3'-去甲基-牛蒡苷元转化菌株的分离筛选、转化特性及转化产物活性研究

摘要

牛蒡苷(arctiin)及牛蒡苷元(arctigenin)是从菊科两年生草本植物牛蒡(Arctium lappaL.)的干燥成熟果实牛蒡子中提取分离的木脂素类化合物，具有抗炎、抗肿瘤、降血糖等多种药理作用。被摄入体内的牛蒡苷元可被小鼠或人肠道菌群通过去甲基、去羟基作用转化为去甲基牛蒡苷元、肠二醇、肠内酯等各种不同代谢产物。现有研究结果表明，牛蒡苷元的微生物转化产物具有比牛蒡苷元更高更广的生物学活性。
　　2013年本实验室国内外首次从人肠道菌群中分离得到一株在严格厌氧条件下，能将底物牛蒡苷或牛蒡苷元高效转化为3'-去甲基-牛劳苷元（3'-desmethylarctigenin，简称3'-DMAG）的布劳特氏菌属菌株Blautia sp.AUH-JLD56(KF374935)。本研究是在此基础上，以3'-DMAG为底物，从人肠道菌群中进一步分离筛选对3'-DMAG有转化功能的细菌菌株。通过高效液相检测，分离得到一株对底物3'-DMAG有转化功能的严格厌氧细菌菌株AUH-JLD49s，通过16S rDNA序列分析，菌株AUH-JLD49s与爱格氏菌属菌株Eggerthella sp.AUH-Julong365(JN874873)的相似性最高，相似性高达99.8％。爱格氏菌属菌株AUH-Julong365是本实验室2013年报道的一株能在厌氧条件下将底物黄豆苷原转化为雌马酚的细菌菌株。当分别提取这两株细菌菌株的基因组DNA，进行随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，简称RAPD)分析时发现，使用S400随机引物时，菌株AUH-JLD49s与菌株AUH-Julong365的RAPD谱带相同，而使用S424和S495随机引物时，两菌株的RAPD谱带则完全不同，该结果表明，菌株AUH-JLD49s与菌株AUH-Julong365在基因组DNA上存在明显不同。因此，通过16S rDNA序列分析，结合菌株形态学和生理生化特性观察结果，最终将菌株AUH-JLD49s鉴定为爱格氏菌属菌株，即Eggerthella sp.AUH-JLD49s。目前已将菌株AUH-JLD49s的16S rDNA序列上交NCBI核苷酸库，得到该菌株的注册号KX650621。
　　经对产物的质谱(ESI-MS)及核磁共振氢谱(1H NMR)和碳谱(13C NMR)测定分析，最终将菌株AUH-JLD49s转化3'-DMAG后生成的产物鉴定为3'-去甲基-4'-去羟基-牛蒡苷元（3'-desmethyl-4'-dehydroxyarctigenin，简称DMDH-AG）。通过对产物DMDH-AG的手征性研究发现，产物DMDH-AG能够使偏振光向左发生偏转，表明产物DMDH-AG为左旋性化合物。通过测定旋光度发现，产物DMDH-AG在100％甲醇中的旋光度为-58.2°(c=0.79×10-3，MeOH)。值得一提的是，目前产物DMDH-AG尚不能进行人工化学合成，通过本研究分离得到的能将底物3'-DMAG转化为单一产物DMDH-AG的细菌菌株AUH-JLD49s为国内外首次发现。
　　经转化动态研究发现，底物与菌株AUH-JLD49s共培养3h后即开始有产物DMDH-AG被合成，随着培养时间延长，产物DMDH-AG的生成量也不断增加，培养15h后产物DMDH-AG的生成量达到最大，培养基中的产物DMDH-AG的浓度为0.31mmol/L，菌株AUH-JLD49s对底物3'-DMAG的平均转化率为96.8％。通过菌株最大转化能力测定发现，当底物3'-DMAG浓度为不超过1.0mmol/L时，菌株AUH-JLD49s对不同浓度的底物3'-DMAG平均转化率（转化率=产物浓度/（剩余底物浓度+产物浓度）×100％）均在90％以上，如菌株AUH-JLD49s对浓度分别为0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L和1.0mmol/L的底物3'-DMAG的平均转化率分别为97.4％、93.3％、90.3％和90.0％;当底物浓度增至1.2mmol/L时，菌株AUH-JLD49s对底物3'-DMAG的转化效率有所降低，平均转化率为84.7％;而当所加入的底物浓度升高至1.6mmol/L时，菌株AUH-JLD49s对底物转化能力急剧下降，平均转化率仅为18.0％，因此菌株AUH-JLD49s的最大转化浓度为1.2mmol/L。
　　此外，本研究还对产物DMDH-AG的体外抗氧化活性、抑菌活性和抑制癌细胞增殖能力分别进行测定分析。研究结果表明，检测浓度在0.025mmol/L到0.1mmol/L范围内时，产物DMDH-AG对二苯代苦味酰基自由基(DPPH)的体外清除能力极显著低于底物3'-DMAG(p＜0.01)，表明牛蒡苷元结构中位于C-4'位的羟基对维持化合物的高抗氧化活性非常关键;通过体外抑菌试验发现，高浓度的产物DMDH-AG(5mmol/L)对金黄色葡萄球菌、甲型副伤寒沙门氏菌和大肠杆菌这三种致病菌均无任何抑制作用，提示产物DMDH-AG可能不具有明显的细胞毒性;通过体外抗癌试验发现，产物DMDH-AG在一定浓度下对人结肠癌细胞株HCT116和人乳腺癌细胞株MDA-MB-231的生长均具有明显的抑制作用，浓度为200μmol/L的DMDH-AG对癌细胞株HCT116和MDA-MB-231的抑制率分别为54.3％和45.7％。
　　最后，本研究对分离得到的严格厌氧爱格氏菌属菌株AUH-JLD49s进行了涮氧驯化和有氧转化尝试，对相关耐氧机制进行了初步探讨。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1 牛蒡子主要活性成分及功能

1．1．1 牛蒡子成分组成

1．1．2 牛蒡子生理功能

1．2 牛蒡昔及牛蒡苷元的微生物转化国内外研究现状

1．2．1 哺乳动物肠道菌群对牛蒡苷或牛蒡苷元的转化研究

1．2．2 牛蒡苷元转化菌株国内外研究分离现状

1．3 研究意义

第二章 3’-去甲基-牛蒡苷元转化菌株的分离筛选与鉴定

2．1 材料

2．1．1 底物制备

2．1．2 样品来源

2．1．3 培养基

2．1．4 药品与试剂

2．1．5 主要试验仪器与设备

2．2 试验方法

2．2．5 转化菌株AUH-JLD49s的16S rDNA序列测定

2．3 结果与分析

2．3．2 转化菌株AUH-JLD49s的菌落及菌体形态观察

2．3．3 转化菌株AUH-JLD49s生理生化特性及耐氧特性测定

2．3．4 转化菌株AUH-JLD49s的16S rDNA序列分析

2．4 小结

第三章 菌株AUH-JLD49s对3’-去甲基-牛蒡苷元的转化研究

3．1 材料

3．1．1 菌株

3．1．2 培养基

3．1．3 药品与试剂

3．1．4 主要仪器与设备

3．2 试验方法

3．2．1 高效液相色谱条件

3．2．2 代谢产物分离纯化与结构鉴定

3．2．3 代谢产物的旋光性分析

3．3．1 底物3’-去甲基-牛蒡苷元的高效液相色谱检测

3．3．2 代谢产物的结构鉴定

3．3．3 底物3’-去甲基-牛蒡苷元及其代谢产物旋光性

3．3．4 菌株AUH-JLD49s对底物3’-去甲基-牛蒡苷元的转化动态

3．3．5 菌株AUH-JLD49s对底物3’-去甲基-牛蒡苷元转化能力测定

3．4 小结

第四章 产物3’-去甲基-4’-去羟基-牛蒡苷元的活性研究

4．1 材料

4．1．1 药品与试剂

4．1．2 主要试验仪器与设备

4．2 试验方法

4．2．1 DPPH体外自由基清除能力测定

4．2．3 产物对结肠癌细胞HCT116和乳腺癌细胞MDA-MB-231的抑制率

4．3 结果与分析

4．3．2 底物3’-去甲基-牛蒡苷元及其代谢产物的抑菌检测

4．4 小结

第五章 3’-去甲基-牛蒡苷元转化菌的耐氧驯化及耐氧机制初探

5．1 试验材料

5．1．1 菌株来源

5．1．2 试验培养基与试剂

5．1．3 试验设备与仪器

5．2 试验方法

5．2．4 耐氧突变菌株Aeroto-AUH-JLD49s的有氧转化特性

5．3．1 耐氧驯化前后菌体形态及生长特性比较

5．3．2 耐氧突变菌株Aeroto-AUH-JLD49s耐氧条件分析

5．3．4 耐氧突变菌株Aeroto-AUH-JLD49s的耐氧机制初探

5．4 小结

全文讨论

结论

创新点

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢