咖啡因在制备抑制SARS-CoV-2病毒易感性药物中的应用

摘要

本发明公开了咖啡因的医药用途。所述用途为以下(a)和/或(b)和/或(c)和/或(d)和/或(e)：(a)咖啡因在制备治疗冠状病毒所致疾病或冠状病毒感染的产品中的应用；(b)咖啡因在制备预防冠状病毒所致疾病或冠状病毒感染的产品中的应用；(c)咖啡因在制备抑制冠状病毒易感性的产品中的应用；(d)咖啡因在制备降低冠状病毒感染风险的产品中的应用；(e)咖啡因在制备冠状病毒抑制剂中的应用。本发明通过研究发现，咖啡因能降低SARS‑CoV‑2病毒的感染风险。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及咖啡因在制备抑制SARS-CoV-2病毒易感性药物中的应用。

背景技术

冠状病毒(Coronavirus，CoV)广泛存在于自然界，是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，冠状病毒仅感染脊椎动物，与人类和动物的多种疾病有关，可引起人和动物呼吸道、消化道和神经系统疾病。由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的病毒性肺炎(COVID-19)已成为国际关注的突发公共卫生事件。

咖啡因(Caffeine)又名1，3，7-三甲基黄嘌呤，是一种植物生物碱，在许多植物中都能够被发现。它通过抑制ATM(ataxia telangiectasia mutated kinase)和ATR(ATM andRad3-related kinase)的激酶活性来抑制细胞的DNA修复能力。目前尚未见该咖啡因作为制备抗冠状病毒的药物报道。

发明内容

本发明的目的是提供咖啡因的医药用途。

本发明所提供的咖啡因的医药用途，为以下(a)和/或(b)和/或(c)和/或(d)和/或(e)：

(a)咖啡因在制备治疗冠状病毒所致疾病或冠状病毒感染的产品中的应用；

(b)咖啡因在制备预防冠状病毒所致疾病或冠状病毒感染的产品中的应用；

(c)咖啡因在制备抑制冠状病毒易感性的产品中的应用；

(d)咖啡因在制备降低冠状病毒感染风险的产品中的应用；

(e)咖啡因在制备冠状病毒抑制剂中的应用。

所述产品可为药物或药物制剂。

所述冠状病毒抑制剂能够抑制冠状病毒的复制。

上述应用中，制备药物或药物制剂时，咖啡因可作为有效成分之一，也可作为唯一有效成分。

上述应用中，制备药物或药物制剂时，咖啡因可作为活性成分之一，也可作为唯一活性成分。

上述应用中，制备药物时，还可加入载体材料。

载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；腔道给药，如经直肠和阴道；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。

本发明还提供了一种药物或药物组合物，其活性成分包括咖啡因。

所述药物或药物组合物具有下述至少一种功效：

1)治疗冠状病毒所致疾病或冠状病毒感染；

2)预防冠状病毒所致疾病或冠状病毒感染；

3)抑制冠状病毒易感性；

4)降低冠状病毒感染风险；

5)冠状病毒抑制剂。

上述药物或药物组合物可以按照本领域技术人员已知的常规方法制成溶液剂、片剂、胶囊或注射剂等剂型。

利用咖啡因预防和/或治疗冠状病毒引起的感染时，给予受试者生物体有效量的咖啡因。

本发明还保护一种抑制冠状病毒感染动物的方法，包括如下步骤：给受体动物施用咖啡因以抑制冠状病毒感染动物。

本发明还保护一种预防冠状病毒所致疾病的方法，包括如下步骤：给受体动物施用咖啡因进行预防冠状病毒所致疾病。

本发明还保护一种治疗冠状病毒所致疾病的方法，包括如下步骤：给受体动物施用咖啡因治疗冠状病毒所致疾病。

本发明中，所述冠状病毒可为β属冠状病毒，具体可为SARS-CoV-2。

本发明中，所述冠状病毒所致疾病可为呼吸系统感染和/或消化系统感染。

所述呼吸系统感染为呼吸道感染和/或肺部感染；所述呼吸道感染可为鼻咽炎、鼻炎、咽喉炎、气管炎和/或支气管炎；所述肺部感染可为肺炎；所述消化系统感染可为腹泻。

本发明中，所述冠状病毒所致疾病通常包括病毒性肺炎、严重急性呼吸综合征等。

本发明中，所述冠状病毒感染通常引起病毒性肺炎、严重急性呼吸综合征等疾病。

本发明通过研究发现，咖啡因能降低SARS-CoV-2病毒的感染风险，具有用于制备抗冠状病毒药物的潜力。

附图说明

图1为将稳定表达Rluc的Caco-2细胞和稳定表达Rluc的Calu-3细胞2*10

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中所使用的三个包装质粒：PLP1，PLP2、VSV-G购自Addgene。

下述实施例中所使用的Caco-2(结直肠腺癌细胞)、Calu-3细胞(人肺腺癌细胞)购自中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心。

下述实施例中所使用的咖啡因购自Sigma公司。

实施例1、Caffeine抑制SARS-CoV-2对细胞的易感性

(一)、构建稳定表达荧光素酶Rluc的Caco-2及Calu-3细胞系

为构建稳定表达Renilla-luciferase(RLuc)的Caco-2及Calu-3细胞系，我们首先包装了Rluc的慢病毒颗粒(RLuc慢病毒表达载体pHHLVX-EF1α-Rluc-puro购自HedgehogBio Science and Technology Ltd)。

首先将HEK293T细胞在T-75细胞培养瓶中用含10％胎牛血清的15ml DMEM培养基培养至密度达到70％；然后进行质粒转染：将总量20μg的PLP1(5.88μg),PLP2(2.8μg),VSV-G(3.92μg)和pHHLVX-EF1α-Rluc-puro(7μg),和58.8μl PEI(1mg/ml)混合在1.5ml无血清的DMEM中，室温反应15分钟后加入HEK293T细胞中。转染6小时后换液；转染48小时后1000g离心10分钟去除细胞碎片，收取上清，然后0.45μm滤器过滤，滤液4℃放置，T-75细胞培养瓶中再加入15ml新鲜的DMEM培养基，24小时后再按上述方法收取上清并获得滤液，两批滤液合并后加入5×病毒浓缩液(50％PEG-8000,1.5M Nacl)，4℃过夜，然后再2000x g 4℃离心30分钟，小心弃掉上清后将沉淀物用500μl PBS重悬。为进一步去除血清中的蛋白成分，沉淀用PBS重悬后再12000g 4℃离心5分钟取上清，得到的上清即为浓缩慢病毒溶液，-80℃保存即可。浓缩好的慢病毒使用Lenti-pac HIV qRT-PCR Titration Kits(GeneCopoeia)试剂盒测定滴度。

将浓缩慢病毒溶液按照MOI＝1分别加入到Caco2细胞及Calu3细胞中，感染6小时后换液，48小时后加入终浓度为2μg/ml的嘌呤霉素进行筛选，5天后存活的细胞即为稳定表达Rluc的Caco-2细胞和稳定表达Rluc的Calu-3细胞。

(二)构建包含SARS-CoV-2S蛋白的假病毒

1、SARS-CoV-2S蛋白表达质粒构建

将序列表的序列1所示的双链DNA分子插入pcDNA3.0载体的KpnI和EcoRI酶切位点之间，得到重组质粒SARS-CoV-2-S。序列表的序列1中，第4-3765位核苷酸编码缺失C端19个氨基酸残基的SARS-CoV-2S蛋白。SARS-CoV-2S蛋白由1273个氨基酸残基组成。缺失C端19个氨基酸残基有助于增强蛋白整合到假病毒颗粒上的能力。

2、Luciferase表达质粒构建

将序列表的序列2所示的双链DNA分子插入到pCDH-CMV-MCS-EF1-puro载体(购自SBI公司)的NheI和BamHI酶切位点之间，得到重组质粒Luciferase(又称为重组质粒pCDH-Luc)。重组质粒Luciferase的第7-1659位核苷酸编码Luciferase(Firefly luciferase)。Luciferase由550个氨基酸残基组成。

3、SARS-CoV-2-S假病毒包装假病毒包装方式基本同Rluc慢病毒包装，差异仅在于：将VSV-G换成SARS-CoV-2-S，并且将pHHLVX-EF1α-Rluc-puro(7μg)换成pCDH-Luc(7μg)。

具体如下：首先将HEK293T细胞在T-75细胞培养瓶中用含10％胎牛血清的15mlDMEM培养基培养至密度达到70％；然后进行质粒转染：将总量20μg的PLP1(5.88μg),PLP2(2.8μg),SARS-CoV-2-S(3.92μg)和pCDH-Luc(7μg),和58.8μl PEI(1mg/ml)混合在1.5ml无血清的DMEM中，室温反应15分钟后加入HEK293T细胞中。转染6小时后换液；转染48小时后1000g离心10分钟去除细胞碎片，收取上清，然后0.45μm滤器过滤，滤液4℃放置，T-75细胞培养瓶中再加入15ml新鲜的DMEM培养基，24小时后再按上述方法收取上清并获得滤液，两批滤液合并后加入5×病毒浓缩液(50％PEG-8000,1.5M Nacl)，4℃过夜，然后再2000x g 4℃离心30分钟，小心弃掉上清后将沉淀物用500μl PBS重悬。为进一步去除血清中的蛋白成分，沉淀用PBS重悬后再12000g 4℃离心5分钟取上清，得到的上清即为浓缩SARS-CoV-2-S假病毒溶液，-80℃保存即可。

(三)咖啡因处理细胞抑制假病毒感染

分别将稳定表达Rluc的Caco-2细胞和稳定表达Rluc的Calu-3细胞，以每孔2×10

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 咖啡因在制备抑制SARS-CoV-2病毒易感性药物中的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3768

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

accatgtttg tgttcctggt gctgctgcca ctggtgtcca gccagtgtgt gaacctgacc 60

accaggaccc aacttcctcc tgcctacacc aactccttca ccaggggagt ctactaccct 120

gacaaggtgt tcaggtcctc tgtgctgcac agcacccagg acctgttcct gccattcttc 180

agcaatgtga cctggttcca tgccatccat gtgtctggca ccaatggcac caagaggttt 240

gacaaccctg tgctgccatt caatgatgga gtctactttg ccagcacaga gaagagcaac 300

atcatcaggg gctggatttt tggcaccacc ctggacagca agacccagtc cctgctgatt 360

gtgaacaatg ccaccaatgt ggtgattaag gtgtgtgagt tccagttctg taatgaccca 420

ttcctgggag tctactacca caagaacaac aagtcctgga tggagtctga gttcagggtc 480

tactcctctg ccaacaactg tacctttgaa tatgtgagcc aaccattcct gatggacttg 540

gagggcaagc agggcaactt caagaacctg agggagtttg tgttcaagaa cattgatggc 600

tacttcaaga tttacagcaa acacacacca atcaacctgg tgagggacct gccacagggc 660

ttctctgcct tggaaccact ggtggacctg ccaattggca tcaacatcac caggttccag 720

accctgctgg ctctgcacag gtcctacctg acacctggag actcctcctc tggctggaca 780

gcaggagcag cagcctacta tgtgggctac ctccaaccaa ggaccttcct gctgaaatac 840

aatgagaatg gcaccatcac agatgctgtg gactgtgccc tggacccact gtctgagacc 900

aagtgtaccc tgaaatcctt cacagtggag aagggcatct accagaccag caacttcagg 960

gtccaaccaa cagagagcat tgtgaggttt ccaaacatca ccaacctgtg tccatttgga 1020

gaggtgttca atgccaccag gtttgcctct gtctatgcct ggaacaggaa gaggattagc 1080

aactgtgtgg ctgactactc tgtgctctac aactctgcct ccttcagcac cttcaagtgt 1140

tatggagtga gcccaaccaa actgaatgac ctgtgtttca ccaatgtcta tgctgactcc 1200

tttgtgatta ggggagatga ggtgagacag attgcccctg gacaaacagg caagattgct 1260

gactacaact acaaactgcc tgatgacttc acaggctgtg tgattgcctg gaacagcaac 1320

aacctggaca gcaaggtggg aggcaactac aactacctct acagactgtt caggaagagc 1380

aacctgaaac catttgagag ggacatcagc acagagattt accaggctgg cagcacacca 1440

tgtaatggag tggagggctt caactgttac tttccactcc aatcctatgg cttccaacca 1500

accaatggag tgggctacca accatacagg gtggtggtgc tgtcctttga actgctccat 1560

gcccctgcca cagtgtgtgg accaaagaag agcaccaacc tggtgaagaa caagtgtgtg 1620

aacttcaact tcaatggact gacaggcaca ggagtgctga cagagagcaa caagaagttc 1680

ctgccattcc aacagtttgg cagggacatt gctgacacca cagatgctgt gagggaccca 1740

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gtgcctgtgg ctatccatgc tgaccaactt acaccaacct ggagggtcta cagcacaggc 1920

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atgtatatct gtggagacag cacagagtgt agcaacctgc tgctccaata tggctccttc 2280

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acccactggt ttgtgaccca gaggaacttc tatgaaccac agattatcac cacagacaac 3360

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ctccaagaac tgggcaaata tgaacaatac atcaagtggc catggtacat ctggctgggc 3660

ttcattgctg gactgattgc cattgtgatg gtgaccataa tgctgtgttg tatgacctcc 3720

tgttgttcct gtctgaaagg ctgttgttcc tgtggctcct gttgttaa 3768

<210> 2

<211> 1659

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gccaccatgg aagacgccaa aaacataaag aaaggcccgg cgccattcta tcctctagag 60

gatggaaccg ctggagagca actgcataag gctatgaaga gatacgccct ggttcctgga 120

acaattgctt ttacagatgc acatatcgag gtgaacatca cgtacgcgga atacttcgaa 180

atgtccgttc ggttggcaga agctatgaaa cgatatgggc tgaatacaaa tcacagaatc 240

gtcgtatgca gtgaaaactc tcttcaattc tttatgccgg tgttgggcgc gttatttatc 300

ggagttgcag ttgcgcccgc gaacgacatt tataatgaac gtgaattgct caacagtatg 360

aacatttcgc agcctaccgt agtgtttgtt tccaaaaagg ggttgcaaaa aattttgaac 420

gtgcaaaaaa aattaccaat aatccagaaa attattatca tggattctaa aacggattac 480

cagggatttc agtcgatgta cacgttcgtc acatctcatc tacctcccgg ttttaatgaa 540

tacgattttg taccagagtc ctttgatcgt gacaaaacaa ttgcactgat aatgaattcc 600

tctggatcta ctgggttacc taagggtgtg gcccttccgc atagaactgc ctgcgtcaga 660

ttctcgcatg ccagagatcc tatttttggc aatcaaatca ttccggatac tgcgatttta 720

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ggatttcgag tcgtcttaat gtatagattt gaagaagagc tgtttttacg atcccttcag 840

gattacaaaa ttcaaagtgc gttgctagta ccaaccctat tttcattctt cgccaaaagc 900

actctgattg acaaatacga tttatctaat ttacacgaaa ttgcttctgg gggcgcacct 960

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cattctggag acatagctta ctgggacgaa gacgaacact tcttcatagt tgaccgcttg 1320

aagtctttaa ttaaatacaa aggatatcag gtggcccccg ctgaattgga atcgatattg 1380

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