脱靶效应

摘要： CRISPR系统是基因编辑最新、最有效的系统之一,由于其精准性和高效性,使基因编辑变得方便、快速。然而,除了所需的编辑之外,使用CRISPR系统还会产生脱靶效应。本文针对CRISPR系统脱靶相关的国内外专利文献进行检索、收集、统计及分析,综述了CRISPR系统脱靶相关的专利申请量、申请人分布及国别分布的特点,详细分析了关于CRISPR系统脱靶问题的主要技术路线,为CRISPR系统脱靶问题的研究提供参考意见。

摘要： 嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)是一种过继细胞免疫疗法,其通过基因手段改造T细胞,从而发挥肿瘤靶向杀伤作用。CAR-T细胞疗法在治疗肿瘤,特别是血液系统恶性肿瘤方面具有显著的作用,但在实体肿瘤中作用不佳。单靶点的CAR-T在应用的过程中容易出现脱靶效应,存在复发或更加难治的风险。双靶点或多靶点CAR-T的开发有望扩大靶细胞抗原覆盖率,有效避免抗原逃逸和防止肿瘤复发,延长患者的生存时间。本文综述了目前多靶点嵌合抗原受体T细胞的研究进展,并探讨了其发展的前景。

摘要： 心血管疾病具有患病率和死亡率高的特点,严重威胁人类健康,而动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是导致心血管疾病的主要因素。尽管现有多种针对AS的药物和治疗措施,但均侧重于改善血脂、抑制血栓形成和降低血压等方面,不能直接针对AS病变,且存在药物清除速度过快、脱靶效应、全身反应严重等缺陷。近年来,纳米技术的出现为治疗AS提供了更好的选择。通过合理设计的纳米颗粒(nanoparticles,NPs),纳米给药系统能有效地将药物输送到治疗靶点,从而提高药物的治疗指数,减少药物的全身反应。多功能医用NPs除了靶向治疗,还可被多种成像技术检测,作为定位特定细胞或组织的成像剂。本文对纳米技术在心血管疾病药物和介入治疗的最新进展进行综述,期待为治疗心血管疾病及AS提供新的思路。

摘要： 目的探讨靶向闭合蛋白18亚型2(CLDN18.2)和人类表皮生长因子受体2(HER2)的双受体嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞是否可以降低脱靶效应,并发挥抑制胃癌细胞生长的作用。方法Western blot和流式细胞术检测肿瘤细胞中CLDN18.2和HER2的表达情况;慢病毒感染法构建过表达CLDN18.2和HER2的肿瘤细胞系;慢病毒感染法构建CAR-T细胞;流式细胞术检测CAR-T细胞的阳性率和亚型分布;乳酸脱氢酶(LDH)法检测CAR-T细胞对靶细胞的细胞毒性;裸鼠移植瘤模型检测CAR-T细胞的体内抑瘤效率;免疫组化法检测肿瘤组织中CD3^(+)T细胞的浸润情况。结果成功筛选得到高表达或不表达CLDN18.2和HER2的胃癌细胞系,并构建得到CLDN18.2和HER2单独表达或同时表达的胃癌细胞系;成功构建CAR-T细胞Cz、Hbb和CHbbz;Cz和CHbbz在体外对CLDN18.2^(+)和CLDN18.2^(+)HER2^(+)的肿瘤细胞系均具有特异性的剂量依赖的细胞毒性(P<0.001);在裸鼠移植瘤模型中,只有CHbbz可以对CH-AGS的肿瘤细胞产生体内抑瘤活性及T细胞的肿瘤浸润(P<0.01),同时CHbbz只对CLDN18.2^(+)HER2^(+)的肿瘤细胞产生抑瘤活性及T细胞的肿瘤浸润(P<0.01)。结论靶向CLDN18.2和HER2的双受体CAR-T细胞可以降低脱靶毒性发生的概率,并抑制胃癌的生长,是一种胃癌治疗的潜在方法。

摘要： 随着昆虫分子生物学技术的蓬勃发展,RNA干扰(RNAi)作为21世纪以来的变革性技术,通过特异性抑制靶基因转录后水平的表达,在昆虫基因功能研究方面被广泛应用.由于沉默重要基因的表达会导致某些昆虫的死亡或行为缺陷,故该技术被认为是一种潜在的害虫防治策略,在控制、研究甚至保护昆虫方面具有巨大潜力,目前已被广泛应用于半翅目、直翅目、双翅目等昆虫.RNAi是昆虫学研究和害虫控制潜在应用的流行和重要的反向遗传学策略.从RNAi技术的原理、导入方法、效率影响因素及在农业害虫中的应用研究实例等4方面进行了综述,并对其防控应用和发展前景进行了展望.

摘要： 通过对活性小分子靶标蛋白的鉴定,可以建立活性小分子与细胞表型之间的联系,阐明活性小分子的功能和作用机理,对小分子药物的研发具有重要意义.热蛋白组学分析(thermal proteome profi-ling,TPP)是基于蛋白-配体结合可以增加蛋白热稳定性这一原理发展的鉴定活性小分子靶标蛋白的新技术,相较于其他小分子靶点鉴定方法,其最大的优点是不需要对活性小分子进行化学修饰,极大地拓宽了该方法的应用范围.T H588是7,8-二氢-8-氧鸟嘌呤三磷酸酶(M T H1)的抑制剂,通过抑制M T H1活性,增加肿瘤细胞DNA的氧化损伤,抑制肿瘤细胞的增殖.前期研究表明,T H588可发挥M T H1非依赖的抗肿瘤功能,因此鉴定T H588的脱靶靶标对理解T H588的作用机制并进行相关的分子结构改造至关重要.本研究通过鉴定T H588在细胞中的蛋白靶标,系统地介绍T PP技术的实施和优化;并对鉴定的28个T H588直接靶标和53个间接靶标进行生物信息学分析,为探究T H588抗肿瘤的作用机制提供实验依据.

摘要： 近年嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)发展迅速,在血液系统肿瘤治疗中取得显著疗效.但目前CAR-T疗法在实体肿瘤治疗中仍存在诸多限制,实体肿瘤本身的高度异质性及肿瘤特异性抗原缺乏,是CAR-T研究转向实体瘤治疗的主要障碍,尤其是脱靶效应导致的临床毒性仍是医务研究者目前急需解决的问题.

摘要： [目的]二化螟Chilo suppressalis是中国和其他亚洲地区为害水稻的重要害虫.由于缺乏遗传学操作工具,对二化螟的功能基因组学研究受到严重限制.本研究的目的是借助一个标记基因ebony,在二化螟体内建立CRISPR/Cas9介导的基因编辑体系.[方法]以家蚕Bombyx mori ebony蛋白作为参考序列,通过TBLASTN程序在二化螟基因组数据库获得二化螟ebony基因的cDNA序列;通过PCR技术克隆二化螟ebony全长序列并进行生物信息学分析;运用qRT-PCR技术分析二化螟ebony基因在不同发育阶段(卵、幼虫、预蛹、蛹和雌雄成虫)和4龄幼虫不同组织(头、表皮、脂肪体、肠道和马氏管)中的表达模式;借助基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术,把sgRNA/Cas9蛋白复合物显微注射到二化螟新鲜的卵内(产卵后2h内),靶向敲除二化螟ebony基因.[结果]克隆得到二化螟Csebony基因(GenBank登录号:MZ846208)的全长cDNA序列,开放阅读框长为2586 bp,共编码861个氨基酸.Csebony蛋白质的分子质量为9.5 kD,理论等电点为5.10,且在N端没有信号肽.结构域分析显示,Csebony有3个保守的结构域.系统发育树显示,Csebony与玉米螟Ostrinia furnacalis的ebony亲缘关系最近.qPT-PCR结果显示Csebony基因在蛹期和头部高表达.敲除Csebony导致二化螟幼虫、蛹以及成虫黑色素沉积.[结论]本研究结果表明,Csebony参与了二化螟表皮颜色模式的调控;CRISPR/Cas9基因组编辑技术可在二化螟中有效应用.借助标记基因在非模式生物中快速建立CRISRP/Cas9基因编辑体系,可为二化螟的功能基因组学研究提供有价值的遗传学工具.

摘要： 综合制药工程专业实践教学要求和学科前沿方向,设计了"基于酵母杂交的CRISPR/Cas9基因编辑"实验.该实验先采用基因重组技术,分别构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,以及重组酵母yPH1和yPH6-8,再利用酵母杂交平台研究CRISPR/Cas9基因编辑载体的靶向性和脱靶机率.该实验内容包括微生物培养、微生物生长曲线绘制、基因重组技术、基因表达和CRISPR/Cas9基因编辑技术,以及学习Origin作图软件和荧光成像技术.该实验具有综合性、设计性和研究性特点,同时具有材料成本低、过程简化和结果明显的优势,不仅方便学生学习基因编辑原理,掌握基因编辑核心技术,了解脱靶效应的普通性,而且有利于培养学生的创造性思维,提高分析、解决问题的能力.

摘要： 近年来,以锌指核酸酶(ZFN)和TALEN为代表的人工构建的序列特异性核酸内切酶为反向遗传学技术带来了革命性的飞跃.最近,基于Cas9核酸酶和向导RNA(gRNA)的CRISPR/Cas系统(又称Cas9/gRNA系统)正逐渐成为一种更为简便的基因组定点突变技术.然而,该系统的成功率、工作效率和特异性仍有待深入研究,特别是其脱靶效应仍存在争议.以斑马鱼为模式对上述问题进行了初步探讨。首先检测了斑马鱼中的28个位点，结果显示，常用的人源化的Cas9（humanized Cas9，hCas9）能够成功突变其中的9个位点，成功率为32%；而对90个位点进行TALEN介导的基因打靶实验结果表明，TALEN的成功率可达74%。为了提高Cas9/g RNA系统的成功率和打靶效率，根据斑马鱼的密码子偏好性优化了Cas9的编码序列（称为zCas9），结果成功突变了上述28个位点中的15个，即zCas9的打靶成功率可达54%；对于两者均有活性的位点，zCas9的效率均明显高于hCas9。为了检验Cas9/g RNA系统的特异性，编写了一个可以在任意已知基因组中寻找潜在脱靶位点的开放程序Cas OT（http://eendb.zfgenetics.org/casot/），在斑马鱼中预测了一个效率较高的靶点（~95%）的潜在脱靶位点，并选择了21个脱靶位点进行了深入分析。PCR扩增以及深度测序结果表明，该位点并没有明显的脱靶效应。上述结果表明，基于zCas9的Cas9/g RNA系统在斑马鱼中是一种高效、高特异性的基因打靶工具。

摘要： 提供了一组gRNA，该组gRNA包括第一gRNA分子；以及第二gRNA分子，其能够与第一gRNA分子一起定义基因组序列中的区域，其中基因组中的区域包括需要移除的目标序列。

摘要： 本申请公开了一种检测脱靶效应方法及其应用。所述方法涉及一套可以检测CRISPR‑Cas脱靶效应的建库流程，内容包括转染试剂的更换，ODN序列的优化，Adaptors的改进，Primers的改善和PCR方法的简化，以及所述方法在CRISPR/Cas基因编辑系统中的应用。一种检测CRISPR/Cas系统脱靶效应的方法，可以实现低门槛，高通量，适合更多普通实验室使用，其测序仪器不再限制于Miseq，可以是通量更大的Hiseq或Novaseq平台。CRISPR/Cas基因编辑系统脱靶效应检测方法可以实现各种CRISPR核酸酶(包括高保真等)的特异性检测。

摘要： 一种在全基因组范围内体外检测CRISPR‑Cas脱靶效应的方法，本发明涉及一种在全基因组范围内体外检测CRISPR‑Cas脱靶效应的方法。本发明的目的是为了解决现有脱靶位点检测时存在假阳性位点以及DNA起始加入量大的问题，本发明随机打断基因组DNA，然后连接茎环接头1，使用核酸外切酶消化单侧连接接头1和未连接接头的线性DNA，剩余的DNA片段用ddNTP封闭。用Cas酶切割DNA，暴露新的DNA断端并连接线性接头2，用链霉亲和素磁珠捕获连接接头2的DNA，用巢式PCR构建NGS文库进行illumina双端测序及生物信息学分析。本发明方法真阳性脱靶位点检出率高。本发明应用于生物技术领域。

摘要： 本发明属于生物信息学领域，公开了一种基于深度学习的CRISPR脱靶效应预测方法，通过使用BERT模型对人类基因组进行信息的抽取，有效地利用基因组的先验信息，并对数据进行有效地加强，最后将获取到的特征输入到LightGBM方法中进行训练预测，本发明解决了数据量少和数据不平衡的问题，并实现了对CRISPR脱靶效应的有效预测，具有十分重要的推广应用价值。

摘要： 本发明涉及基因编辑技术领域，具体涉及一种降低脱靶效应的RNA基因编辑系统的制备方法。本发明提供的一种融合蛋白，自N端至C端依次包括Cas13b蛋白的氨基酸序列、ADAR2蛋白的氨基酸序列和具有二氢叶酸还原酶活性的氨基酸序列；上述融合蛋白应用到RNA基因编辑系统如RESCUE系统中，通过在碳端融合具有二氢叶酸还原酶活性的氨基酸序列，具有二氢叶酸还原酶活性的氨基酸序列可以结合TMP调控dRanCas13b表达Cas13b蛋白与hADAR2表达ADAR2蛋白，在不影响编辑效率的前提下，显著减少RNA编辑过程中脱靶SNP数量，进而提高RNA单碱基编辑系统应用安全性。

摘要： 本发明涉及RNA干扰诱导核酸及其用途，更具体地说，涉及RNA干扰诱导核酸，在RNA干扰诱导核酸的双链的至少一个单链中，被变成为将5'末端和3'末端区域取代为没有碱基(base)的形式。本发明的RNA干扰诱导核酸，可提供新型变形形状的核酸及使用其的目标基因的选择性表达抑制方法，用来防止用RNA干扰现象来抑制目标基因的表达时发生的脱靶效应。此外，根据本发明的RNA干扰诱导核酸，提供一种新型变形形状的RNA干扰诱导核酸，在抑制目标基因的表达的同时可以防止脱靶效应，具有目标选择性及特异性，从而来解决现有RNA干扰诱导核酸的问题，即可以放心作为抑制基因表达的方法来进行研究和基因治疗，缓解因脱靶效应引起的不准确性及副作用。

摘要： 本发明属于基因编辑领域。具体而言，本发明涉及快速高通量检测单碱基编辑系统的全基因组范围内随机脱靶效应的方法和工具。

摘要： 本申请公开了一种检测脱靶效应方法及其应用。所述方法涉及一套可以检测CRISPR‑Cas脱靶效应的建库流程，内容包括转染试剂的更换，ODN序列的优化，Adaptors的改进，Primers的改善和PCR方法的简化，以及所述方法在CRISPR/Cas基因编辑系统中的应用。一种检测CRISPR/Cas系统脱靶效应的方法，可以实现低门槛，高通量，适合更多普通实验室使用，其测序仪器不再限制于Miseq，可以是通量更大的Hiseq或Novaseq平台。CRISPR/Cas基因编辑系统脱靶效应检测方法可以实现各种CRISPR核酸酶(包括高保真等)的特异性检测。

摘要： 本发明提出了一种筛选siRNA序列以降低脱靶效应的方法及系统，包括：步骤S1：整合siRNA候选序列数据，对siRNA序列目标区域基因组区间进行有无常见SNP的标注；步骤S2：对siRNA正负链序列特征进行分析，对siRNA正负链序列进行是否能正确识别正负链的标注；步骤S3：对siRNA序列的负链特征进行分析，对siRNA序列的负链进行是否能够引发自身免疫反应的标注；步骤S4：对siRNA正负链序列特异性进行分析，对siRNA正负链序列进行siRNA序列特异性标注；步骤S5：综合上述所有标注结果，对候选siRNA序列进行筛选。所述系统包括与所述方法的步骤对应的单元模块。

摘要： 本发明涉及基因编辑技术领域，具体涉及一种降低脱靶效应的RNA基因编辑系统的制备方法。本发明提供的一种融合蛋白，自N端至C端依次包括Cas13b蛋白的氨基酸序列、ADAR2蛋白的氨基酸序列和具有二氢叶酸还原酶活性的氨基酸序列；上述融合蛋白应用到RNA基因编辑系统如RESCUE系统中，通过在碳端融合具有二氢叶酸还原酶活性的氨基酸序列，具有二氢叶酸还原酶活性的氨基酸序列可以结合TMP调控dRanCas13b表达Cas13b蛋白与hADAR2表达ADAR2蛋白，在不影响编辑效率的前提下，显著减少RNA编辑过程中脱靶SNP数量，进而提高RNA单碱基编辑系统应用安全性。