一种希腊魏斯氏菌、筛选方法及其应用

摘要

本发明提供一种希腊魏斯氏菌、筛选方法及其应用，希腊魏斯氏菌为希腊魏斯氏菌(Weissella hellenicai L‑1)菌株，从腌制泡菜中筛选得到，本发明希腊魏斯氏菌(Weissella hellenicai L‑1)菌株用于紫薯发酵产品和海带发酵产品等蔬菜发酵产品的制备。本发明提供的希腊魏斯氏菌L‑1可以高产乳酸，而且最高可耐受50g/L NaCl、pH＝2的酸性环境，本菌株可以有效利用食物固有成分，提升发酵产品中总酸含量，使产品有浓郁的酸香韵且色泽巨佳，满足消费者对发酵食品的需求。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种希腊魏斯氏菌、筛选方法及其应用。

背景技术

西南地区素有食用发酵食品的传统，蕴含着丰富的益生菌资源，但西南地区目前益生菌资源家底不清，挖掘与基础特性研究不足，已经成为制约西南地区发酵食品产业发展瓶颈。发酵食品的风味是影响产品感官品质和消费者接受度的重要因素，西南地区传统泡菜的愉悦风味来自于异型乳酸菌发酵和同型乳酸菌发酵，在发酵初期，异型乳酸菌迅速产生大量的乙酸、乙醇、甘露醇等风味物质，随着发酵进行，同型乳酸菌会取代异型乳酸菌大量产酸，使得最终产品具有十分酸爽的感觉，两者协同发酵形成了其独特的风味。将西南地区传统泡菜中的发酵菌进行研究，用于发酵食品中快速发酵，对发酵食品中的风味特征、耐受性等深入研究获得高品质产品具有广阔的应用前景。

紫薯(Ipomoea batatas L.)是一种可食用的根，属于旋花科。深颜色的紫薯是由于存在以花青素或芍药苷为苷元的高度酰化的花青素，这是一种对健康十分有益的天然色素。据报道，紫薯中大量的花青素和酚类物质具有抗氧化、抗癌、抗炎症和抗高血糖等生理活性。此外，紫薯还含有18％的紫薯淀粉、5％左右的糖、2％左右蛋白质以及膳食纤维、维生素(C、B1、B2、E)、矿物质(钾、钙、镁、锌)等营养成分，碘和硒更是普通红薯的20倍以上。所以紫薯有着延年益寿食品的美称，是一种绿色健康的食品原料。但现有技术中，紫薯在加工过程中存在易变色、易变味、口感不佳等问题。

海带含有丰富的化学成分和生物活性物质，已被用于食品、饲料和药物前体等许多工业领域。研究表明，海带中含有十分丰富的褐藻多糖，褐藻多糖又分为褐藻胶、褐藻淀粉与褐藻糖胶3种物质，其中褐藻胶占比为15％～25％，在功能性食品与部分药品的再加工过程中的应用价值非常高。此外海带还含有丰富的褐藻酸、维生素、矿物质和多种微量元素，并因含有游离的谷氨酸而带有十分丰富的鲜味。目前我国海带的培育技术已十分成熟，但海带加工利用却仍处于初级阶段，产品主要是盐渍海带、淡干海带和即食调味海带，创新性发展海带深加工产业、研发健康营养的海带加工制品，符合我国2030 健康中国战略需求，同时可增加海带附加值，促进海带产业链可持续发展。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种希腊魏斯氏菌、筛选方法及其应用，得到的希腊魏斯氏菌产酸快、高产乳酸，筛选得到的希腊魏斯氏菌在发酵食品中应用使得发酵食品具有酸度柔和、风味饱满、色泽好等特点。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案实现的：

本发明第一个目的在于提供一种希腊魏斯氏菌，其特征在于，所述希腊魏斯氏菌为希腊魏斯氏菌(Weissella hellenicai L-1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏号为CCTCC M 2022425，保藏时间为2022年4月19日。

进一步的，所述希腊魏斯氏菌(Weissella hellenicai L-1)的16S rDNA序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明第二个目的在于提供一种希腊魏斯氏菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、称取西南地区酸菜样品置入含无菌去离子水的试管中，充分振荡后形成母悬浮液；将所述母悬浮液制备成10

S2、将S1得到的分离菌株接种至MRS液体培养基中，35℃，80rpm培养18h，得到种子液；

S3、将S2得到的种子液按照1％的接种量接种于MRS液体培养基中，35℃，80rpm 培养24h，得到所述希腊魏斯氏菌(Weissella hellenicai L-1)菌株。

进一步的，所述希腊魏斯氏菌(Weissella hellenicai L-1)菌株可耐受50g/LNaCl、pH＝2 的酸性环境，从而可以有效定殖于腌制的蔬菜中启动蔬菜发酵，实现快速产酸，提高产酸速率，实现快速启动蔬菜发酵，得到蔬菜发酵产品。

本发明第三个目的在于提供一种希腊魏斯氏菌(Weissella hellenicai L-1)菌株在蔬菜发酵产品中的应用。

进一步的，所述蔬菜发酵产品包括紫薯发酵产品和海带发酵产品。

进一步的，所述紫薯发酵产品为紫薯发酵酱。

进一步的，所述海带发酵产品为海带蔬菜汁。

本发明第四个目的在于提供一种以所述希腊魏斯氏菌(Weissella hellenicaiL-1)菌株为发酵剂的紫薯发酵产品，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：

将所述希腊魏斯氏菌L-1菌株进行活化，得到活化菌种；将生鲜紫薯洗净后与水按1:1蒸煮后定容打浆，装入灭菌的三角瓶中，按体积质量比5％的接种量接种所述希腊魏斯氏菌L-1菌株活化菌种，20～25℃静置发酵7天后，得到所述紫薯发酵产品。

优选的，紫薯发酵温度为21℃。

进一步的，所述活化的过程为：将希腊魏斯氏菌L-1菌株接种于MRS固体培养基上35℃活化培养24h，用牙签取菌体接种于含有100mL的MRS液体培养基的250mL三角瓶中，35℃恒温下，80r/min摇床培养18h，直至菌液浓度达到10

本发明第五个目的在于提供一种以所述希腊魏斯氏菌(Weissella hellenicaiL-1)菌株为发酵剂的海带发酵产品，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：

将所述希腊魏斯氏菌L-1菌株进行活化，得到活化菌种；将挑选后的海带与蔬菜洗净，将海带与水以1:3比例打浆，蔬菜与水以1:2比例打浆；将打浆后的海带液与蔬菜液装入灭菌的三角瓶中，按体积质量比2％的接种量接种所述希腊魏斯氏菌L-1菌株活化菌种，20～25℃静置发酵6天后，得到所述海带发酵产品。

优选的，海带发酵温度为21℃。

进一步的，接种前混合的打浆后的所述海带液与蔬菜液体积比为1:3。

进一步的，所述蔬菜为卷心菜。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：

本发明提供的希腊魏斯氏菌(Weissella hellenicai L-1)菌株产生乳酸能力显著，可以赋予产品独特的柔和的酸香韵。菌株可耐受50g/L NaCl、pH＝2的酸性环境，产酸速率快，能够快速启动蔬菜发酵。通过发酵制备的紫薯发酵酱营养全面、口感浓厚、附加值高，不会改变紫薯原有的色系，释放出的小分子物质更利于人体消化吸收。充分利用海带与卷心菜中的固有成分，生成有机酸，使得产品具有乳酸菌发酵所特有的酸香韵，使得风味饱满柔和。本发明蔬菜发酵产品的制备过程简单，有利于大规模工业化的实现，不添加任何香精、色素、防腐剂，是乳酸菌发酵蔬菜安全食品。

本发明中选用的酸菜为西南地区普通农户家的酸菜、西南地区市售酸菜等。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。

附图说明

图1为本发明中希腊魏斯氏菌(Weissella hellenicai L-1)菌株在MRS固态培养基上的菌落形态。

图2为本发明中希腊魏斯氏菌(Weissella hellenicai L-1)菌株的显微镜图像。

图3为本发明中希腊魏斯氏菌(Weissella hellenicai L-1)菌株的盐浓度耐受图。

图4为本发明中希腊魏斯氏菌(Weissella hellenicai L-1)菌株的酸性pH耐受图。

图5为本发明中希腊魏斯氏菌(Weissella hellenicai L-1)菌株的产酸速率图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明技术方案作进一步详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

另外，除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备均可通过市场购买获得或现有方法制备得到。本发明各实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

本发明实施例中使用的改良MRS固体培养基组成为蛋白胨10g，酵母提取物5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，乙酸钠5g，吐温80 1mL，七水硫酸镁0.58g，四水硫酸锰0.25g，琼脂20g，碳酸钙10g，溴甲酚紫0.1g，去离子水1000mL，pH6.2～6.4。

实施例1：希腊魏斯氏菌L-1菌株的分离、筛选与鉴定

1.1希腊魏斯氏菌L-1菌株的分离

希腊魏斯氏菌L-1菌株的分离包括取样、富集和初筛，复筛三个步骤，具体如下：

1、取样

使用冰盒从西南地区农家采集腌制酸菜样品，装入干净的采样袋中，做好标记，运回实验室于4℃冰箱中保存，作为样品。

2、富集和初筛

在无菌超净工作台中，称取1.0g农家自制酸菜样品，置入含9mL无菌去离子水试管中，通过涡旋充分振荡，制备成母悬浮液。然后利用去离子水，将母悬浮液制备成10

3、复筛

将初筛得到的分离菌株接种至MRS液体培养基中，35℃，80rpm培养18h，制备得到种子液，按照1％的接种量接种于含有100mL的MRS液体培养基的250mL体积的三角瓶中，35℃，80rpm培养24h，得到菌株，菌株依次命名为菌株L-1、菌株M-1、菌株 M-2、菌株M-6、菌株L-3、菌株L-7，对所有腌制酸菜样品中分离得到的菌株测定发酵液中乳酸含量，实验结果如表1所示，可以看出，本发明L-1菌株产乳酸的能力较其他样品高。

表1乳酸产量对比

1.2菌株鉴定

对上述分离纯化得到的菌株L-1纯培养物进行一系列生理生化鉴定，并进行DNA提取，16S rDNA的扩增和测序，利用引物F27和R1492进行扩增16S rDNA，

引物序列如下：

F27:5'-AGAGTTGATCATGGCAG-3'，如SEQ ID NO.1所示；

R1492:5'-TAGGGTTACCTTGTTACGCTT-3'，如SEQ ID NO.2所示

PCR扩增条件为95℃5min，94℃30s、55℃30s、72℃90s、30个循环，72℃ 10min，4℃保存。

对PCR扩增产物进行测序，测序结果如SEQ ID NO.3所示。

将菌株L-1经同源性比对，结合L-1菌株形态学及生理生化特性，命名为希腊魏斯氏菌(Weissella hellenicai L-1)。对本实施例分离筛选得到的希腊魏斯氏菌L-1菌株在MRS 固态培养基上培养并观察菌落形态，并对菌株进行显微镜图像观察，观察结果如附图1、附图2所示。参见附图1，可以看出本发明希腊魏斯氏菌L-1菌株在MRS固态培养基上形成白色圆形、边缘规则、表面光滑不透明菌落。

参见附图2，对希腊魏斯氏菌L-1菌株用显微镜观察，显微镜镜检显示为不规则短棒状，成对或短链排列细菌。

同时对希腊魏斯氏菌L-1菌株进行生理生化特征测试，如表2所示：

表2希腊魏斯氏菌L-1菌株的生理生化特征

注：“+”表示阳性反应，存在或有，“-”表示阴性反应，不存在或没有。

上述方法得到的希腊魏斯氏菌为希腊魏斯氏菌(Weissella hellenicai L-1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏号为CCTCC M2022425，保藏时间为2022年4月19日。

可以看出，本实施例从西南地区典型农家泡菜中筛选希腊魏斯氏菌(Weissellahellenicai L-1)菌株的筛选方法，采用梯度浓度稀释法，将稀释后的样品液涂布于改良的固体MRS平板，35℃厌氧培养48h，挑选菌落不一样且有溶钙圈的菌株，进一步划线分离纯化，得到分离菌株，而后再结合乳酸的产生能力实验确定L-1菌株，并通过序列对比进行菌株种属的确定。该L-1菌株产生乳酸的能力很强，乳酸的浓度可达10.46mg/L。

实施例2：希腊魏斯氏菌(Weissella hellenicai L-1)菌株耐盐、耐酸、产酸能力检测希腊魏斯氏菌株L-1的耐盐能力：

将希腊魏斯氏菌株L-1在MRS液体培养基中活化12h后，菌液的OD600值达到0.8。分别按1％的接种量接种于含有不同NaCl质量浓度(0、10、20、30、40、50、60g/L) 的100mL的MRS液体培养基的250mL体积的三角瓶中，以不接菌的种子培养基作为空白对照，每组设3个重复，35℃，80r/min摇床培养48h后，用分光光度计在600nm 处测定培养液的吸光值。

结果如图3所示，希腊魏斯氏菌株L-1具有较广泛的耐盐能力，最高可耐受50g/LNaCl，该结果显示腊魏斯氏菌株L-1具有较高的耐盐能力。

希腊魏斯氏菌株L-1的耐酸能力：

将希腊魏斯氏菌株L-1在MRS液体培养基中活化12h后，菌液的OD600值达到0.8。分别按1％的接种量接种至不同pH浓度(1、2、3、4、5、6、7)的含有100mL的种子培养基的250mL体积的三角瓶中，以不接菌的种子培养基作为空白对照，每组设置3个重复，35℃，80r/min培养48h后，测定培养液在600nm处OD值。

结果如图4所示，菌株L-1酸性pH的耐受范围为2～7，最高可耐受2的酸性pH，说明菌株L-1对较宽范围的酸性条件有良好的适应性。

希腊魏斯氏菌株L-1的产酸能力：

用无菌接种环挑取一环希腊魏斯氏菌株L-1菌落，接种于MRS液体培养基中活化12h，菌液的OD600值达到0.8。分别按1％的接种量接种于含有100mL的MRS液体培养基的250mL体积的三角瓶中，以不接菌的MRS液体培养基作为空白对照，每组设三个重复，35℃，80r/min摇床培养24h，每隔3h取样品，用pH计检测培养液pH值，并计算菌株的产酸速率，产酸速率＝培养基起始pH-各时间点pH。

结果如图5所示，随着发酵时间的增加，希腊魏斯氏菌株L-1的产酸能力不断增强，当培养9h时，发酵液pH已达到4.40，产酸速率达到1.99，据文献报道大多数乳酸菌在培养9h后的产酸速率在0.43～1.29，本实验筛选到的希腊魏斯氏菌L-1在1.99，明显高于这个数值，具有较大的优势，说明菌株L-1的产酸速度非常快，这一特性将对后续发酵起到重要的作用。

实施例3希腊魏斯氏菌(Weissella hellenicai L-1)菌株作为发酵剂进行紫薯酱的制备

S1，将希腊魏斯氏菌L-1菌株接种于MRS固体培养基上35℃活化培养24h，用牙签取菌体接种于含有100mL的MRS液体培养基的250mL三角瓶中，35℃恒温下，80 r/min摇床培养18h，直至菌液浓度达到10

S2，将生鲜紫薯洗净后与水1:1蒸煮后定容打浆，装入灭完菌的三角瓶中，以体积质量比为5％的接种量接种希腊魏斯氏菌L-1菌株活化菌种，20～25℃(优选21℃)静置发酵7天，得到紫薯发酵酱。

样品测试1：参照宁正祥主编的《食品分析手册》采用NaoH滴定法测定紫薯发酵酱中的总酸含量，参见表3，结果表明，本发明的希腊魏斯氏菌(Weissella hellenicai L-1)菌株发酵的紫薯酱总酸含量为0.66％。

表3希腊魏斯氏菌L-1菌株发酵紫薯酱中总酸分析

样品测试2：称取1g的发酵样品，溶于9mL的80％乙醇中。用移液枪吸取上述待测样品0.5mL置于10mL具塞比色管中，加入0.5mL去离子水，摇匀后加入0.5mL福林试剂，混匀，1min后加入1.5mL的20％Na

表4希腊魏斯氏菌L-1发酵紫薯酱中总酚分析

样品测试3：使用罗维朋比色计对紫薯发酵后的颜色进行测定，比色皿长度选用10mm。结果表明，本发明的希腊魏斯氏菌L-1菌株发酵的紫薯酱颜色呈红黄色系，不会改变紫薯的色系，与对照组的颜色基本接近。

表5希腊魏斯氏菌L-1发酵紫薯酱颜色检测值

综上所述，利用本实施例的方法制备的紫薯发酵酱，酸度适宜，营养全面。希腊魏斯氏菌L-1菌株可以充分利用紫薯原料固有的成分，生成有机酸，使得产品具有乳酸菌发酵所特有的酸香韵，使得风味饱满柔和，而且希腊魏斯氏菌L-1菌株发酵紫薯酱后不会改变紫薯原有的色系，说明此加工方式不会破坏紫薯花青素等营养成分。而且，紫薯发酵酱中的总酚含量升高，说明希腊魏斯氏菌L-1可以产生特定的酶系断开紫薯中酚酸与酚环上的羧基或者分子结构上的羧基酯化的不可溶物质，释放出酚酸。通过发酵制备的紫薯发酵酱营养全面、口感浓厚、附加值高，释放出的小分子物质更利于人体消化吸收。

实施例4希腊魏斯氏菌(Weissella hellenicai L-1)菌株作为发酵剂进行海带蔬菜汁的制备

S1、将希腊魏斯氏菌L-1菌株接种于MRS固体培养基上35℃活化培养24h，用牙签取菌体接种于含有100mL的MRS液体培养基的250mL三角瓶中，35℃恒温下，80 r/min摇床培养18h，直至菌液浓度达到10

S2、将海带与卷心菜去掉有病斑、腐烂点的样品，用自来水洗净后，将海带与水以1∶3比例打浆，卷心菜与水以1∶2比例打浆，备用。

S3、将步骤S2中得到的打浆后的海带液与卷心菜液以1:3比例装入灭完菌的三角瓶中，以体积质量比为2％的接种量接种希腊魏斯氏菌L-1菌株活化菌种，20～25℃(优选21℃)静置发酵6天，得到海带蔬菜汁发酵产品。

样品测试1：参照GB 4789.2—2016进行菌落总数测定，用pH计测定pH值。参见表6，结果表明，本发明的希腊魏斯氏菌L-1发酵6天后的海带蔬菜汁中的菌落总数增加到7.38(lg(CFU/mL))，说明希腊魏斯氏菌L-1能够很好的代谢海带卷心菜中的有机质，表现了较强的生长能力；本发明的希腊魏斯氏菌L-1发酵6天后的海带蔬菜汁中的pH值从6.78降至3.67，说明希腊魏斯氏菌L-1可以利用海带卷心菜液中的营养物质生长，同时产生酸性代谢物质，促使环境pH值随着发酵的进行不断降低。

表6希腊魏斯氏菌L-1发酵海带蔬菜汁中菌落总数与pH值分析

样品测试2：将希腊魏斯氏菌L-1发酵6天后的海带蔬菜汁样品在8000r/min，离心15min，吸取上清液，采用苯酚-硫酸法测定总糖含量，采用DNS法测定还原糖含量。参见表7，结果表明，本发明的希腊魏斯氏菌L-1发酵6天后的海带蔬菜汁中的总糖由40.49mg/mL降低到33.79mg/mL，还原糖含量由16.69mg/mL降低到14.46mg/mL，说明希腊魏斯氏菌L-1能够很好的定殖于海带蔬菜汁中，并发酵利用海带与卷心菜中现成的碳来源。

表7希腊魏斯氏菌L-1发酵海带蔬菜汁中总糖与还原糖分析

综上所述，利用本实施例的方法制备的海带蔬菜汁，酸甜适宜。希腊魏斯氏菌L-1菌株可以充分利用海带与卷心菜中的固有成分，生成有机酸，使得产品具有乳酸菌发酵所特有的酸香韵，使得风味饱满柔和。

上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。

上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。