一种食窦魏斯氏菌及其应用、筛选检定方法

摘要

本发明公开一种食窦魏斯氏菌及其应用、筛选检定方法，所述食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15075；所述食窦魏斯氏菌生长速率快，产酸效率高；所述食窦魏斯氏菌作为牧草青贮添加剂，提升牧草青贮饲料的品质，具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种食窦魏斯氏菌及其应用、筛选检定方法。

背景技术

青贮是通过乳酸菌的增殖，将原料中的发酵底物转化成乳酸等酸性物质，维持酸性厌氧环境，以利于青贮作物长期保存的一种贮藏方式。青贮饲料颜色黄绿、气味酸香、柔软多汁、适口性好，在畜牧业生产中广泛应用，尤其在反刍动物饲养中，已成为重要的优质粗饲料来源。

乳酸菌是近年来正在推广的青贮微生物添加剂，其主要作用是调节青贮物料内微生物组成，迅速成为优势菌群，竞争抑制有害微生物生长转化有限的糖分，降低青贮pH值，从而提高青贮饲料的质量，不同的青贮物料其发酵特性存在不同，而目前适用于青贮的乳酸菌品种单一，不能满足市场需求。

发明内容

有鉴于此，本申请提供了一种食窦魏斯氏菌，所述食窦魏斯氏菌生长速率快，产酸效率高；食窦魏斯氏菌作为牧草青贮添加剂，发酵类型为同型发酵，能快速降低牧草青贮pH值，使乳酸菌成为优势菌群，加快发酵成熟，减少氨态氮的产生以及增加了有机酸含量，提高了青贮饲料的发酵品质，从而提高牧草青贮饲料干物质含量，干物质回收率、粗蛋白含量，降低了纤维含量，提升牧草青贮饲料的质量，具有广泛的应用前景。

为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是一种食窦魏斯氏菌，所述食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.15075，保藏日期为2017年12月18日；

上述食窦魏斯氏菌的16s rDNA如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了上述述食窦魏斯氏菌在制备牧草青贮添加剂中的应用。

优选的，所述食窦魏斯氏菌在制备狼尾草属牧草青贮和牛鞭草属牧草添加剂中的应用。

优选的，所述狼尾草属牧草为狼尾草属牧草为桂牧1号杂交狼尾草、桂闽引象草。

优选的，所述牛鞭草属牧草为牛鞭草。

本发明还提供了上述食窦魏斯氏菌的筛选检定方法，包括以下步骤：

1)取牧草样品，稀释后吸取涂布至MRS固体培养基培养，挑出单菌落养继续培养后，连续传代培养不少于2次，得到纯化的菌落；

2)将步骤1)得到的所述纯化的菌落在乳酸菌固体培养基上恒温厌氧条件下培养后，通过革兰氏染色和过氧化氢酶接触反应，进行乳酸菌的鉴定，将鉴定后的乳酸菌加入含灭菌甘油的液体营养培养基中，并储存，得到分离纯化的乳酸菌；

3)将步骤2)得到的所述分离纯化的乳酸菌进行菌种活化后，接种到MRS液体培养基中培养，得到菌液；测定所述菌液pH与OD值，根据测定结果进行筛选pH＝3.76，OD值＝1.641的菌液，得到初步筛选后的菌株；

4)将步骤3)得到的所述初步筛选后的菌株进行厌氧培养后，进行单株菌的DNA提取，以提取的DNA为模板进行PCR扩增得到扩增产物，所述扩增产物即为所述食窦魏斯氏菌。

优选的，所述步骤具体包括：

1)取牧草样品，加入无菌蒸馏水，稀释成10^-1，10^-3和10^-5三个稀释度的样品稀释液；吸取样品稀释液涂布至MRS固体培养基培养，连续传代培养2次，得到纯化的菌落；

2)将步骤1)得到的所述纯化的菌落在乳酸菌固体培养基上37℃恒温厌氧条件下培养24h后，通过革兰氏染色和过氧化氢酶接触反应，进行乳酸菌的鉴定，将鉴定后的乳酸菌加入含灭菌甘油的液体营养培养基中，并以-80℃储存，得到分离纯化的乳酸菌；

3)将步骤2)得到的所述分离纯化的乳酸菌进行菌种活化后，以3％的接种量接种到10ml MRS液体培养基中，以温度40～45℃，湿度85％～98％培养12h，得到菌液；测定所述菌液pH与OD值，根据测定结果进行筛选pH＝3.76，OD值＝1.641的菌液，得到初步筛选后的菌株；

4)将步骤3)得到的所述初步筛选后的菌株进行在温度37℃条件下厌氧培养48h后，进行单株菌的DNA提取，以提取的DNA为模板进行PCR扩增得到扩增产物，所述扩增产物即为所述食窦魏斯氏菌。

优选的，所述以提取的DNA为模板进行PCR扩增得到扩增产物过程具体为：以上游引物：5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，下游引物：5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，为特异性引物对提取的DNA为模板进行PCR扩增得到扩增产物，所述PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min后，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，循环30次，再72℃延长5min。

优选的，所述筛选检定方法还包括：将步骤4)得到的所述食窦魏斯氏菌通过生理生化测定、耐盐试验、不同温度试验、耐酸试验和糖发酵试验评价试验进行分析。

优选的，所述筛选检定方法还包括：将步骤4)得到的所述食窦魏斯氏菌进行16S rDNA序列分析。

优选的，所述牧草样品为狼尾草属牧草样品。

优选的，所述狼尾草属牧草样品为桂牧1号杂交狼尾草鲜草、桂闽引象草鲜草、桂牧1号杂交狼尾草青贮样或桂闽引象草青贮样。

本申请与现有技术相比，其详细说明如下：

本发明提供了一种食窦魏斯氏菌，生长速率快，产酸效率高。

本发明提供的食窦魏斯氏菌应用于牧草青贮用时，能快速转化有限的糖分，显著地降低青贮pH值，有效提高青贮饲料的质量，具有较大潜力和广阔的发展前景。进一步的，在牧草中，狼尾草属牧草的可溶性碳水化合物含量相对较低，水分含量较高，缓冲度较大，其茎秆中空存有大量空气，所以狼尾草青贮的发酵慢，最终导致青贮失败。牛鞭草属牧草自身附着的乳酸菌数量较少，我国目前对牛鞭草属牧草研究报道较少。本发明提供的食窦魏斯氏菌作为牧草青贮添加剂，发酵类型为异型发酵，能快速降低牧草青贮pH值，使乳酸菌成为优势菌群，加快发酵成熟，减少氨态氮含量的产生以及增加有机酸含量，提高青贮饲料的发酵品质，从而提高牧草青贮饲料干物质含量，干物质回收率、粗蛋白含量，提升牧草青贮饲料的质量；降低了纤维含量，提高了适口性，进而提升牧草青贮饲料的质量，具有广泛的应用前景。

本发明提供了食窦魏斯氏菌的筛选检定方法中牧草样品经分离纯化得到分离纯化的乳酸菌，离纯化的乳酸菌菌种活化培养，得到菌液；按照菌液pH＝3.76，OD值＝1.641的筛选标准进行筛选，得到初步筛选后的菌株，初步筛选后的菌株进行厌氧培养后，进行单株菌的DNA提取，以提取的DNA为模板进行PCR扩增得到扩增产物，方法简单便捷，具有广泛的应用前景。

本发明提供了食窦魏斯氏菌的筛选检定方法通过对所得到的微生物的鉴定，来确定得到了所预筛选的微生物为本发明提供的食窦魏斯氏菌，并可重复实施，具有广泛的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供食窦魏斯氏菌的光学显微镜图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

一种食窦魏斯氏菌，所述食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.15075，保藏日期为2017年12月18日；

上述食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)的16s rDNA核苷酸如SEQ ID NO.1所示。

上述食窦魏斯氏菌的筛选检定方法，包括以下步骤：

1)取牧草样品，加入无菌蒸馏水，稀释成10^-1，10^-3和10^-5三个稀释度的样品稀释液；吸取样品稀释液涂布至MRS固体培养基培养，连续传代培养2次，得到纯化的菌落。

2)将步骤1)得到的所述纯化的菌落在乳酸菌固体培养基上37℃恒温厌氧条件下培养24h后，通过革兰氏染色和过氧化氢酶接触反应，进行乳酸菌的鉴定，将鉴定后的乳酸菌加入含灭菌甘油的液体营养培养基中，并以-80℃储存，得到分离纯化的乳酸菌。

3)将步骤2)得到的所述分离纯化的乳酸菌进行菌种活化后，以3％的接种量接种到10ml MRS液体培养基中，以温度40～45℃，湿度85％～98％培养12h，得到菌液；测定所述菌液pH与OD值，测定结果见表1，根据测定结果进行筛选pH＝3.76，OD值＝1.641的菌液，得到初步筛选后的菌株。

4)将步骤3)得到的所述初步筛选后的菌株进行在温度37℃条件下厌氧培养48h后，进行单株菌的DNA提取，以上游引物：27F(5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)，下游引物：1492R(5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，)，为特异性引物对提取的DNA为模板进行PCR扩增得到扩增产物，所述扩增产物即为上述食窦魏斯氏菌；所述PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min后，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，循环30次，再72℃延长5min；

其中，所述牧草样品为狼尾草属牧草样品；所述狼尾草属牧草样品为桂牧1号杂交狼尾草鲜草、桂闽引象草鲜草、桂牧1号杂交狼尾草青贮样或桂闽引象草青贮样。

图1为上述提供食窦魏斯氏菌的光学显微镜图。

表1菌液pH与OD值

菌株编号F10的微生物为本专利初步筛选后的菌株，由该初步筛选后的菌株经厌氧培养、DNA提取、以提取的DNA为模板进行PCR扩增得到的本发明提供的食窦魏斯氏菌，其生长速率快，产酸效率高。

实施例2

生理生化测定：分析实施例1中的食窦魏斯氏菌生理生化特征，结果见表2。

不同温度试验：将实施例1中的食窦魏斯氏菌以3％的接种量接种到MRS液体培养基中，在表2的温度条件下进行培养，观察其生长状况，结果见表2。

耐盐试验：将实施例1中的食窦魏斯氏菌以含有NaCl浓度3.0％(w/v)和6.5％(w/v)的MRS液体培养基中，30℃下培养2天后，测定其耐盐性，结果见表2。

耐酸试验：将实施例1中的食窦魏斯氏菌为表2pH值条件的MRS液体培养基中30℃下培养7天后，测定其耐酸性，结果见表2。

糖发酵试验：通过糖发酵试验分析实施例1中的食窦魏斯氏菌糖发酵特征，结果见表3。

16S rDNA序列分析：将实施例1中的食窦魏斯氏菌进行16S rDNA序列分析，其16s rDNA如SEQ ID NO.1所示；与其他食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)16S rDNA分析序列的相似性达到100％和99％。

表2生理生化测定、不同温度试验、耐盐试验和耐酸试验结果

表2中，+：生长Positive；－:不生长Negative；W:微弱生长Weakly positive.

由表2可知，本发明提供的食窦魏斯氏菌耐盐性和耐酸性好，对不同温度的适应性较好。

表3糖发酵试验结果

表3中，+：生长Positive；－:不生长Negative；W:微弱生长Weakly positive.

由表3可知，本发明提供的食窦魏斯氏菌利用碳源范围交广，可较好的利用不同青贮原料中不同类型的碳源进行发酵。

实施例3

将本发明的食窦魏斯氏菌作为牧草青贮添加剂

在四川农业大学崇州基地取高度1.5～2m的牧草，切成长度约为20mm，得到鲜样，每个处理各取鲜样300g装进塑料袋(25×35cm；Aodeju,China)，按照将实施例1中的本发明食窦魏斯氏菌1.0×10⁸CFU/g新鲜材料添加1ml于每袋青贮饲料中，然后抽真空封口，置于室温中发酵，每个处理组3个重复，青贮60d后开封，得到青贮样。

1、感官评定：

1)青贮样根据德国牧业协会(DLG)1899年编订的感官青贮评分标准及等级评定对青贮饲料的气味、结构和色泽分别进行感官评分。

表4青贮饲料感官评定标准(DLG)

2)感官评定结果见表5。

表5感官评定结果

由表5可知，本发明提供的食窦魏斯氏菌作为牧草青贮添加剂与不添加任何添加剂的对照组相比，在气味方面，臭味等弱，芳香性更佳，茎叶结构保持更佳，色泽更好。

2、发酵品质分析：

1)取20g青贮样加入180mL去离子水放入小型搅拌机中搅拌1min，过8层滤布，用苯酚-次氯酸纳比色法测定滤液pH值，用苯酚-次氯酸纳比色法测定滤液氨态氮(NH₃-N)

取20g青贮样与180ml灭菌蒸馏水混合震荡，用四层纱布过滤，采用高效液相色谱法测定有机酸含量。

2)牧草为狼尾草属牧草，狼尾草属牧草发酵品质分析见表6、表7。

表6狼尾草属牧草发酵品质分析

表7狼尾草属牧草发酵品质分析

ND:未检出。

3)牧草为牛鞭草属牧草，牛鞭草属牧草发酵品质分析结果见表8。

表8牛鞭草属牧草发酵品质分析

由表6～8可知，本发明提供的食窦魏斯氏菌作为牧草青贮添加剂与不添加任何添加剂的对照组相比，能快速降低牧草青贮pH值，青贮品质更好，本发明提供的食窦魏斯氏菌作为牧草青贮添加剂NH₃-N/％TN显著低于不添加任何添加剂的对照组。本发明提供的食窦魏斯氏菌作为牧草青贮添加剂可显著增加乳酸含量，可提升乳酸菌数量，并显著降低酵母菌和肠杆菌数量，是乳酸菌成为优势菌群，一直青贮饲料中的有害菌，提高牧草的青贮品质。本发明提供的食窦魏斯氏菌作为狼尾草属牧草青贮添加剂，青贮60d，可显著提高有机酸含量，提高狼尾草属牧草青贮的发酵速率，从而提高青贮成功率，改善狼尾草属牧草的青贮品质。

3、营养成分分析：

1)取青贮样置于鼓风干燥箱中，105℃杀青0.5h，随后在65℃烘72h左右直至恒重，烘干样品用小型植物样粉碎机粉碎后过40目筛。采用常规烘干法测定干物质(Dry Matter,DM)，采用FOSS 8400型全自动凯氏定氮仪蒸馏测定粗蛋白(Crude Protein,CP)，采用范氏洗涤纤维法测定中性洗涤纤维(Neutral Detergent Fiber,NDF)与酸性洗涤纤维(Acid Detergent Fiber,ADF)，采用蒽酮-硫酸比色法测定可溶性碳水化合物(Water Soluble Carbohydrates,WSC)；

2)牧草为狼尾草属牧草，狼尾草属牧草营养成分分析结果见表9。

表9狼尾草属牧草营养成分

3)牧草为牛鞭草属牧草，牛鞭草属牧草营养成分结果见表10。

表10牛鞭草属牧草营养成分

由表9、表10可知，本发明提供的食窦魏斯氏菌作为牧草青贮添加剂与不添加任何添加剂的对照组相比，能提高牧草青贮饲料干物质含量，干物质回收率、粗蛋白含量，提升牧草青贮饲料的质量；降低了纤维含量，提高了适口性，进而提升牧草青贮饲料的质量。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种食窦魏斯氏菌及其应用、筛选检定方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1390

<212> DNA

<213> 食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)

<400> 1

ggctttgggt gttacaaact ctcatggtgt gacgggcggt gtgtacaaga cccgggaacg 60

tattcaccgc ggcgtgctga tccgcgatta ctagcgattc cgacttcatg taggcgagtt 120

gcagcctaca atccgaactg agacgtactt taagagatta gctcaccctc gcgggttggc 180

aactcgttgt atacgccatt gtagcacgtg tgtagcccag gtcataaggg gcatgatgat 240

ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg tcaccggcag tctcactaga gtgcccaact 300

aaatgctggc aactagtaat aagggttgcg ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac 360

gacacgagct gacgacaacc atgcaccacc tgtcaccttg tccccgaagg gaacgctcca 420

tctctggagt tgtcaaggga tgtcaagacc tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta 480

aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggtcc ccgtcaattc ctttgagttt caaccttgcg 540

gtcgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc gttagctgcg gcacttaagg gcggaaaccc 600

tcaaacacct agcactcatc gtttacggtg tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc 660

tacccacact ttcgagcctc aacgtcagtt acagtccaga aagccgcctt cgccactggt 720

gttcttccat atatctacgc atttcaccgc tacacatgga gttccacttt cctctactgc 780

actcaagtca tccagtttcc aaagcaattc ctcagttgag ctgagggctt tcacttcaga 840

cttaaataac cgtctgcgct cgctttacgc ccaataaatc cggataacgc ttggaacata 900

cgtattaccg cggctgctgg cacgtattta gccgttcctt tctggtaaga taccgtcaca 960

cattgaacag ttactctcaa tgtcattctt ctcttacaac agtgttttac gagccgaaac 1020

ccttcatcac acacgcggcg ttgctccatc aggctttcgc ccattgtgga agattcccta 1080

ctgctgcctc ccgtaggagt atgggccgtg tctcagtccc attgtggccg atcagtctct 1140

caactcggct atgcatcatc gtcttggtga gccattacct caccaactaa ctaatgcacc 1200

gcgggaccat ctcttagtga tagcagaacc atcttttaag tagcaaccat gcggttgcta 1260

ttgttatacg gtattagcat ctgtttccaa atgttatccc ctgctaagag gtaggtttcc 1320

cacgtgttac tcacccgttc gccactcttt gcaatgtcca tcgtcatatc tgagcaagct 1380

cttcaaatca 1390

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19