在通过MiSeq 16S rRNA高通量测序的方法，分析牙鲆仔稚幼鱼发育阶段肠道菌群多样性及其形成过程，揭示工厂化人工育苗模式下牙鲆仔稚幼鱼肠道菌群结构，为深入研究牙鲆养殖过程中肠道菌群形成机制及调控技术提供理论基础。

摘要： 牙鲆幼苗在患肠道白浊病和腹水病后，肠道白浊，腹部膨大，肛门常拖有线状粪便，进食能力明显变弱，泼洒渔药对鱼病的防治作用较好，对于患病早期的病鱼浴饵的作用要强于泼洒渔药，患病后期病鱼基本不摄食，主要还要依赖泼洒渔药来防治，但治疗效果很差，还是以防为主以治为辅。牙鲆稚鱼肠道白浊病发病急，流行快，药物没有产生效力前鱼即死亡，至今仍未找到有效的治疗方法。和假单胞菌等多种细菌。据专家试验，在培养轮虫的全部死亡。牙鲆稚鱼鱼肠道白浊病发病急，流行快，药物没有产生效力前鱼即死亡，至今仍未找到有效的治疗方法。轮虫是牙鲆鱼的初期饵料，也是这种疾病的主要感染源。所以，培养轮虫时，要设法防止病原菌感染，尽量使用经过过滤无病菌的海水培养轮虫。

摘要： 关于牙鲆遗传多样性的研究,我国报道较多.如刘海金等(2008)用16个微卫星标记对丹东、北戴河、威海、青岛、荣成5个牙鲆养殖群体进行遗传多样性分析,马晓冰等(2012)利用18个微卫星标记对渤海海域的野生牙鲆进行遗传分析,刘永新等(2013)用牙鲆24个连锁群上不同区域的72个微卫星标记对渤海流域野生牙鲆进行了遗传分析,陈睿毅(2013)利用8个微卫星标记对牙鲆增殖放流亲本群体、放流群体和野生群体进行了遗传多样性.主要研究方法集中在微卫星标记上.关于mtDNA控制区作为分子标记研究牙鲆种群遗传多样性报道较少,仅有日本的Sekino等(2002)采用对日本牙鲆3个野生群体和3个养殖群体以及Song等(2011)采用对我国牙鲆2个野生群体和8个养殖群体的遗传多样性进行了研究,但尚未见mtDNA标记在牙鲆增殖放流亲本遗传多样性研究中的报道.

摘要： 浸泡免疫是一种便捷有效的鱼类疫苗接种途径,而浸泡策略与参数的优选与优化可有效提升疫苗的接种效果.本论文以4种不同浓度的迟钝爱德华氏菌灭活菌苗(106,107,108,109CFU ml-1)对牙鲆进行3个不同时间长度的浸泡免疫(30,60,90min),在免疫后第6周以活菌进行攻毒,结果显示109-30min,108-60min,108-90min和107-90min四个免疫组显示出较高的相对免疫保护率,其中又以108-60min免疫组最高.比较研究了3种不同高渗海水(50、60和70‰)浸泡牙鲆后对浸泡免疫效果的影响，通过攻毒实验以及对抗体水平及各组织中slg+淋巴细胞比例的跟踪监测，免疫参数及攻毒实验数据均显示牙鲆在经50‰高渗海水浸泡处理后再进行疫苗浸泡接种可获得最佳的接种效果。研究结果为开展牙鲆疫苗的浸泡免疫接种提供了重要参考，同时也为疫苗接种效果的评价提供了新思路。

摘要： 不育是一个影响所有生物的问题.在鱼类中,经有丝分裂雌核发育产生的单倍体再经染色体加倍产生的双单倍体通常是不育的,因此限制了利用双单倍体在基础生物学和育种研究中的应用.但是,这些不育的双单倍体同时也为研究鱼类性腺发育的调控机制提供了难能可贵的材料.2009年4月以一尾野生牙鲆为亲本进行有丝分裂雌核发育诱导,获得了200余尾双单倍体.2012年待这些双单倍体性成熟后,开始每年对其进行检查,观察其性腺发育情况,对可育个体的卵子进行人工授精确认后代的存活性.经过3年跟踪检查,发现在生殖季节可育个体腹部膨大松软,而不育个体腹部较为平坦.解剖发现可育双单倍体卵巢外观为橙色,表面血管丰富呈网状排列,卵巢膜透明,靠近泄殖孔处聚集大量成熟卵子,轻压腹部有成熟卵子流出.卵巢性腺指数在8％～11％;而不育牙鲆的卵巢外观呈黄色,表面主血管清晰可见,微血管较少,卵巢膜呈现白色,轻压腹部不能挤出卵粒,卵巢GSI介于3.77％～4.17％,显著低于可育牙鲆(P＜0.05).

摘要： 在有丝分裂雌核发育牙鲆(Paralichthys olivaceus)中出现数量较多的不育个体,利用组织切片观察比较不育牙鲆的组织学特点,利用分离群体分组分析法筛选不育相关的微卫星标记.结果表明:不育牙鲆的性腺指数为3.77％～4.17％,显著小于可育牙鲆(P＜0.05).不育牙鲆的卵巢微血管较少,卵巢膜呈现白色,卵巢较硬,没有游离卵粒;切片结果显示,其卵巢处于Ⅲ期.通过对209个微卫星标记的筛选,共找到11个在可育和不育群体间有差异的标记;利用同一家系可育和不育的个体进行验证后发现位于15号连锁群的4个标记与牙鲆的育性紧密相关.

摘要： 构建了牙鲆肠道、养殖水体、饵料和池塘底泥等7个样品的16s rRNA 基因测序文库,分析了不同样品中菌群组成和生物多样性,采用MiSeq 高通量测序技术和生物信息学分析手段,比较了池塘和工厂化养殖条件下牙鲆肠道菌群结构差异及其与饵料、水环境、底质等的关系.结果表明:池塘养殖牙鲆肠道(B1)中以厚壁菌门(30.49 ％)、变形菌门(19.16 ％)和梭杆菌门(11.11 ％)为主,其中芽孢杆菌属(27.66 ％)占绝对优势,弧菌属(0.16 ％)丰度最小;工厂化养殖牙鲆肠道(B5)中以变形菌门(44.31 ％)、厚壁菌门(11.57 ％)和放线菌门(4.79 ％)为主,其中不动杆菌属(10.37 ％)丰度最大,弧菌属(4.05 ％)相对B1 中丰度较高.牙鲆肠道优势菌群主要与营养代谢调节相关，同时益生菌和致病菌也是肠道菌群的重要组成部分。差异性和系统进化分析表明两种养殖条件下牙鲆肠道菌群结构与饵料中菌群关系密切，此外受养殖水环境中菌群影响较大。研究结果将为今后牙虾养殖专用高效微生态制剂的研制和养殖环境微生态调控技术构建提供理论依据。

摘要： 通过统计学、酶联免疫学等方法研究3个池塘中养殖牙鲆(Paralichthys olivaceus)的生长状况、血清甲状腺激素(T4)和三碘甲状腺原氨酸(T3)、生长激素(GH)和类胰岛素生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)的变化及他们与水温变化的关系.结果表明:在12个月的养殖过程中,牙鲆体重和体长持续增长且体重日增长率和体长日增长率在7、9、10月份较高.牙鲆血清中T3、T4、GH和IGF-Ⅰ含量变化随着水温变化呈现明显的季节性变化规律.1号、2号、3号池塘牙鲆血清中T3、T4含量变化整体趋势一致,血清中T4浓度在6、8、11月份出现较高值,T3浓度在7、9、翌年的3月份出现较高值.血清中GH在6月份达到最高水平,然后逐步降低,在12月份降低到最低水平;从12月份到翌年3月份呈略微上升趋势之后下降.血清中IGF-Ⅰ水平从6月份到7月份升高,并在7月份达到高峰,然后逐步降低,翌年的2月份之后随水温升高而升高.1号和2号池塘牙鲆经过7个月养殖,当年可以出售.同时发现养殖的牙鲆可以在实验池塘安全越冬,并在翌年牙鲆进一步生长.该池塘养殖条件下,牙鲆的养殖密度和出池时牙鲆的平均体重均高于传统养殖池塘,是值得推广的高效养殖模式.

摘要： 通过统计学、酶联免疫学等方法研究3个池塘中养殖牙鲆(Paralichthys olivaceus)的生长状况、血清甲状腺激素(T4)和三碘甲状腺原氨酸(T3)、生长激素(GH)和类胰岛素生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)的变化及他们与水温变化的关系.结果表明:在12个月的养殖过程中,牙鲆体重和体长持续增长且体重日增长率和体长日增长率在7月、9月、10月较高.牙鲆血清中T3、T4、GH和IGF-Ⅰ含量变化随着水温变化呈现明显的季节性变化规律.1号、2号、3号池塘牙鲆血清中T3、T4含量变化整体趋势一致,血清中T4浓度在6月、8月、11月出现较高值,T3浓度在7月、9月、翌年的3月出现较高值.血清中GH在6月达到最高水平,然后逐步降低,在12月降低到最低水平;从12月到翌年3月呈略微上升趋势之后下降.血清中IGF-Ⅰ水平从6月到7月升高,并在7月达到高峰,然后逐步降低,翌年的2月之后随水温升高而升高.1号和2号池塘牙鲆经过7个月养殖,当年可以出售.同时发现养殖的牙鲆可以在实验池塘安全越冬,并在翌年牙鲆进一步生长.该池塘养殖条件下,牙鲆的养殖密度和出池时牙鲆的平均体重均高于传统养殖池塘,是值得推广的高效养殖模式.

摘要： 本实验在中国水产科学研究院北戴河中心实验站开展。2007年，以真明精子作为异源精子，经紫外线照射火活，激活一尾雌性野生牙虾所产卵子，并在激活后3min，施以40°C,45min的冷体克处理进行减数分裂雌核发育诱导，获得第一代减数分裂雌核发育家系(Meio-G1)。2009年，利用Meio-G1内发育成熟的一尾个体再度诱导减数分裂雌核发育，获得连续第二代减数分裂雌核发育家系(Meio-G2)。2014年，以Meio-G2家系内三尾性成熟个体进行减数分裂雌核发育诱导，首次获得三个连续三代减数分裂雌核发育二倍体家系(Meio-G3-1,Meio-G3-2，M eio-G3-3)。选用重组率高、中、低的30对微卫星引物，分析该三个家系的遗传构成。30个微卫星位点在三个家系中扩增到的等位基因数分别为35、38、37，平均等位基因数为1.17、1.27、1.23，平均观测杂合度(H。)分别为0.1467、0.2556、0.2056,平均纯合度分别为0.8533、0.7444、0.7944。三个家系内个体间的平均遗传相似度为0.9913、0.9918、0.9838，母本与子代之间的平均遗传相似度为0.9946、0.9968、0.9923，三个家系间的遗传相似度分别为0.9717(Meio-G3-1和Meio-G3-2)、0.9810(Meio-G3-1和Meio-G3-3)、0.9714(Meio-G3-2和Meio-G3-3)。结果表明，连续三代诱导雌核发育能进一步提高个体的纯合度、个体间以及家系间的平均遗传相似度，是快速建立鱼类近交系的良好方法，也是进行牙虾良种选育、QTL(quantitative trait locus)定位及其他遗传学研究的有力手段。

摘要： 本发明提供了一种牙鲆卵原干细胞培养液及牙鲆卵原干细胞体外培养方法及应用，涉及生物技术领域。所述培养液包含以下成分：10％‑15％的FBS，0.9％‑1.2％的牙鲆血清，80‑120μmol/L的β‑巯基乙醇，380‑450U/mL的青霉素，0.35‑0.50mg/mL的链霉素，0.8‑1.3μg/mL的两性霉素B，1.5‑2.5ng/mL的bFGF以及1.5‑2.5ng/mL的LIF。本发明通过摸索牙鲆卵原干细胞的体外培养条件，提供了适于卵原干细胞的培养液并建立了卵原干细胞体外稳定传代的培养方法，最终获得了比例较高的卵原干细胞，并提供了全方面鉴定卵原干细胞的方法以及应用。

摘要： 本发明提供了一种牙鲆精原干细胞培养液及建立牙鲆精原干细胞系的方法，涉及生物技术领域。所述培养液包含以下成分：10％‑18％的FBS、0.8％‑1.2％的牙鲆血清和40‑60μmol/L的β‑巯基乙醇(β‑ME)。本发明通过摸索牙鲆精原细胞的体外培养及纯化方法，提供了适于精原干细胞的培养液并建立了适宜精原干细胞稳定传代的培养条件，最终获得了比例较高的精原干细胞，并提供了全方面鉴定精原干细胞的方法。

摘要： 本发明涉及海水鱼类细胞培养技术，具体说是一种牙鲆肌卫星细胞系的构建方法及其鉴定牙鲆肌卫星细胞标记基因的特异性引物和应用。是将牙鲆肌肉组织经原代培养和传代培养，继而构建细胞系；构建后冷冻保存、复苏和鉴定，其中原代培养和传代培养中所采用的细胞培养液为在细胞培养液中添加胎牛血清和人碱性成纤维细胞生长因子。建立的牙鲆肌卫星细胞系形态为梭形或纺锤形单核细胞，该细胞系可以连续传代，能提供大量牙鲆肌卫星细胞。不仅可直接用于牙鲆肌肉发育相关功能基因的研究，为探索鱼类肌肉分化途径的分子机制研究提供丰富的细胞来源，而且可望为牙鲆养殖生产中肌肉性状改良研究及应用提供研究平台。

摘要： 本发明公开了一种流式细胞术分选牙鲆CD4+T淋巴细胞的方法，包括如下步骤：取牙鲆头肾组织，经Percoll密度梯度离心法，获得头肾淋巴细胞；在头肾淋巴细胞中加入抗牙鲆CD4‑1和CD4‑2分子的单克隆抗体和FITC标记的羊抗鼠IgG孵育；以磷酸盐缓冲液为流式细胞仪的鞘液，用胎牛血清润洗1.5mL无酶离心管，将其置于流式细胞仪分选仓中的流式收集管上；孵育抗体后的淋巴细胞经流式细胞仪分析，设置CD4+T淋巴细胞门进行细胞分选；荧光显微镜下观察分选细胞的纯度，并通过PI和台盼蓝染色测定细胞的活性。本发明通过使用适合于鱼类淋巴细胞的磷酸盐缓冲液和收集分选细胞的装置，创造性地建立了流式细胞术分离海水鱼类CD4+T淋巴细胞的方法，具有重要的科学意义和应用价值。

摘要： 本发明公开了一种检测牙鲆抗病力的引物、重组蛋白及其应用，属于分子生物学技术领域，所述的引物序列为SNP‑Rnd1‑FCAGAGGAACAGCGGAATAGT，SNP‑Rnd1‑RGCTCCCCAAAAGGTAAGATA。本发明还提供利用所述引物在牙鲆抗病品种选育中的应用，选择出具有特异性扩增目的片段的个体作为亲本，进行牙鲆抗病新品种的选育。基于牙鲆Rnd1基因序列SEQ IP NO.3重组获得的重组蛋白对金黄葡萄球菌、大肠杆菌、迟缓爱德华氏菌、哈维氏弧菌均具有抑制作用，本发明还提供所述重组蛋白在制备防治牙鲆细菌病生物药品中的应用。

摘要： 本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种牙鲆补体成分C3a(PoC3a)的应用。牙鲆补体C3a为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。本发明的牙鲆补体C3a蛋白能够与多种细菌结合，且能显著抑制牙鲆体内迟缓爱德华氏菌数量的增加。所得蛋白在抗细菌感染中具有应用潜能。

摘要： 本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种牙鲆补体成分C3(PoC3)的应用。牙鲆补体成分C3(PoC3)在制备杀菌剂中的应用。本发明补体成分C3是来自于牙鲆补体系统的一种天然蛋白。该补体成分C3蛋白可制备为杀菌剂，其制备过程简单，对环境和鱼体均无安全隐患，进而所得蛋白在抗细菌感染中具有应用潜能。

摘要： 本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种编码牙鲆IGF2可溶性蛋白的基因、编码蛋白及在促细胞增殖中的应用。具体公开了编码牙鲆IGF2可溶性蛋白的基因并利用该基因编码牙鲆IGF2可溶性蛋白，本发明将该基因构建真核表达载体和转染至人胚胎肾细胞HEK293T，在体外获得牙鲆IGF2可溶性蛋白，该蛋白具有促进细胞增殖的作用。

摘要： 本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及牙鲆Dmrt1重组蛋白及应用。本发明利用体外重组表达技术首次获得了牙鲆Dmrt1重组蛋白，提供了重组蛋白的制备方法，并利用重组蛋白孵育牙鲆性腺组织，表明其具有生物活性。本发明将重组Dmrt1蛋白注射至牙鲆雌鱼成体的腹腔，引起其卵巢组织中卵母细胞的细胞核染色质凝缩。进一步将其注射到性腺未分化鱼苗的腹腔中，分别引起幼鱼体内雌激素和雄激素水平的显著下降和升高(p0.05)，并且雄性率从0％增加至82％。表明所述重组蛋白能够用于牙鲆等鱼类的性别控制，可以为鱼类养殖中的性别控制和单性生产提供新的方法和途径。

摘要： 本发明涉及一种牙鲆T淋巴细胞表面标志分子CD8α抗体及其制备方法和应用，属于鱼类分子免疫学技术领域。上述牙鲆T淋巴细胞表面标志分子CD8α的多克隆抗体，是由氨基酸序列为：APRVIASTRSPSLT的牙鲆CD8α抗原表位肽‑KLH复合物免疫新西兰大白兔，纯化其血清而成。间接免疫荧光和免疫印迹实验显示本发明的兔多抗能够与转染牙鲆CD8α真核质粒的HEK293细胞和牙鲆头肾淋巴细胞反应。流式细胞术检测牙鲆外周血淋巴细胞中CD8α+T淋巴细胞数量比例为5.6±0.8%，脾脏淋巴细胞中CD8α+T淋巴细胞数量比例为14.8±1.6%，头肾淋巴细胞中CD8α+T淋巴细胞数量比例为19.5±0.9%。这些结果表明，上述多克隆抗体可以用作鉴定牙鲆T细胞亚群试剂，或用作研究牙鲆CD8+T淋巴细胞免疫应答的试剂。