爱格氏菌AUH‑JLD49s及其在3′‑去甲基‑牛蒡苷元转化中的应用

摘要

本发明公开了一种爱格氏菌AUH‑JLD49s及其在3′‑去甲基‑牛蒡苷元转化中的应用，属于细菌技术领域。爱格氏菌（

说明书

技术领域

本发明涉及细菌技术领域。

背景技术

牛蒡（Arctium> L.）为菊科二年生根茎类药食两用植物，其根和茎叶可作为蔬菜食用，根、果实和种子还可入药。牛蒡子为牛蒡的干燥成熟果实，具有抗炎、抗癌、抗HIV、抗糖尿病等多种药理作用。其中牛蒡苷（Arctiin）是中药牛蒡子的主要活性成分（吉林师范大学学报,>中国现代中药,2012,>

牛蒡被人或其他动物摄入体内后，牛蒡中的主要活性成分牛蒡苷将被寄居在肠道的微生物菌群转化为不同产物。根据日本学者Mitsuhiko Nose等1992年报道，小鼠肠道菌群可将底物牛蒡苷元转化为3′-去甲基-牛蒡苷元（Planta>, 1992, 58(6):520-523）；2003年，Masao Hattori研究小组将牛蒡苷与人粪便共培养，检测到6种牛蒡苷的代谢产物，其中的代谢产物4即为本发明中的产物3′-去甲基-4′-去羟基-牛蒡苷元。然而，由于Masao Hattori等采用的是人粪便中的微生物菌群转化，代谢产物4仅在某一特定时间内才能检测到（即共培养25-125小时），代谢产物4的浓度在共培养约75小时左右达到最高值后又迅速下降。众所周知，与单一菌株相比，利用粪样菌群进行转化时结果不稳定，转化效果重现性差；另外，Masao Hattori等利用人粪样菌群转化牛蒡苷时，代谢产物种类多，代谢产物4等中间代谢产物仅能在某一特定时间段才能检测到，很难对包括代谢产物4在内的中间代谢产物进行有效制备（Chemical>, 2003, 51(4): 378-384）；2007年，Masao Hattori研究小组从人新鲜粪样中分离得到一株真细菌属菌株Eubacteriumsp.>ARC-2，菌株ARC-2可将底物牛蒡苷元转化为7种不同的去甲基产物（Biological>, 2007, 30(5):904-911）；2013年，本实验室分离得到一株布劳特菌属菌株Blautia>Journal Agricultural Food>,>

为寻找具有抗病毒活性的天然产物结构类似物，1996年德国学者Eich等以芳基二噻烷为起始物，利用化学方法合成一系列木脂素类化合物的结构类似物，其中包括本发明中的产物 3′-DM-4′-DH-AG。但化合物3′-DM-4′-DH-AG得率仅仅50%左右（Journal of>Medicinal>, 1996, 39, 86-95）。上述化学合成中用到的催化剂雷尼镍为致癌物，三苯基膦和丁基锂为具有刺激性的危险性催化剂，迄今，国内外尚无任何公司利用化学方法生产或销售3′-DM-4′-DH-AG。由于化合物3′-DM-4′-DH-AG资源匮乏，有关化合物3′-DM-4′-DH-AG生理活性方面报道极少。目前仅一篇文献报道，当3′-DM-4′-DH-AG浓度为10^-8摩尔/升（即10^{-2>微摩尔/升）时，产物3′-DM-4′-DH-AG能显著促进人乳腺癌细胞株MCF-7的生长，而当浓度增大为10-7-10-5摩尔/升时，产物3′-DM-4′-DH-AG则对细胞株MCF-7的生长无明显影响（Chemical>, 2003, 51(4):378-384）。}

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种爱格氏菌（Eggerthella>

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

一种爱格氏菌AUH-JLD49s（Eggerthella>

爱格氏菌AUH-JLD49s（KX650621）是从人粪样中分离得到的一株革兰氏阴性严格厌氧细菌菌株，该菌株在厌氧工作站内能将3′-去甲基-牛蒡苷元（3′-DMAG）转化为3′-去甲基-4′-去羟基-牛蒡苷元（3′-DM-4′-DH-AG）。有关3′-DM-4′-DH-AG微生物生物合成途径如下所示：

本发明中的爱格氏菌Eggerthella>

爱格氏菌Eggerthella>

菌落直径1.0～2.0毫米，菌落边缘整齐，中部有凸起，随培养时间延长菌落黄色加深；在BHI培养基中菌体为杆状，革兰氏染色呈阴性。

本发明还提供了菌株AUH-JLD49s在3′-去甲基-牛蒡苷元转化中的应用，包括下述步骤：

（1）菌株AUH-JLD49s的培养；

（2）底物3′-去甲基-牛蒡苷元粗品与菌株AUH-JLD49s共培养，将底物3′-去甲基-牛蒡苷元粗品转化为3′-去甲基-4′-去羟基-牛蒡苷元；

（3）转化产物的分离纯化。

其中，菌株AUH-JLD49s的培养方法为：将低温冷冻保存的菌株AUH-JLD49s融化并按15-20%体积比的接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，在厌氧工作站内37℃下培养18-24小时；再以10-15%体积比的接种量将试管中的菌株AUH-JLD49s重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基中，继续在厌氧工作站内培养18-24小时作为种子液。

底物3′-去甲基-牛蒡苷元粗品与菌株AUH-JLD49s共培养方法为：

将菌株AUH-JLD49s的种子液按10-15%体积比的接种量转接到BHI液体培养基中培养，然后加入3′-去甲基-牛蒡苷元粗品，使得3′-去甲基-牛蒡苷元在培养基中的浓度不超过1.0毫摩尔/升，在厌氧工作站内培养2-3天，即可将底物3′-去甲基-牛蒡苷元粗品高效转化为3′-去甲基-4′-去羟基-牛蒡苷元（3′-DM-4′-DH-AG）。

3′-去甲基-牛蒡苷元与3′-去甲基-牛蒡苷元粗品的质量百分比不低于90%。

直接发酵的底物3′-去甲基-牛蒡苷元粗品中3′-去甲基-牛蒡苷元的浓度为100-200毫摩尔/升。

转化产物的分离纯化采用下述方法：

用等体积的乙酸乙酯将步骤（2）中得到的培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离制备3′-去甲基-4′-去羟基-牛蒡苷元（3′-DM-4′-DH-AG）。

其中，菌株AUH-JLD49s的分离培养包括下述步骤：

（1）人粪样的采集与培养

用已灭菌的棉签挑取新鲜粪便，放入1毫升新鲜BHI液体培养基中，置厌氧工作站内在37℃温度下培养24小时，作为筛选特定功能微生物菌株的微生物菌群；

（2）分离培养AUH-JLD49s

①单菌落分离培养

用新鲜BHI液体培养基将事先在厌氧工作站内培养24小时的微生物菌群进行梯度稀释，分别稀释到浓度为10^–1，10^–2、10^–3、10^–4、10^–5、10^–6、10^–7、10^–8，再分别将100微升浓度分别为10^–5、10^–6、10^–7、10^–8的微生物菌群稀释液均匀涂在预先备好的BHI固体培养基上，将涂有微生物菌群稀释液的BHI固体培养基置于厌氧工作站内培养48小时后，分别从BHI固体培养基上挑取数十至数百个单菌落置BHI固体培养皿上，并对所挑取的单菌落进行随机编号。

②单菌落转化活性测定

将已编号的单菌落分别接种到盛有1毫升BHI液体培养基的试管内，加入0.1毫摩尔/升3′-去甲基-牛蒡苷元粗品，在厌氧工作站内培养2天，取100微升培养液并用1000微升乙酸乙酯进行萃取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC进行检测，最终确定出具有转化底物3′-去甲基-牛蒡苷元功能的单菌落。

底物3′-去甲基-牛蒡苷元粗品的制备：

3′-去甲基-牛蒡苷元的制备同本实验室获得的已授权发明专利“布劳特菌AUH-JLD56及其在牛蒡苷元转化中的应用”（ZL 201310368975.5）。与上述已授权国家发明专利不同的是，本发明中所用底物3′-去甲基-牛蒡苷元为已授权发明专利（ZL 201310368975.5）中未经过纯化的3′-去甲基-牛蒡苷元粗品（即步骤（2）中得到的培养物）。因此，可省去发明专利（ZL 201310368975.5）中的代谢产物的分离纯化步骤，节约时间和成本。

3′-去甲基-牛蒡苷元与3′-去甲基-牛蒡苷元粗品的质量百分比不低于90%。

本发明对得到的产物3′-DM-4′-DH-AG进行纯化，并首次对其体外抗癌活性进行研究。结果表明，浓度为50-200微摩尔/升的产物3′-DM-4′-DH-AG对人结肠癌细胞株HCT116和人乳腺癌细胞株MDA-MB-231的生长均具有明显的抑制作用，其中浓度为100微摩尔/升3′-DM-4′-DH-AG对HCT116和231的体外抑制率分别为41.67%和21.33%。随着对产物3′-DM-4′-DH-AG生理功能研究的不断深入，今后极有可能将3′-DM-4′-DH-AG开发为新型抗癌药物。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

本发明提供的菌株AUH-JLD49s能将中药牛蒡子中牛蒡苷元的一种转化产物3′-去甲基-牛蒡苷元转化为3′-去甲基-4′-去羟基-牛蒡苷元，解决了牛蒡苷元转化产物3′-去甲基-4′-去羟基-牛蒡苷元资源缺乏的问题，对牛蒡苷元药理活性物质微生物代谢产物的研究及新药研发具有极大的推动作用。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明；

图1为本发明实施例1中菌株AUH-JLD49s转化底物3′-去甲基-牛蒡苷元的高效液相色谱图；

图2为3′-去甲基-牛蒡苷元转化产物的紫外吸收图谱；

图3为3′-去甲基-牛蒡苷元转化产物的质谱图；

图4为厌氧菌株AUH-JLD49s对底物3′-去甲基-牛蒡苷元的转化动态曲线图；

图5为厌氧菌株AUH-JLD49s对不同浓度底物3′-去甲基-牛蒡苷元转化能力比较图；

图6为产物3′-去甲基-4′-去羟基-牛蒡苷元对人结肠癌细胞株HCT116和人乳腺癌细胞株MDA-MB-231的抑制率图。

具体实施方式

实施例1

1.菌株AUH-JLD49s的分离培养

（1）人粪样的采集与培养

用已灭菌的棉签挑取人新鲜粪便，放入1毫升新鲜BHI液体培养基中，置厌氧工作站内在37℃温度下培养24小时，作为筛选特定功能微生物菌株的微生物菌群。

（2）分离培养菌株AUH-JLD49s

①单菌落分离培养

用新鲜BHI液体培养基将事先在厌氧工作站内培养24小时的微生物菌群进行梯度稀释，分别稀释到浓度为10^–1，10^–2、10^–3、10^–4、10^–5、10^–6、10^–7、10^–8，再分别将100微升浓度分别为10^–5、10^–6、10^–7、10^–8的微生物菌群稀释液均匀涂在预先备好的BHI固体培养基上，将涂有微生物菌群稀释液的BHI固体培养基置于厌氧工作站内培养48小时后，分别从BHI固体培养基上挑取数十至数百个单菌落置BHI固体培养皿上，并对所挑取的单菌落进行随机编号。

②单菌落转化活性测定

将已编号的、培养在BHI固体培养基上的单菌落接种到盛有1毫升BHI液体培养基的试管内，再分别加入3′-去甲基-牛蒡苷元终浓度为0.1毫摩尔/升，在厌氧工作站内培养2天，取100微升培养液并用1000微升乙酸乙酯进行萃取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC检测有无产物生成。一旦某试管中培养物被检测出有产物生成，便对菌株进行纯化培养和菌种保藏，同时对产物进行纯化和结构鉴定。

2.菌株AUH-JLD49s的纯化培养、菌种鉴定与保藏

（1）单菌落的纯化培养

将筛选出的单一功能微生物菌落在BHI固体培养基上划线培养，长出单菌落后，再对长出的单菌落进行划线，重复至少3次以上，确保长出的单菌落形态一致。将纯化后的单菌落接种到1毫升BHI液体培养基中，培养24小时取菌液100微升，加入到盛有500微升事先已灭菌的脱脂奶粉的冻存管中，混匀后在其表面加2毫米厚事先已灭菌的液体石蜡，再将其保藏在-80℃的超低温冰箱中，对低温保藏的功能微生物菌株定期进行复壮培养和转化活性测定。

（2）对分离出的特定功能微生物菌株进行菌种鉴定

以单一功能微生物菌株菌体总DNA为模板，以通用引物27F/1492R（27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）为引物对16S rDNA序列进行PCR扩增，PCR扩增产物送交上海生工生物工程有限公司进行DNA测序，测序结果经BLAST比对与GenBank数据库其他菌株进行相似性分析，该单一功能微生物菌株的16S rDNA序列与缓慢爱格氏菌Eggerthella>的相似性高达99.8%，因此，将该转化菌株初步确定为爱格氏菌属菌株。将该功能微生物菌株命名为AUH-JLD49s，并将其16S rDNA序列上交NCBI基因库，得到该菌株注册号（Accession Number）KX650621。

3.菌株AUH-JLD49s在3′-去甲基-牛蒡苷元转化中的应用

（1）菌株AUH-JLD49s的培养

将–80℃低温保存的人肠道分离菌株AUH-JLD49s冻融后，按20%体积比的接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，在厌氧工作站内37℃下培养18小时后试管中菌液呈均匀混浊。再以10%体积比的接种量将试管中已长混浊的菌株AUH-JLD49s重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基的玻璃试管中，继续在厌氧工作站内培养24小时作为种子液。

（2）底物3′-去甲基-牛蒡苷元粗品与菌株AUH-JLD49s共培养

在厌氧工作站内将上述事先培养好的菌株AUH-JLD49s的种子液按10%体积比的接种量转接到盛有液体培养基的三角瓶内培养，同时加入3′-去甲基-牛蒡苷元的浓度为150毫摩尔/升的3′-去甲基-牛蒡苷元粗品，使得培养基中3′-去甲基-牛蒡苷元浓度为1.0毫摩尔/升，在厌氧工作站内培养3天，菌株AUH-JLD49s可将底物3′-DMAG转化为3′-DM-4′-DH-AG。

（3）用HPLC检测底物3′-去甲基-牛蒡苷元被菌株AUH-JLD49s的转化情况

从上述三角瓶中取出培养物100微升至1.5毫升EP管中，加1000微升乙酸乙酯进行萃取，静置离心后取出上层乙酸乙酯800微升，在离心浓缩仪中蒸干后加入800微升100%甲醇溶液，经HPLC检测底物转化情况（见附图1）。

（4）转化产物的分离纯化

经HPLC检测如果底物转化良好，用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后在旋转蒸发仪上蒸干，然后加入100%甲醇溶液，过孔径为0.45微米的有机膜后用制备柱在HPLC上进行分离制备，用干净三角瓶收集代谢产物3′-DM-4′-DH-AG。

实施例2

菌株AUH-JLD49s的分离培养方法同实施例1，菌株AUH-JLD49s在3′-去甲基-牛蒡苷元转化中的应用包括下述步骤：

（1）菌株AUH-JLD49s的培养

将–80℃低温保存的人肠道分离菌株AUH-JLD49s冻融后，按15%体积比的接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，在厌氧工作站内37℃下培养20小时后试管中菌液呈均匀混浊。再以15%体积比的接种量将试管中已长混浊的菌株AUH-JLD49s重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基的玻璃试管中，继续在厌氧工作站内培养18小时作为种子液。

（2）底物3′-去甲基-牛蒡苷元粗品与菌株AUH-JLD49s共培养

在厌氧工作站内将上述事先培养好的菌株AUH-JLD49s的种子液按15%体积比的接种量转接到盛有液体培养基的三角瓶内培养，同时加入3′-去甲基-牛蒡苷元的浓度为100毫摩尔/升的3′-去甲基-牛蒡苷元粗品，使得培养基中底物浓度为0.8毫摩尔/升，在厌氧工作站内培养2.5天，菌株AUH-JLD49s可将底物3′-DMAG转化为3′-DM-4′-DH-AG。

（3）HPLC检测底物3′-去甲基-牛蒡苷元被菌株AUH-JLD49s的转化情况

从上述三角瓶中取出培养物100微升至1.5毫升EP管中，加1000微升乙酸乙酯进行萃取，静置离心后取出上层乙酸乙酯800微升，在离心浓缩仪中蒸干后加入800微升100%甲醇溶液，经HPLC检测底物转化情况。

（4）转化产物的分离纯化

经HPLC检测如果底物转化良好，用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后在旋转蒸发仪上蒸干，然后加入100%甲醇溶液，过孔径为0.45微米的有机膜后用制备柱在HPLC上进行分离制备，用干净三角瓶收集代谢产物3′-DM-4′-DH-AG。

实施例3

菌株AUH-JLD49s的分离培养方法同实施例1，菌株AUH-JLD49s在3′-去甲基-牛蒡苷元转化中的应用包括下述步骤：

（1）菌株AUH-JLD49s的培养

将–80℃低温保存的人肠道分离菌株AUH-JLD49s冻融后，按18%体积比的接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，在厌氧工作站内37℃下培养24小时后试管中菌液呈均匀混浊。再以13%体积比的接种量将试管中已长混浊的菌株AUH-JLD49s重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基的玻璃试管中，继续在厌氧工作站内培养20小时作为种子液。

（2）底物3′-去甲基-牛蒡苷元粗品与菌株AUH-JLD49s共培养

在厌氧工作站内将上述事先培养好的菌株AUH-JLD49s的种子液按12%体积比的接种量转接到盛有液体培养基的三角瓶内培养，同时加入3′-去甲基-牛蒡苷元的浓度为200毫摩尔/升的3′-去甲基-牛蒡苷元粗品，使得培养基中底物浓度为0.6毫摩尔/升，在厌氧工作站内培养2天，菌株AUH-JLD49s可将底物3′-DMAG转化为3′-DM-4′-DH-AG。

（3）用HPLC检测底物3′-去甲基-牛蒡苷元被菌株AUH-JLD49s的转化情况

从上述三角瓶中取出培养物100微升至1.5毫升EP管中，加1000微升乙酸乙酯进行萃取，静置离心后取出上层乙酸乙酯800微升，在离心浓缩仪中蒸干后加入800微升100%甲醇溶液，经HPLC检测底物转化情况。

（4）转化产物的分离纯化

经HPLC检测如果底物转化良好，用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后在旋转蒸发仪上蒸干，然后加入100%甲醇溶液，过孔径为0.45微米的有机膜后用制备柱在HPLC上进行分离制备，用干净三角瓶收集代谢产物3′-DM-4′-DH-AG。

对制备的代谢产物3′-DM-4′-DH-AG进行结构鉴定，鉴定方法及鉴定结果如下：

将收集的转化产物峰蒸干后，在分析型高效液相色谱仪上测定其纯度，再分别测定代谢产物的紫外吸收谱、质谱、核磁共振氢谱和碳谱。结果表明，该转化产物分别在228纳米和278纳米处有最大紫外吸收（见附图2），质谱测定结果表明，该代谢产物分子量为342（见附图3），这恰好与3′-DM-4′-DH-AG分子式C₂₀H₂₂O₅相吻合。根据产物的紫外吸收图谱和分子量可将其初步鉴定为3′-DM-4′-DH-AG。为进一步准确解析该代谢产物的化学结构，我们分别测定了纯化后代谢产物的核磁共振氢谱（¹H-NMR）和碳谱（¹³C-NMR）。通过谱图解析，并与文献报道中的3′-DM-4′-DH-AG的核磁共振氢谱和碳谱进行对比分析（Chemical>andPharmaceutical>,2003, 51(4):378-384），最终将该代谢产物准确鉴定为3′-DM-4′-DH-AG。代谢产物的¹H-NMR和¹³C-NMR结果如下：

¹H>3,>δ>a-7′′),>b-7′′),>J=13.90,>a-7′),>J=13.90,>b-7′),>3),>3),>J=9.18,>a-4),>J=8.70,>b-4),>J=2.18>J=7.99,>J=2.18>J=7.99>J=7.72>

¹³C>3,>δ>

分析菌株AUH-JLD49s对底物3′-去甲基-牛蒡苷元粗品转化动态和转化能力，以及产物3′-去甲基-4′-去羟基-牛蒡苷元对人结肠癌细胞株HCT116和人乳腺癌细胞株MDA-MB-231的抑制作用：

1、菌株AUH-JLD49s对底物3′-去甲基-牛蒡苷元的转化动态

为了解菌株AUH-JLD49s转化底物3′-去甲基-牛蒡苷元的速度，以便确定最佳转化时间，我们对菌株AUH-JLD49s转化底物3′-去甲基-牛蒡苷元的转化动态进行了测定，具体方法如下：

将事先培养好的种子液（培养方法同上所述）按10%体积比的接种量接种到盛有100毫升液体培养基的250毫升三角瓶内培养，同时加入3′-去甲基-牛蒡苷元的浓度为150毫摩尔/升的3′-去甲基-牛蒡苷元粗品0.4毫升，在厌氧工作站内培养0小时、3小时、6小时、9小时、12小时、15小时、18小时、21小时、24小时后分别取培养物100微升，用1000微升的乙酸乙酯萃取，取萃取液800微升，萃取液蒸干后加入100微升100%甲醇溶液，并用HPLC检测底物被转化情况，根据不同培养时间底物和产物浓度绘制菌株转化动态（见图4），由图4可知，底物加入12小时后即有84.7%左右产物3′-DM-4′-DH-AG被生成，继续培养15小时后，所加入的底物牛蒡苷元有96.8%被转化为3′-DM-4′-DH-AG，第24小时产物量基本不再上升。

2、菌株AUH-JLD49s对不同浓度底物3′-去甲基-牛蒡苷元转化能力测定

将菌株AUH-JLD49s分别与不同浓度的3′-去甲基-牛蒡苷元在厌氧工作站内共同培养3天，然后用等体积乙酸乙酯对培养物进行萃取，萃取液蒸干后加入100%甲醇溶液，并用HPLC检测底物3′-去甲基-牛蒡苷元粗品被转化情况。结果表明，当底物3′-去甲基-牛蒡苷元浓度为不超过1.0毫摩尔/升时，菌株AUH-JLD49s对不同浓度的底物3′-去甲基-牛蒡苷元平均转化率（转化率=产物浓度/（剩余底物浓度+产物浓度）×100%）均为90%以上，如菌株AUH-JLD49s对浓度分别为0.4毫摩尔/升、0.6毫摩尔/升、0.8毫摩尔/升和1.0毫摩尔/升的平均转化率分别为97.4%、93.3%、90.3%和90.0%；当底物浓度增至1.2毫摩尔/升时，菌株AUH-JLD49s对底物毫摩尔/升的转化效率有所降低，平均转化率为84.7%；而当所加入的底物浓度为1.6毫摩尔/升时，菌株AUH-JLD49s对底物毫摩尔/升转化能力急剧下降，平均转化率仅为18.0%（见附图5）。

3、产物3′-去甲基-4′-去羟基-牛蒡苷元对人结肠癌细胞株HCT116和人乳腺癌细胞株MDA-MB-231的抑制率

取对数生长期的各肿瘤细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，然后用RPMI-1640培养基制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁴个/毫升，将细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔100微升，待细胞贴壁后各组分别加入50微摩尔/升、100微摩尔/升、200微摩尔/升的3′-去甲基-4′-去羟基-牛蒡苷元和空白培养液及阳性对照剂，各设3个复孔。将培养板置于CO₂培养箱中，37℃培养24小时后向各培养孔加入MTT>