全细胞催化

摘要： 高果糖浆是一种可替代蔗糖的甜味剂,在食品和饮料行业应用广泛。该研究实现了经密码子优化的密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis) CICIM B0118(A)来源的葡萄糖异构酶在食品安全菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) 13032中的异源表达,构建了重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum 13032/pXMJ19-xylA。以其细胞菌体作为全细胞催化剂,对D-葡萄糖异构化生成D-果糖的全细胞转化体系进行优化,结果表明,菌体质量浓度40 g/L、底物D-葡萄糖质量浓度180 g/L、Mg^(2+)浓度10 mmol/L、Co^(2+)浓度1 mmol/L,70°C、220 r/min下连续转化18 h,D-果糖质量浓度达到103.32 g/L,转化率为57.4%,实现了高果糖浆的一步法安全生物合成。该研究为高果糖浆的工业化生产提供了实验和理论基础,具有重要的参考价值。

摘要： 通过代谢调控大肠杆菌EMP途径中的NADP;依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶和过表达NAD激酶,构建了羰基还原酶和NADPH再生偶联体系E.coli BL21(DE3)/pETDueT-1-gapB-bcCR&pET-28a-yfjB,以强化NADPH的内源性合成,为β-酮酯的不对称还原过程提供足够推动力。结果表明,通过EMP调控与引入NAD激酶可使胞内NADPH合成能力提高2.19倍;以4-氯乙酰乙酸乙酯为模型底物,改造后的工程菌不对称合成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的转化效率提高了1.69倍,目标手性醇的产率高达98.18%,对映体过量值超过99%。

摘要： 蒜糖醇是一种在食品、医药等领域具有较大应用前景的新型功能性甜味剂。为实现蒜糖醇的绿色生物合成,基于稀有糖转化策略通过共表达葡萄糖异构酶、D-阿洛酮糖3-差向异构酶及核糖醇脱氢酶,在大肠杆菌体内建立了利用廉价底物D-葡萄糖生产蒜糖醇的多酶级联系统;并通过偶联甲酸脱氢酶构建辅因子循环系统,提高胞内还原型辅酶Ⅰ的再生效率。为平衡多酶级联系统中的个体表达差异,以全细胞催化活性为指标,对细胞工厂的发酵条件和催化条件进行了优化。结果表明:重组菌在20°C、1.00 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的发酵条件下,诱导24 h可得到较佳的蛋白质表达量;在40°C、50 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0)及5.0 g/L甲酸钠的催化条件下,全细胞可在15 h内转化25.00 g/L的D-葡萄糖生成19.33 g/L蒜糖醇。通过表达系统的优化进一步降低了底物和中间产物的残留量,蒜糖醇的产量提高至21.12 g/L。研究旨在为全细胞生物转化法实现蒜糖醇的规模化合成提供理论依据,探索以预处理甘蔗糖蜜为底物生产蒜糖醇的可行性,希望对延长糖产业链,提高糖产品附加值起到积极作用。

摘要： 腈水合酶(nitrile hydratase,NHase)可以将腈类物质通过水合作用转化生成更有利用价值的酰胺类化合物,在工业上被用于生产烟酰胺、丙烯酰胺等重要化学品。然而,尚无兼具对底物和产物耐受性高以及催化活性高的腈水合酶,导致底物不能被彻底利用、酰胺产物的产量受限。该研究协同表达了高催化活性的低分子质量腈水合酶(L-NHase)和高耐受性的高分子质量腈水合酶(H-NHase),并优化两类酶在质粒上的排列位置。其中BAE-BAG菌株对底物、产物的耐受性与H-NHase菌株相仿;在以烟腈或者丙烯腈为底物进行全细胞催化时,该菌株的催化速率与L-NHase菌株相仿,最终烟酰胺产量可达到516 g/L,是目前报道的最高产量;丙烯酰胺产量比原始BAE或BAG菌株提高19.1%以上。该文成功协同两类腈水合酶,同时提高了合成烟酰胺和丙烯酰胺的催化反应速率及产量,对工业应用具有一定的指导意义。

摘要： γ-氨基丁酸是一种重要的生物活性因子,通过谷氨酸脱羧酶(GAD)使L-谷氨酸脱羧而合成。作者首先将酿酒酵母谷氨酸脱羧酶基因进行克隆并实现其在大肠杆菌中表达。通过亲和层析纯化获得了比活力高达66.55 U/mg的重组酶ScGAD。进一步酶学性质分析结果表明,ScGAD最适反应温度为60°C,最适反应pH为4.0,且在30~50°C、pH 4.0~9.0时表现出优越的稳定性;其动力学参数Km为14.28 mmol/L,对L-谷氨酸具有较好的亲和力。最后通过全细胞制备γ-氨基丁酸(GABA)的最适条件探究,得到GABA生成效率最高的条件为60°C、pH 4.0,在此条件下,100 mmol/L底物L-谷氨酸经全细胞催化可合成GABA 35.9 g/(g·h)。该研究为GABA高效生产提供依据。

摘要： 研究旨在克隆新的四氢嘧啶合成基因簇,并对其功能进行鉴定,为应用于四氢嘧啶的生产奠定基础。从新喀里多尼亚弧菌CGJ02-2中克隆获得四氢嘧啶合成基因簇ectABC,ectABC与表达载体pBAD连接后转化至大肠杆菌BW25113中,通过L-阿拉伯糖诱导表达。采用SDS-PAGE和液质联用鉴定重组表达蛋白,利用全细胞催化合成四氢嘧啶,通过高分辨质谱鉴定四氢嘧啶,并从天冬氨酸浓度、KCl浓度、温度和pH 4个方面优化催化条件。结果表明,来自新喀里多尼亚弧菌CGJ02-2基因组的ectABC大小为2235 bp。SDS-PAGE显示表达产物中有3个重组蛋白产生,液质联用鉴定表明其分子量分别与ectA、ectB、ectC的理论分子量一致。高分辨质谱分析发现全细胞催化上清中有四氢嘧啶产生。优化后的最适全细胞催化条件为:天冬氨酸浓度100 mmol·L^(-1),KCl浓度100 mmol·L^(-1),温度30°C,pH 7.0,最优条件下产量为1.11 mg·mL^(-1)。研究从弧菌中克隆了四氢嘧啶合成基因簇ectABC,并在大肠杆菌BW25113中实现了异源表达和低盐环境下的四氢嘧啶合成,为大规模发酵生产四氢嘧啶奠定了基础。

摘要： 借助pACYCDuet-1和pET28a双质粒共表达系统,构建携带Agrobacterium radiobacter来源扁桃酸消旋酶(Ar mandelate racemase,ArMR)、Lactobacillus harbinensi来源D-扁桃酸脱氢酶(Lh D-mandelate dehydrogenase,LhDMDH)和Exiguobacterium sibiricum DSM 17290来源L-亮氨酸脱氢酶(Es L-leucine dehydrogenase,EsLeuDH)编码基因的重组大肠杆菌,将其命名为E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-l-EsLeuDH-LhDMDH:pET28a-ArMR.在低温、低浓度诱导剂的诱导下,该重组菌成功表达了具有各自催化活性的3 种重组酶,其发酵液中LhDMDH、EsLeuDH和ArMR的活性分别为195.8、56.2 U/mL和174.5 U/mL.以诱导后的全细胞为催化剂、D,L-扁桃酸为底物,在D,L-扁桃酸初始浓度50 mmol/L、pH9.5的500mmol/LNH4C1-NH3·H2O缓冲液体系下,180r/min、30°C反应48 h后,L-苯甘氨酸得率可达77.48％,其对映体过量值大于99％.本研究具有较大的产业化潜力,为实现L-苯甘氨酸规模化的生物合成奠定了坚实的基础.

摘要： 为实现生物法工业化生产乙醛酸,采用基因工程技术对甘氨酸氧化酶(ThiO)进行表达优化,使用SDS-PAGE电泳手段验证ThiO的可溶性表达,通过全细胞转化法检测重组菌体生产乙醛酸的能力,并优化了反应条件,在放大体系中考察其应用性.结果表明:构建的菌株Bacillus subtilis 168(pP43NMK-ThiO)实现了ThiO的可溶性表达,全细胞转化甘氨酸生产乙醛酸的产量超越了当前生物法制备的最高产量.全细胞催化剂的最佳反应条件为温度30°C和pH值8.3,在35°C内保持高热稳定性,保温8 h后仍保持90％以上反应活性.在最佳反应条件下添加终浓度1％的过氧化氢酶使得乙醛酸产量提升,相对产率提高了30％.3 L发酵罐上的结果与摇瓶上一致,显示出全细胞法制备乙醛酸的稳定的转化能力,为其工业化奠定了基础.

摘要： 2,5-二甲基吡嗪(2,5-dimethylpyrazine,2,5-DMP)在食品香料与医药方面具有重要的经济价值,工业上普遍采用环境不友好且反应条件苛刻的化学合成法来生产.文中结合代谢工程和辅因子工程策略设计高效催化L-苏氨酸合成2,5-DMP的全细胞催化剂,实现微生物转化法合成2,5-DMP.本研究首先分析了不同微生物来源的苏氨酸脱氢酶(Threonine dehydrogenase,TDH)对2,5-DMP合成的影响,发现来源于大肠杆菌Escherichiacoli中EcTDH具有最佳的催化能力,2,5-DMP产量达到(438.3±23.7)mg/L.随后结合辅因子工程,通过引入乳脂链球菌Lactococcuscremoris中NADH氧化酶(NADH oxidase,LcNoxE)并优化其表达方式发现通过融合表达EcTDH和LcNoxE可平衡胞内NADH/NAD+水平,维持较高细胞存活率,进一步提高2,5-DMP产量.最后,通过阻断合成2,5-DMP的支路代谢途径,可以显著减少副产物积累,增加2,5-DMP产量,同时提高L-苏氨酸转化率.最终获得的重组菌EcΔkΔAΔBΔA/TDHECNoxELC-PSstT在含有5 g/L L-苏氨酸的转化体系中于37 °C、200 r/min孵化24 h,可积累(1 095.7±81.3)mg/L的2,5-DMP,L-苏氨酸转化率达到76％,产物得率为0.288 g/(gL-苏氨酸).因此,文中构建的重组菌可以实现高效催化L-苏氨酸合成2,5-DMP,具有一定的工业应用潜力.

摘要： 为实现生物法"一步"合成他汀类药物侧链中间体(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧己内酯,采用生物偶联的方法分别构建不同抗性的两种重组质粒,即来源于Streptococcus suis的脱氧核糖醛缩酶基因与Lodderomyces elongisporus的醇脱氢酶基因的重组质粒,将两种重组质粒共转化于大肠杆菌BL21同一细胞中,实现两种酶的可溶性共表达.以重组大肠杆菌为生物催化剂,全细胞催化两种底物:400 mmol/L乙醛与200 mmol/L氯乙醛发生反应,获得产物(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧己内酯.在缺少标准产物对照的条件下,利用质谱(MS)以及氢谱(1H-NMR)进行产物鉴定,最终确定合成的产物为他汀类药物侧链中间体(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧己内酯.

摘要： 己酸乙酯是一种广泛应用于食品调香的酯类香料,主要用作白酒、食醋、糖果的调香剂.在众多脂肪酶中,南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipaseB,CALB)的用途最为广泛,其在酯化,水解,转酯,以及其他类型反应[1]中都表现出比其它脂肪酶更为出色的催化活性.以表面展示有南极假丝酵母脂肪酶B的酿酒酵母全细胞作为催化剂生产己酸乙酯,具有固定化脂肪酶的优点,且酶制剂生产工艺简单,无需固定化即可用于催化己酸乙酯的生产,反应后收集菌体即可重复利用,大大降低生产成本.本文利用a-凝集素表面展示系统将南极假丝酵母脂肪酶B锚定在酿酒酵母细胞表面,并用于全细胞催化己酸乙酯的生产的研究,反应条件温和、转化率高,是一种很有希望工业化的新途径.

摘要： 酵母展示技术是将外源蛋白与酵母细胞壁蛋白的融合，并将外源蛋白表达在酵母细胞表面。酵母展示技术已广泛应用于各种功能蛋白的表达及筛选。本文重点介绍酵母展示技术在脂肪酶展示体系构建及其在脂肪酸醋生物合成的应用。

摘要： 本发明涉及一种细胞表面展示磷脂酶D酵母全细胞催化剂催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，步骤为：将全细胞催化剂加入含有丝氨酸、CaCl2、Triton-X100的醋酸缓冲液中，与含有卵磷脂的氯仿溶液混合均匀，在30°C下混合得到均匀的乳状液反应5-6小时；反应结束后静止自然分层，提取有机相；有机溶剂挥发后剩余物经氯仿洗涤两次，即可得到磷脂酰丝氨酸。本发明利用磷脂酶D的高度专一性，催化卵磷脂和丝氨酸生成磷脂酰丝氨酸，且全细胞催化剂具有固定化酶的优点，可重复使用，有效解决了目前提浸法和化学合成法存在的问题，制备工艺简单，适合工业化生产。

摘要： 本发明公开了一种能够高效催化制备生物柴油的新型纤维生物基材料固定化全细胞催化剂及其制备方法,所述的全细胞催化剂通过如下步骤制备：产脂肪酶真菌孢子悬浮液的制备；固定化载体的预处理；固定化全细胞生物催化剂的制备；固定化全细胞生物催化剂的交联处理。本方法的固定化全细胞生物催化剂具有制备方法简单、固定效果好和成本低等优点，采用本方法固定化全细胞生物催化剂催化植物油甲酯化催化制备生物柴油，催化剂重复使用6次，脂肪酸甲酯得率稳定在82%以上，且反应条件温和，甲醇添加量低，原料适用性广，使得该工艺更具有经济竞争性。

摘要： 本发明涉及一种高活力磷脂酶D及细胞表面展示磷脂酶D酵母全细胞催化剂的制备，属于用重组DNA技术定点突变野生型磷脂酶D，以改善其活性，并将突变后基因与酵母展示载体pPIC9K-Flo连接，将其在毕赤酵母细胞表面高效展示的方法，涉及具有高活力磷脂酶D及表面展示磷脂酶D酵母全细胞催化剂的制备方法。本发明提高了野生型磷脂酶D的活力，并将其展示在酵母细胞表面，提高其稳定性，具有固定化酶的优点。其技术方案是从微生物特别是色褐链霉菌中分离野生型磷脂酶D基因，对其Glu69、Ser285的氨基酸残基进行突变，经在毕赤酵母细胞表面高效表达，检测高活力磷脂酶D酶活较野生型磷脂酶D提高11％，重组菌株GS115/pPIC9K-Flo-pldm高密度发酵制备的全细胞催化剂酶活为120U/(g·干细胞)。

摘要： 本发明涉及一种细胞表面展示磷脂酶D酵母全细胞催化剂催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，步骤为：将全细胞催化剂加入含有丝氨酸、CaCl2、Triton-X100的醋酸缓冲液中，与含有卵磷脂的氯仿溶液混合均匀，在30°C下混合得到均匀的乳状液反应5-6小时；反应结束后静止自然分层，提取有机相；有机溶剂挥发后剩余物经氯仿洗涤两次，即可得到磷脂酰丝氨酸。本发明利用磷脂酶D的高度专一性，催化卵磷脂和丝氨酸生成磷脂酰丝氨酸，且全细胞催化剂具有固定化酶的优点，可重复使用，有效解决了目前提浸法和化学合成法存在的问题，制备工艺简单，适合工业化生产。

摘要： 本发明公开了一种能够高效催化制备生物柴油的新型纤维生物基材料固定化全细胞催化剂及其制备方法, 所述的全细胞催化剂通过如下步骤制备：产脂肪酶真菌孢子悬浮液的制备；固定化载体的预处理；固定化全细胞生物催化剂的制备；固定化全细胞生物催化剂的交联处理。本方法的固定化全细胞生物催化剂具有制备方法简单、固定效果好和成本低等优点，采用本方法固定化全细胞生物催化剂催化植物油甲酯化催化制备生物柴油，催化剂重复使用6次，脂肪酸甲酯得率稳定在82%以上，且反应条件温和，甲醇添加量低，原料适用性广，使得该工艺更具有经济竞争性。

摘要： 本发明的主题是用于将真核细胞来源的细胞色素P450单加氧酶的底物转化为有价值的生物技术产物的全细胞催化方法。本发明的主题还在于经遗传工程改造从而以高比率实现那些生物转化的微生物以及制备这些微生物菌株的方法。

摘要： 本发明公开了一种羧酸酯酶D-1CarE3细胞表面展示系统及全细胞催化剂其制备方法及应用，该表面展示体系构建方法为：利用来源丁香假单胞菌的人工合成截短冰核蛋白的NC端为锚定蛋白与靶蛋白羧酸酯酶D-1CarE3融合构建了原核表达载体pET28NCD3，并将其转化到大肠杆菌BL21中，构建了羧酸酯酶D-1CarE3的大肠杆菌细胞表面展示工程菌BL21/pET28NCD3。在T7强启动子作用下，经IPTG诱导表达，成功实现了羧酸酯酶D-1CarE3细胞表面活性的展示，并使用超低温冷冻干燥法制备全细胞催化剂D-1CarE3。全细胞催化剂D-1CarE3可应用于环境农残污染的处理。

摘要： 本发明涉及一种高活力磷脂酶D及细胞表面展示磷脂酶D酵母全细胞催化剂的制备，属于用重组DNA技术定点突变野生型磷脂酶D，以改善其活性，并将突变后基因与酵母展示载体pPIC9K-Flo连接，将其在毕赤酵母细胞表面高效展示的方法，涉及具有高活力磷脂酶D及表面展示磷脂酶D酵母全细胞催化剂的制备方法。本发明提高了野生型磷脂酶D的活力，并将其展示在酵母细胞表面，提高其稳定性，具有固定化酶的优点。其技术方案是从微生物特别是色褐链霉菌中分离野生型磷脂酶D基因，对其Glu69、Ser285的氨基酸残基进行突变，经在毕赤酵母细胞表面高效表达，检测高活力磷脂酶D酶活较野生型磷脂酶D提高11％，重组菌株GS115/pPIC9K-Flo-pldm高密度发酵制备的全细胞催化剂酶活为120U/(g·干细胞)。

摘要： 本发明提供一种全细胞催化合成1,5‑戊二胺的方法，所述方法包括：将底物赖氨酸、磷酸吡哆醛、含有赖氨酸脱羧酶的基因工程菌细胞悬液和促进剂混合，得到的混合液进行催化反应，生成所述1,5‑戊二胺；所述促进剂包括有机溶剂和/或表面活性剂。所述方法通过一步催化反应即可得到目标产物，促进剂的引入能够显著改善细胞膜的通透性，增强物质的传递速率，提升赖氨酸脱羧酶的催化效率。所述方法的工艺步骤简单，原料成本低，无需多次离心、冲洗、冷冻等耗时耗能的工序，节约了生产成本，能够快速、高效地获得高收率的1,5‑戊二胺。

摘要： 本发明公开了一种以改性硅藻土为载体的固定化全细胞催化制备β‑烟酰胺单核苷酸的方法。将经过酸、碱处理后的改性硅藻土作为固定化载体，以分别含有多磷酸激酶(Ppk)、核酮糖‑5‑磷酸异构酶(RKI1)、磷酸核糖焦磷酸合成酶(Prps)以及烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)的菌株为对象来制备固定化细胞，再以D‑核糖、ATP、烟酰胺为原料，加入多磷酸激酶、核酮糖‑5‑磷酸异构酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶以及烟酰胺磷酸核糖转移酶四种酶的组合用于催化反应合成β‑烟酰胺单核苷酸(β‑NMN)，转化率高。不仅提高了酶法合成β‑NMN的效率和底物转化率，而且其中的固定化细胞可以多次重复使用。