葡激酶

摘要： 目的 通过对葡激酶(SAK)基因序列进行定点突变、表达、纯化与进行聚乙二醇修饰以获得较高纯度的聚乙二醇化葡激酶(peg-SAK-cys),并对其溶栓活性与免疫原性初步进行验证.方法 根据SAK蛋白晶体结构及抗原位点选择突变位点,设计引物将所选的氨基酸突变为半胱氨酸.将突变质粒通过化学转化进入BL21 (DE3)感受态,并利用经典原核表达技术,在大肠杆菌中表达突变葡激酶(SAK-cys).利用镍离子交换柱、分子筛等方法分离纯化目的蛋白.用纤维蛋白平板溶圈法和血栓弹力图初步对其生物活性进行验证.以酶联免疫吸附(ELISA)法评价peg-SAK-cys的免疫原性.结果 成功获得了SAK-cys质粒,表达、纯化了突变蛋白,并进行聚乙二醇修饰获得了peg-SAK-cys,分离纯化后纯度在总蛋白质量的90％以上.计算其溶圈实验结果,活性为8.2×104 IU·mg-1;血栓弹力图实验结果提示其具有较高的溶栓活性;免疫原性测定结果提示peg-SAK-cys免疫原性低于野生型SAK (P=0.000 2).结论 通过位点特异性特变与聚乙二醇修饰技术的联合运用可以成功改造出有较低免疫原性的活性SAK.%AIM The staphylokinase (SAK) gene sequence was mutated by the site-specific mutation technology,and the PEGylated SAK protein was progressed by expression,PEGylation,and purification consequently.The biological activity and immunogenicity of the PEGylated SAK had been measured.METHODS Primers was designed according to the crystal structure and antigen sites of SAK.The selected amino acid was mutated into cysteine by PCR.The mutant gene sequence was transformed into BL21 (DE3) cell and expressed with classic prokaryotic expression technology.The mutant SAK which had been expressed was purified by NiNTA sepharose.The higher purity PEGylated SAK was obtained by PEGylation and secondary separation.Soluble fibrin plate method and thromboelastogram (TEG) was used to characterize the fibrinolytic activity of PEGylated SAK.Besides,the immunogenicity of SAK was measured by Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).RESULTS The mutant plasmid was constructed successfully.The mutant SAK protein was expressed and purified well,and more than 90％ purity of the PEGylated SAK was obtained by PEGylation and second purification.The fibrin plate assay revealed that the fibrinolytic activity of PEGylated SAK was 8.2 × 104 IU·mg-1,similar results were observed in the thromboelastogram experiment.The enzyme-linked immune-sorbent assay revealed that the immunogenicity of PEGylated SAK was lower than wild-type SAK (P =0.000 2).CONCLUSION The SAK,with low fibrinolytic activity and low imunogenicity,can be successfully produced by site-specific mutation and PEGylation technology.

摘要： 葡激酶是由金黄色葡萄球菌分泌的新一代天然的纤溶酶原激活剂,具有高效的溶栓活性和纤维蛋白特异性.进入机体后引起的免疫反应是限制其临床使用的主要原因,近年来生物工程技术的发展为解决这些问题提供了新的重要途径.现将从结构特点、溶栓机制、免疫原性及分子结构改造等方面重点介绍葡激酶的研究进展.

摘要： 目的:构建葡激酶(Staphylokinase,SAK)基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达SAK蛋白质,纯化并初步鉴定其生物学活性。方法:基于生物信息学方法分析优化基因序列,使用基因合成技术合成SAK基因,转化感受态大肠杆菌B834菌株,使在其中表达,利用离子交换柱,分子筛(Superdex 75)等进行分离纯化,应用纤维蛋白平板溶圈法测定评价其生物活性。结果:SAK在大肠杆菌中以可溶上清的方式高效表达,利用离子交换柱和分子筛等纯化效果良好,纯度达95%,体外实验显示其纤溶活性与尿激酶标准品相当。结论:应用全基因合成经过优化的基因可在大肠杆菌系统中高效上清表达具有较高纤溶活性的SAK。

摘要： [Objective]To reduce immunogenicity of recombined staphylokinase(r-yak),site-directed mutagenesis of Arg77 and Glu80 residue was performed to simultaneously remove T and B cell epitope in r-Sak molecule.[Methods The solvent accessible surface areas of residues 77 and 80 in r-Sak were used to analyze rational design of Sak mutation.The Sak mutants were expressed in E coli DHSa.After purified by a 3-step chromatography,their fibrinolytic activities and immunological properties were analyzed.[Results]Immunogenicity tests suggested that Sak induced a Th2-type immune response.Substitution of Glu80 with alanine or serine successfully reduced its solvent accessible surface area while simultaneously removing part of the T and B cell epitope.Changing Arg77 to glutamine,asparagine,or lysine removed only part of the T cell epitope.Of six dually substituted variants,Sak(R77Q/E80A)and Sak(R77Q/E80S)variants effectively eliminated part of the B and T cell epitopes,which markedly reduced their immunogenicity.%[目的]对葡激酶的T和B细胞抗原表位重叠的关键氨基酸Arg77和Glu80进行定点突变以降低葡激酶的免疫原性.[方法]基于Arg77和Glu80的溶剂可及表面积设计葡激酶的突变体;突变体在大肠杆菌DH5ct中进行表达.经过三步层析法纯化后,分析突变体的纤溶活性和免疫原性.[结果]免疫学实验提示,葡激酶导致Th2免疫反应;Glu80突变为丙氨酸和丝氨酸减少了溶剂可及表面积,同时去除了部分T和B细胞抗原表位;Arg77突变为天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸仅去除了部分T细胞抗原表位;6个组合突变体中,sak(R77Q/E80A)和Sak(R77Q/E80S)有效去除了部分B和T细胞抗原表位,降低了葡激酶的免疫原性;Sak(R770/E80A)and Sak(R77Q/E80S)的纤溶活性和催化效率与r-Sak相当.

摘要： 利用农杆菌介导的方法,将葡激酶(Staphylokinase,SAK)基因导入番茄中.经PCR、Southern杂交和Northern杂交检测,葡激酶基因已整合到再生番茄植株基因组中,共获得8个转基因株系.经ELISA检测,转基因番茄的果实和叶片均能表达SAK蛋白,SAK蛋自在果实和叶片可溶性蛋白中的比例最高分别为3.42%和2.47%.转基因番茄中的SAK蛋白具有一定的溶栓活性,溶栓比活力为3 866 AU·mg-1.

摘要： 为解决葡激酶存在的溶栓后再栓塞问题,利用PCR介导的定点突变技术,在野生型葡激酶(wt-SAK)N-末端的第3、4位氨基酸之间插入Arg-Gly-Asp(RGD)序列构建了葡激酶突变体MD2-SAK,另将N-末端的前3位氨基酸替换为RGD序列构建了葡激酶突变体MD4-SAK.将突变体基因分别连接表达载体pBV220,转化大肠杆菌DH5α,经过热激诱导后,突变体均以可溶性形式得到高效表达,表达蛋白占菌体总蛋白的50%以上.破菌上清液通过SP-Sepharose FF、Sephadex G-50和Q-Sepharose FF三步连续的色谱层析纯化得到纤溶活性分别为10.1×104 AU/mg、11.2×104 AU/mg,纯度均大于96%的突变体蛋白.进一步研究了突变体的性质,结果表明葡激酶突变体不仅保留了野生型葡激酶的纤溶酶原激活活性,并具有较强的抗血小板聚集活性.同时发现,葡激酶突变体的N-末端序列会影响其N-末端甲硫氨酸的酶切加工.

摘要： 的分子间β-折叠组分含量明显减少. 纤溶活性分析结果进一步确认,PVA与葡激酶的相互作用未影响葡激酶的活性,并对蛋白质的活性起保护作用.

摘要： 目的:研究重症急性胰腺炎(SAP)心肌功能损害时心肌NF-κB的活化及葡激酶的干预作用。方法:63只SD大鼠随机分为假手术组(n=9)、对照组(n=27)、葡激酶合用益活清胰汤治疗组(n=27),SAP模型采用5%的牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射方法建立。ELISA法测定6 h、12 h、24 h各时点血TNF-α、IL-6含量,RT-PCR检测心肌NF-κBmRNA的表达,免疫组化法检测心肌NF-κB蛋白的表达,HE染色光镜下观察胰腺及心肌组织的病理变化。结果:术后6h大鼠心肌NF-κBmRNA及NF-κB蛋白表达异常增高,TNF-α、IL-6呈进行性升高,治疗组用药后心肌NF-κBmRNA及蛋白表达下调,与对照组相比(P<0.05),血TNF-α、IL-6明显下降,与对照组相比(P<0.05),治疗组胰腺及心肌组织的病理变化减轻。结论:SAP大鼠的心肌损伤可能与循环中TNF-α、IL-6水平升高导致的心肌NF-κB活化有关,益活清胰汤合用葡激酶对SAP并发的心肌损伤具有防治作用。

摘要： 目的 探讨葡激酶(PK)纳米脂质体的溶栓效果.方法 采用逆相蒸发法制备PK纳米脂质体,并用反相液相色谱(HPLC)法制备归巢装置,观察PK纳米脂质体包封率、分散性、形态、大小,制备血栓动物模型,应用不同剂量的PK纳米脂质体导向装置,观察溶栓效果.结果 PK纳米脂质体平均粒径为(78.6±5.7)nm,多分散性指数为0.298.PK纳米脂质体包封率71.5%,回收率93.2%.分析10、20、30、40 min各个时间段,PK大剂量组与精-甘-天冬-丝氨酸(RGDS)-PK纳米脂质体在血压变化方面与对照组均有显著差异(P＜0.05),各实验组的血栓湿重与对照组比较均有显著差别(P＜0.001).其中PK纳米脂质体、RGDS-PK纳米脂质体与小剂量PK组比较有统计学意义(P＜0.05).结论 制备PK纳米脂质体是可行的,RGDS有导向性,该归巢装置具有较好的溶栓效果.

摘要： 文章中分别利用FXa和凝血酶作为连接肤构建SAK与HV的融合蛋白，从而实现利用水蛙素C一末端对凝血酶的高亲和性来提高SAK对血栓的选择性;利用水蜓素N一末端延伸引起活性降低的特性，将HV置于SAK的下游，降低水蚝素在非血栓部位的活性从而减小因HV的抗凝活性引起的出血倾向;以FXa或凝血酶的识别序列为连接肤，利用血栓部位特有的高活性FXa或凝血酶裂解融合蛋白，使HV的抗凝活性靶向性地在血栓部位释放。最终期望达到的溶栓、抗凝双功能，并降低出血副作用目的。

摘要： 本发明提供了一种制备重组葡激酶‑水蛭素融合蛋白的方法，该方法采用Sepharose Q‑XL阴离子交换层析‑Uni Phenyl‑30L疏水层析‑中空纤维柱脱盐‑UniQ‑30L阴离子交换层析‑中空纤维柱超滤置换。本发明提供的方法能够制备纯度高达99％以上的重组葡激酶‑水蛭素融合蛋白。

摘要： 本发明提供了一种RGD‑重组葡激酶‑人α微球蛋白融合蛋白及其制备与应用。本发明所述RGD‑重组葡激酶‑人α微球蛋白融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.12所示。本发明的融合蛋白通过以下制备方法获得：采用重叠延伸PCR法获得目的基因融合片段；将目的基因融合片段插入表达载体中，构建重组表达质粒；构建的重组表达质粒转化大肠杆菌，在大肠杆菌中进行高效表达；融合蛋白的分离纯化。与现有的同类产品比较，本发明的融合蛋白不仅具有高效的溶栓抗凝活性，而且兼备低的免疫原性。与此同时，本发明的融合蛋白还克服了现有的一些RGD‑重组葡激酶活性下降和不溶性表达的缺点。

摘要： 本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及通过热处理方法提高聚乙二醇（PEG）化葡激酶的生物活性。所述热处理方法包括：（1）PEG化葡激酶通过水浴加热，停止加热后，立即将PEG化葡激酶用冰浴处理；（2）选择的加热温度为50°C‑80°C，优选的加热温度为70°C；（3）选择的加热时间为1小时‑6小时，优选的加热时间为2小时。通过上述热处理的方法，提高PEG化葡激酶的生物活性。

摘要： 本发明公开了一种聚乙二醇化葡激酶突变体，是将野生型葡激酶的71-87位氨基酸序列之中的任一亲水性氨基酸进行定点突变，将其替换为半胱氨酸，在大肠杆菌高效表达，色谱层析纯化出葡激酶突变体，然后使用甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇对葡激酶突变体中的半胱氨酸进行定点修饰，得到的聚乙二醇化葡激酶突变体。所制备的聚乙二醇化葡激酶突变体的免疫原性显著下降，体内血浆半衰期显著延长，药效更持久，溶解血栓的纤溶活性基本得到保留，可以作为血栓栓塞性疾病的溶栓治疗药物使用。

摘要： 本公开提供一种重组葡激酶突变体纯化制备工艺，其包括步骤1工程菌菌体匀浆及匀浆液处理，步骤2重组蛋白的捕获，以及步骤3离子交换层析色谱精制；其中所述步骤2重组蛋白的捕获是将工程菌菌体匀浆处理液上样至镍亲和柱，通过改变咪唑浓度洗脱目的蛋白，同时加入0.3mol/L NaCl来减少由于电荷作用引起的非特异性吸附。所述方法重复性好、得率高，能获得纯度接近100%的葡激酶，适合制药工业大规模生产。

摘要： 本发明公开了一种基于基因工程技术的葡激酶生产设备，其结构包括出料架、操控器、活动装置、指示灯、工作腔、入料口、机体，本发明进行使用时，通过发酵腔与摆动组件稳定套在一起，通过摆动组件有效对发酵腔的活动位置进行定位，导液管将含有工程菌的液体通过注液斗注入到发酵腔内部，通过发酵腔对含有工程菌的液体进行发酵处理，在发酵过程中，通过摆动组件带动发酵腔进行旋转晃动，有效将液体中的物质均匀混合在一起，使得发酵腔内部的液体物质不易沉淀在底部，使得含有工程菌的液体可以均匀发酵，提高生产的葡激酶的品质。

摘要： 本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种聚乙二醇化葡激酶及其制备与应用。本发明的所述聚乙二醇化葡激酶，其结构中包括聚乙二醇和突变葡激酶，所述聚乙二醇和突变葡激酶相偶联。与现有的同类产品比较，本发明所述聚乙二醇化葡激酶不仅有效降低了天然葡激酶的免疫原性，也保留了足够的溶栓活性。

摘要： 本发明提供了一种制备重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的方法，该方法采用Sepharose Q-XL阴离子交换层析-Uni Phenyl-30L疏水层析-中空纤维柱脱盐-UniQ-30L阴离子交换层析-中空纤维柱超滤置换。本发明提供的方法能够制备纯度高达99％以上的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白。

摘要： 本发明公开了属于生物医药领域的葡激酶衍生体在制备降血脂药物中的应用。所述葡激酶衍生体，其氨基酸序列为中国专利文献(CN1850976B)中权利要求1所述的氨基酸序列。本发明中的葡激酶衍生体经静脉注射等方式作用于ApoE-/-小鼠和鹌鹑后可以显著降低血浆总胆固醇(TG)，甘油三酯(TC)，低密度脂蛋白(LDL-c)水平，在同等时间内其降脂效果优于其疗效优于他汀类药物。经静脉注射后2周即可显示出明显的降脂效果，同时还可以明显抑制机体炎症水平，改善氧化应激状态。利用生物工程方法制备SAK-HV蛋白工程菌，经过工艺优化其表达量可达45％，经发酵纯化获得纯化蛋白纯度可达95％以上。

摘要： 本实用新型涉及一种用于重组葡激酶生产的发酵系统搅拌装置，其包括整体呈圆柱形的发酵罐、气源以及搅拌部；发酵罐的顶端开设有加料口、底部固定设置有支架；气源固定设置在发酵罐的顶部；搅拌部包括固定设置在发酵罐底部的电机、中空结构的转轴以及叶片；电机的旋转输出端穿过发酵罐与转轴固定连接；其特征在于：叶片包括叶片前盖、叶片后盖、叶片端盖、叶片内支架以及具备两个顶杆的双向气缸；叶片前盖、叶片后盖以及叶片端盖合围成一端开口的封闭空间并相互固定连接。本实用新型的叶片可以调整角度，进而可以改善用于重组葡激酶生产的发酵系统搅拌装置的搅拌均匀性；使用条件较宽松，不需要专门的配备压缩空气站等设施；便于制作、安装并且可靠性较高。