抑制血小板衍生生长因子基因表达的三链形成寡核苷酸及其应用

摘要

本发明提供了一类用于抑制PDGF－B基因(c－sis原癌基因)表达的五种三链形成寡核苷酸。通过凝胶阻滞实验、DNasel印迹、体外转录抑制、核蛋白结合抑制实验、瞬时表达抑制实验和稳定转染抑制实验证明了这些化合物可与靶位点(PDGF－B基因5’上游启动子核心区)形成稳定的三链复合物,并可抑制其下游基因的转录和转录因子的结合。它们可应用于制备治疗肿瘤发生和生长、动脉粥样硬化和炎症反应等有关疾病的药物。

说明书

本发明涉及寡核苷酸及其在基因治疗中的应用

血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)是一种强有力的有丝分裂原和化学趋化剂，其主要的靶细胞是中胚层来源的平滑肌细胞、成纤维细胞和神经胶质细胞等。它是由A、B两种同源肽链(60％的同源性)经二硫键相连的30KD的二聚体，其B链基因与猴肉瘤病毒的癌基因v-sis有92％的同源性，因此PDGF-B基因又称为c-sis原癌基因。作为一种多功能的信号分子，PDGF在肿瘤发生和生长、动脉粥样硬化和炎症反应等病理状态中扮演着极其重要的角色。自八十年代以来，人们一直在孜孜不倦地探究新的PDGF的拮抗剂以用于临床治疗。PDGF的特异性抗体和可溶性PDGF受体是目前比较有效和专一的拮抗剂，但其制备困难，价格昂贵。其它的PDGF拮抗剂，例如苏拉明(suramin)、新霉素(neomycin)和一些由PDGF衍生的肽均已有报道，然而这些物质不是毒性太大就是专一性和药力不够理想。另一类可能用于临床的拮抗剂是tyrphostins，它们可以选择性抑制PDGF受体的酪氨酸激酶活性。近年来，随着基因治疗这一领域的不断扩展，寡核苷酸药物越来越引起人们的广泛注意，按其特异性作用位点，目前的寡核苷酸药物可分为三类：(1)三链形成寡核苷酸(triplex-forming oligonucleotides，TFO)(作用于DNA)；(2)反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides)和核酶(ribozyme)(作用于mRNA)；(3)Aptamers(作用于蛋白质)。其中，三链形成寡核苷酸可以a．结合于基因的启动子区，抑制靶基因的转录，b．结合于基因内部，阻止转录延伸，或通过激发突变、同源重组来破坏靶基因；反义寡核苷酸和核酶可以破坏特定的mRNA或抑制其翻译；Aptamers可干扰或选择性激活特定的蛋白质。目前，反义寡核苷酸和核酶技术已经比较成熟，已有部分进入Ⅰ期临床应用。1994年Nitta et al．(Neurosurgery，34：309，1994)利用针对PDGF-B／c-sis基因的反义寡核苷酸处理神经胶质瘤细胞，得到很好的抑制癌细胞生长的效果；同年，Thambi et al．(Mo1．Pharmacol．，46：437，1994)发现锤头状Ribozyme可在人间皮瘤细胞中切割PDGF-B mRNA而抑制瘤细胞的繁殖。

50年代后期，Felsenfeld在研究核酸同聚物时，最早发现了RNA-DNA杂交三链U：AT(U代表PolyU，A代表PolyA，T代表PolyT)，后来全DNA三链很快被发现，即T：AT和C+：GC(C+是指质子化的PolyC，G代表PolyG)。1968年，Morgan发现E．Coli中RNA聚合酶的体外转录可被第三条RNA链所抑制。由于当时尚无成熟的寡核苷酸合成技术，因此对三链的研究仅限于核酸同聚物。直到80年代末期，Moser利用合成的寡核苷酸证明，一段均聚嘌呤：均聚嘧啶的DNA双链可以与第三条特定组成的寡核苷酸链结合成分子间三链，此第三条寡核苷酸链被称为三链形成寡核苷酸。电泳、化学探针、亲和切割、酶切、远经外光谱分析、X-射线晶体衍射和NMR等多种手段的研究表明，任何一段均聚嘌呤：均聚嘧啶组成的双链分子(长度不小于10bp)，都可以与TFO结合成三链。TFO的组成可以是一段均聚嘧啶也可以是一段均聚嘌呤，不同组成的TFO以不同的方式结合到靶双链上：(1)平行方式。均聚嘧啶组成的TFO(CT TFO)占据靶双链的大沟，靠Hoogsteen氢键结合于靶双链中的嘌呤链，并与之有相同的5’到3’方向。(2)反平行方式。均聚嘌呤组成的TFO(GA TFO)占据靶双链的大沟，靠Reverse Hoogsteen氢键结合于靶双链中的嘌呤链，并与之有相反的5’到3’方向。自此，作为一种新兴的“抗基因”技术，三链技术已被用于抑制诸如HIV、c-myc、bcl-2等有害基因的表达，但用三链技术来抑制PDGF-B基因的表达尚未见报道。

本发明的目的是提供一类抑制血小板衍生生长因子基因表达的三链形成寡核苷酸，可在转录水平上抑制PDGF-B基因的表达，它们可应用于制备治疗肿瘤发生和生长、动脉粥样硬化和炎症反应等有关疾病的药物。

本发明提供一类抑制血小板衍生生长因子基因表达的三链形成寡聚脱氧核苷酸，并通过凝胶阻滞实验、DNaseⅠ印迹、体外转录抑制、核蛋白结合抑制实验、瞬时表达抑制实验和稳定转染抑制实验的结果证明了它们可与血小板衍生生长因子B链基因的5’端上游启动子核心区形成稳定的三链复合物，并可抑制其下游基因的转录及转录因子的结合。它们可应用于制备治疗肿瘤发生和生长、动脉粥样硬化和炎症反应等有关疾病的药物。

(一)TFO的设计

首先，针对人的PDGF-B基因(c-sis原癌基因)的5’上游启动子区核心(Jin，et al．，J．Biol．Chem．，269：28648，1994)设计均聚嘌呤组成的TFO1～5。

PDGF-B基因(c-sis原癌基因)5’上游启动子(-252～+3)的序列如下：

5’CCATGGTCACTGTGCTGAGGGGCGGGACGGTGGGTCACCCCTAGTTCTTTTTTCCCCAGGGCCAGATTCATGGACTGAAGGGTTGCTCGGCTCTCAGAGACCCCCTAAGCGCCCCGCCCTGGCCCCAAGCCCTCCCCCAGCTCCCGCGTCCCCCCCCTCCTGGCGCTGACTCCGGGCCAGAAGAGGAAAGGCTGTCTCCACCCACCTCTCGCACTCTCCCTCTCCTTTATAAAGGCCGGAACAGCTGAAAGGGT3’

其中黑体部分为转录因子结合的核心区SPE。该SPE序列在整个255bp的启动子中占据着极为重要的地位，它的缺失将引起整个启动子的失活，而使PDGF-B基因无法表达。由于该SPE核心区的80％为嘧啶碱基，因此可考虑利用现有的三链技术，设计出针对于SPE区的三链形成寡核苷酸TFO，通过与SPE区形成三链来干扰转录因子的结合，从而达到抑制PDGF-B基因(c-sis原癌基因)表达的目的。但是，由于SPE区中间夹杂了四个嘌呤，并不是完全严格意义上的均聚嘧啶，因此又针对于SPE下游的一段均聚嘧啶区(下划线部分)设计了TFO1与之完全配对；TFO2～TFO4与部分SPE区和全部的嘧啶区配对；TFO5与全长的SPE区和嘧啶区配对。序列如下：靶基因：5’TCTCC ACCCA CCTCT CGCAC TCTCC CTTCT CCTTT3’

                 SPE              嘧啶区TFO1(16nt)                       5’G AGAGG GAAGA GGAAA 3’TFO2(25nt)             5’GGAGA GCGTG AGAGG GAAGA GGAAA 3’TFO3(25nt)             5’GGAGA GCGAG AGAGG GAAGA GGAAA 3’TFO4(25nt)             5’GGAGA GGGAG AGAGG GAAGA GGAAA 3’TFO5(35nt) 5’AGAGG AGGGA GGAGA GGGAG AGAGG GAAGA GGAAA 3’

TFO1～5均是嘌呤组成，它们以反平行的方式结合到靶双链上。TFO1虽然未参入SPE区内生成三链，但可以通过与SPE区下游生成三链来干扰SPE区的构象而影响其与转录因子的结合；TFO2～4有部分参入SPE区形成三链；而TFO5则全部地参入SPE区并同时与其下游嘧啶区形成三链。TFO1～5五种寡核苷酸均在Beckman-Pligo1000 DNA合成仪上，用磷酰胺三酯固相法合成，并经过聚丙烯酰胺变性凝胶纯化。

(二)三链形成的检测

采用凝胶阻滞实验、DNaseⅠ印迹法来检测TFO与PDGF-B基因启动子核心区的三链形成情况。

凝胶阻滞法的基本原理是：当TFO与相应的靶双链DNA片段结合成三链复合物后，使原来靶双链DNA分子的分子量及电荷发生改变，因而在聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中其电泳迁移率发生改变，通常比游离的靶双链DNA片段的泳动速率慢得多，在放射自显影X光胶片上形成一较游离靶双链DNA片段滞后的带型，此方法可以非常灵敏地检测到三链DNA的形成。

寡核苷酸A与B退火双链AB即为PDGF-B基因启动子核心中的3’端嘧啶区。即下图中斜体部分。

C，5’TCTCC ACCCA CCTCT CGCAC TCTCC CTTCT CCTTT3’

                                     A

D，3’AGAGG TGGGT GGAGA GCGTG AGAGG GAAGA GGAAA5’

                                     B

TFO1是据此设计的可与之结合成反平行三链的寡核苷酸。由图1可见，第l道为同位素标记的寡核苷酸AB退火的靶双链对照；第2～9道分别为浓度递增的TFO1(0．1μmol／l、0．19μmol／l、0．38μmol／l、0．75μmol／l、1．5μmol／l、3μmol／l、6μmol／l、12μmol／l)与等体积1μmol／l AB退火双链形成的三链混合物。由图可见，随着TFO1浓度的增高，靶双链最终全部与TFO1结合成三链。另以PDGF-B基因启动子核心区(同时含有SPE区和嘧啶区)的寡核苷酸C、D退火双链为靶双链，同上用同位素标记，加入相同浓度的TFO1～TFO5与之结合，如图2所示，第1道为寡核苷酸CD退火双链对照(有上下两条带，为不同构象)；第2～6道分别为TFO1～5各12μmol／1与1μmol／l CD退火双链1μl形成的三链混合物。由图2可知，TFO1使靶双链完全漂移，即全部生成三链复合物。相比较而言，最易形成三链的是TFO1，其次是TFO5，再其次是TFO4，而TFO2和TFO3使靶双链漂移较少，这是由于序列不同的原因，由此可见三链形成的序列特异性。

DNaseⅠ印迹的基本原理是：首先将靶双链DNA片段中的一条单链的一端选择性地进行末端标记，然后在Mn²⁺存在下加入适当浓度的DNaseⅠ，使在DNA链上随机形成缺口，经变性后电泳分离，放射自显影，即可形成以相差一个核苷酸为梯度的DNA条带。当靶双链DNA与其对应的TFO结合成三链后，TFO可保护相应的DNA顺序不受DNaseⅠ的攻击，因而在放射自显影图谱上，DNA梯度条带在对应于三链形成的区域中断，从而形成一空白区域，因而称为DNaseⅠ印迹法。

选用TFO4为代表来验证三链形成。合成的寡核苷酸(编号为C和D)的退火双链(35bp左右)即c-sis／PDGF-B基因启动子核心两端加上SacⅠ和SmaⅠ限制性酶切位点，克隆至puc18中得到的pucSPE18(见图3)用PvuⅡ和HindⅢ酶切处理后，得到了包含PDGF-B基因启动子核心在内的260bp左右的PvuⅡ-HindⅢ片段，Klenow酶选择性标记其中一条链，DNaseⅠ在Mn²⁺存在下可在双链DNA分子底物上随机切一刀。当TFO4结合到靶双链中的SPE区时，三链便不能被DNaseⅠ所识别，因此在放射白显影胶片上在三链形成区域出现“足迹”。如图4所示，第1道是未加TFO对照，第2，3道分别为浓度递增的TFO4掺入，在TFO4终浓度低至5μmol／l时，就有明显的“足迹”出现，充分证明了TFO4与靶双链之间的三链形成以及三链形成的序列特异性。

(三)三链功能的检测

在确证本发明所设计的TFO可以与PDGF-B基因启动子核心形成三链之后，又进行体外转录抑制和核蛋白结合抑制实验，进一步从功能上证明三链形成的可行性和实用性。

将上述PDGF-B基因启动子核心区寡核苷酸双链克隆至pT718质粒的T7启动子下方，得到的pT7SPE18(见图5)用BglⅠ限制性酶切线性化，作为T7RNA聚合酶的转录模板，但当启动子核心区域分别与TFO1～5结合成三链后，会阻碍转录的延伸。为减少实验误差，在转录体系中加入了空载体pT718的线性模板，作为内参。当TFO与pT7SPE18线性化转录模板结合成三链而阻止了转录的进行时，空载体pT718的线性模板的转录作用会加强，这样通过比较pT7SPE18和pT718的转录物量的比例就可以看出TFO的结合对下游基因转录的抑制情况。如图6所示，第1道为对照，即经BglⅠ酶切线性化后pT7SPE18和pT718的体外转录产物(分别用甲，乙表示)；第2～6道分别为线性化后pT7SPE18和pT718与TFO1，TFO1～5结合成三链后的体外转录产物。设对照中pT7SPE18和pT718的转录物量的比例为100％，经计算得到，加入TFO1～5后，pT7SPE18和pT718的转录物量的比例分别为72．7％、72．1％、62．4％、45．5％和72．1％。这表明，在TFO与pT7SPE18结合成三链后阻碍了转录的延伸，从而以空载体pT718为模板的转录作用加强，同时也反映了TFO的作用专一性。

由于TFO设计的目的是与PDGF-B基因启动子核心区结合成三链而阻碍转录因子的结合来抑制下游PDGF-B基因的表达，因此又作了核蛋白结合抑制实验来检测TFO对转录因子结合的抑制情况。

凝胶阻滞法检测TFO干扰核蛋白因子与^*PROMOTER结合的基本原理是：当DNA结合蛋白(核蛋白因子)与相应的DNA片段(^*PROMOTER)结合而形成DNA-蛋白质复合物后，使DNA分子的分子量及电荷发生改变，因而在聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中其电泳迁移率发生改变，通常比游离的DNA片段的泳动速率慢得多，在放射自显影X光胶片上形成一较游离DNA片段滞后的带型。但当DNA片段上的蛋白结合位点被TFO占据而形成三链后便不能再与DNA结合蛋白结合，便不能出现较游离DNA片段滞后的带型。

首先人工合成了PDGF-B基因上游255bp(-252～+3)启动子，由于DNA合成仪合成长度大于100Nt的核苷酸的产率较低，因此采取分段合成后再退火连接的方法，通过PCR(聚合酶链式反应)(见图7)，扩增出足量的PDGF-B基因5’上游启动子(-252～+3)片段，再克隆至puc18质粒的SacⅠ和SmaⅠ酶切位点之间，这样构建的质粒命名为puc18PDGFpromoter(图8)。用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切下启动子片段并用同位素标记，记作^*PROMOTER，与PMA(佛波酯)处理过的人K562细胞(慢性髓原白血病细胞)核蛋白抽提物作结合实验。由于K562细胞在PMA处理后高表达PDGF-B基因，因此其核蛋白抽提物中含有与PDGF-B表达有关的转录因子，可以与^*PROMOTER结合，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上转录因子^*PROMOTER复合物比游离的^*PROMOTER迁移得慢。如图9所示，第1道为游离的新鲜热变性的^*PROMOTER探针，第2道为新鲜热变性的^*PROMOTER探针与核蛋白结合，第3道为新鲜热变性的^*PROMOTER探针与20倍量的非放射性的PROMOTER探针混合后再与核蛋白结合。由图9可见，第2道有清晰的蛋白结合条带，而相应的游离探针(第1道)和含有非放竞争性探针结合(第3道)的均未出现蛋白结合条带，说明这种DNA与蛋白质的结合是序列特异性的。第4道为三链形成条件下的游离^*PROMOTER探针，第5道为三链形成条件下的^*PROMOTER探针与核蛋白结合，结果第5道同第2道一样出现蛋白结合条带，而对照第4道未出现。第6～8道、第9～0道、第12～14道分别为TFO1(1μmol／l、10μmol／l、100μmol／l)、TFO4(1μmol／l、10μmol／l、100μmol／l)、TFO5(1μmol／l、10μmol／l、100μmol／l)与^*PROMOTER探针的三链混合物与核蛋白的结合。由图可见，随着TFO浓度的递增，^*PROMOTER探针与核蛋白的结合逐渐减弱，尤其是TFO4和TFO5，在100μmol／l高浓度时，几乎完全占据了^*PROMOTER探针与蛋白的结合位点，使之不能与相应的蛋白因子结合。由于与^*PROMOTER探针结合的蛋白因子已被证明是Sp家族的转录因子(Yuxin Liang，et al．，Oncogene，13：863，1996)，因此，实验结果证明，本发明所设计的TFO可以干扰PDGF-B基因启动子核心区与转录因子的结合。

(四)三链形成寡核苷酸抑制肿瘤细胞c-sis／PDGF-B的基因表达。

选择人慢性髓原白血病K562细胞做为模型细胞。该细胞在药物PMA的作用下可高效表达c-sis／PDGF-B基因。

(1)瞬时表达抑制实验。构建载体ⅠpGLpromoter，即将c-sis／PDGF-B基因的启动子区(255bp)克隆至荧火虫荧光素酶报告基因的上游。载体Ⅰ电转至K562细胞中，在PMA作用下，c-sis／PDGF-B基因的启动子发挥效力使其下游的荧火虫荧光素酶报告基因在细胞内获得瞬时表达。荧光素酶活力的高低反映了表达水平的高低，即c-sis／PDGF-B基因的启动子的活力。预先将TFO与载体Ⅰ形成三链后再将该三链混合物电转至K562细胞中，其荧光素酶活力大大低于对照空载体。如图10看到，TFO1，4，5分别使荧光素酶活力降低了56．2％，85．3％和76．3％，即TFO1，4，5对c-sis／PDGF-B基因的启动子的抑制率达到了56．2％，85．3％和76．3％。

(2)稳定转染抑制实验。构建载体ⅡneorpGLpromoter，在载体Ⅰ的基础上克隆入新霉素抗性基因(neor)，使其获得了稳定整合至真核细胞染色体内的筛选信号。载体Ⅱ电转入细胞后，稳定整合至染色体的细胞株因获得了新霉素的抗性而可在G418选择培养基上生长，这样筛选出的单克隆细胞株携带c-sis／PDGF-B基因启动子控制下的荧光素酶报告基因，在PMA诱导下，可高效表达荧光素酶基因。用含有一定浓度的TFO的培养基培养一定时间后，检测荧光素酶活力发现，TFO1，4，5分别使酶活力下降了50．7％，65．8％，84％(见图11)。进一步证明本发明所设计的TFO可在肿瘤细胞水平上有效地抑制c-sis／PDGF-B基因的启动子的转录活力。

综合上述，凝胶阻滞实验、DNaseⅠ印迹、体外转录抑制、核蛋白结合抑制实验、瞬时表达抑制和稳定转染抑制实验的结果均证明了本发明所设计的TFO可与靶位点(PDGF-B基因5’上游启动子核心区)形成稳定的三链复合物，并可抑制其下游基因的转录、转录因子的结合及启动子的转录活力。它们可应用于配制治疗肿瘤发生和生长、动脉粥样硬化和炎症反应等有关疾病的药物。该药物具有价格便宜，专一性好，稳定性高等优点。

本发明优点

随着基因治疗领域的不断扩展，寡核苷酸越来越成为一种极具吸引力的药物，它具有以下几个得天独厚的优点：(1)可由机器自动、快速、大批量合成，价格便宜；(2)，专一性好，可以识别特异的核酸序列；(3)具有特定性质的寡核苷酸可由体外“定向进化”系统筛选得来；(4)修饰碱基、骨架成分及活性化学基团可以掺入到寡核苷酸中，以提高稳定性、结合力和药效。因此，越来越多科学家们正致力于各种寡核苷酸药物的开发。本发明所设计的TFO可以特异性与PDGF-B基因的启动子核心区结合成稳定的三链，并可抑制下游基因的转录以及转录因子的结合。它们可应用于制备治疗肿瘤发生和生长、动脉粥样硬化和炎症反应等有关疾病的药物。与反义寡核苷酸和核酶技术相比，新兴的三链技术则更具其自身独特的优点，即，TFO是在转录的水平上直接作用于基因本身，因此，只需很少量的TFO分子就可以达到调控靶基因表达的目的，而反义寡核苷酸和核酶则需要大大过量的分子来结合或切割相应的mRNA。

附图说明：

图1，凝胶阻滞电泳图谱(以c-sis／PDGF-B基因的5’上游启动子核心的嘧啶区为靶双链)

第1道，寡核苷酸AB退火双链对照；

第2～9道，0．1μmol／l、0．19μmol／l、0．38μmol／l、0．75μmol／l、1．5μmol／l、3μmol／l、6μmol／l、12μmol／l TFO1各2．5μl与等体积lμmol／l AB退火双链形成的三链混合物。

图2，凝胶阻滞电泳图谱(以c-sis／PDGF-B基因的5’上游启动子核心为靶双链)

第1道，寡核苷酸CD退火双链对照；

第2～6道，TFO1，TFO2，TFO3，TFO4，TFO5各12μmol／l与1μmol／lCD退火双链1μl形成的三链混合物。

图3，pucSPE18质粒图谱。黑体部分是c-sis／PDGF-B基因启动子核心，序列为：

3’CCC TTTCCTCTTCCCTCTCACGCTCTCCACCCACCTCT C 5’ (C)

5’GGG AAAGGAGAAGGGAGAGTGCGAGAGGTGGGTGGAGA GAGCT3’ (D)

左右两端划线处分别为SmaⅠ和SacⅠ酶切位点。

图4，DNaseⅠ印迹图谱

第1道，pucSPE18用PvuⅡ和HindⅢ酶切处理后的含c-sis／PDGF-B基因启动子核心在内的PvuⅡ-HindⅢ片段30nmol／l，经DNaseⅠ酶切图；

第2，3道，10和20μmol／l TFO4与PvuⅡ-HindⅢ片段的三链DNaseⅠ酶切图。

图5，pT7SPE18质粒图谱。黑体部分是c-sis／PDGF-B基因启动子核心，序列为：

3’CCC TTTCCTCTTCCCTCTCACGCTCTCCACCCACCTCT C 5’   (C)

5’GGG AAAGGAGAAGGGAGAGTGCGAGAGGTGGGTGGAGA GAGCT3’ (D)

左右两端划线处分别为SmaⅠ和SacⅠ酶切位点。

图6，三链抑制T7RNA聚合酶体外转录图谱

第1道，对照，经BglⅠ酶切线性化后pT7SPE18和pT718的体外转录产物(分别用A，B表示)；

第2～6道，线性化后pT7SPE18和pT718与TFO1，TFO2，TFO3，TFO4，TFO5的三链的体外转录产物。

图7，PDGF-B基因5’上游启动子(-252～+3)的合成和PCR体外扩增示意图

A、B、C、D、E、F、引物1、引物2序列如下：A：5’CCCATG GTCAC TGTGC TGAGG GGCGG GACGG TGGGT

CACCC CTAGT TCTTT TTTCC CCAGG GCCAG ATTCA TGGAC

TGAAG GGTTG3’；B：5’C CTTCA GTCCA TGAAT CTGGC CCTGG GGAAA AAAGA ACTAG   GGGTG ACCCA CCGTC CCGCC CCTCA GCACA GTGAC CATGG GAGCT 3’；C：5’CTCGG CTCTC AGAGA CCCCC TAAGC GCCCC GCCCT GGCCC   CAAGC CCTCC CCCAG CTCCC GCGTC CCCCC CCTCC TGGCG   CTGAC 3’；D：5’G CGCCA GGAGG GGGGG GACGC GGGAG CTGGG GGAGG   GCTTG GGGCC AGGGC GGGGC GCTTA GGGGG TCTCT GAGAG   CCGAG CAAC 3’；E：5’TCCGG GCCAG AAGAG GAAAG GCTGT CTCCA CCCAC CTCTC   GCACT CTCCC TTCTC CTTTA TAAAG GCCGG AACAG CTGAA   AGGGT CCC 3’；F：5’GGG ACCCT TTCAG CTGTT CCGGC CTTTA TAAAG GAGAA   GGGAG AGTGC GAGAG GTGGG TGGAG ACAGC CTTTC CTCTT   CTGGC CCGGA GTCA 3’；

引物1：5’ATTCG AGCTC CCATG GTCAC TGTGC 3’；

引物2：3’TTGTC GACTT TCCCA GGG CC CCTAG 5’

图8，puc18PDGFpromoter质粒图谱。黑体部分是PDGF-B基因5’上游启动子(-252～+3)，序列为：

5’CCATGGTCACTGTGCTGAGGGGCGGGACGGTGGGTCACCCCTAGTTCTTTTTT   CCCCAGGGCCAGATTCATGGACTGAAGGGTTGCTCGGCTCTCAGAGACCCCC   TAAGCGCCCCGCCCTGGCCCCAAGCCCTCCCCCAGCTCCCGCGTCCCCCCCC   TCCTGGCGCTGACTCCGGGCCAGAAGAGGAAAGGCTGTCTCCACCCACCTCT   CGCACTCTCCCTTCTCCTTTATAAAGGCCGGAACAGCTGAAAGGGT3’

图9，TFO干扰核蛋白因子与PDGF-B基因启动子结合的凝胶电泳图谱

第1道，游离的新鲜热变性的^*PROMOTER探针；

第2道，新鲜热变性的^*PROMOTER探针与核蛋白结合；

第3道，新鲜热变性的^*PROMOTER探针与20倍量的非放射性的PROMOTER探针的混合物与核蛋白结合；

第4道，三链形成条件下的游离^*PROMOTER探针；

第5道，三链形成条件下的^*PROMOTER探针与核蛋白结合；

第6～8道、第9～10道、第12～14道，TFO1(1μmol／l、10μmol／l、100μmol／l)、TFO4(1μmol／l、10μmol／l、100μmol／l)、TFO5(1μmol／l、10μmol／l、100μmol／l)与^*PROMOTER探针的三链混合物与核蛋白的结合。

^*PROMOTER浓度为0．1μmol／l。核蛋白浓度2μg／μl。

图10，荧光素酶瞬时表达抑制实验的酶活测定，纵坐标相对荧光素酶活力，即来自于pGL3promoter的荧火虫荧光素酶活力相对于来自pRLSV40的Renilla荧光素酶的比例。

图11，荧光素酶稳定转染抑制实验的酶活测定，纵坐标相对荧光素酶活力，即设未加TFO的K562对照细胞及稳定转染的K562细胞荧光素酶活力为100％。

本发明通过以下实施例来具体说明。

实施例1 TFO及相应靶双链的合成

一 ，合成下列寡核苷酸：  TFO1， 5’G AGAGG GAAGA GGAAA 3’    TFO2， 5’GGAGA GCGTG AGAGG GAAGA GGAAA 3’    TFO3， 5’GGAGA GCGAG AGAGG GAAGA GGAAA 3’    TFO4， 5’GGAGA GGGAG AGAGG GAAGA GGAAA 3’    TFO5， 5’AGAGG AGGGA GGAGA GGGAG AGAGG GAAGA GGAAA 3’    编号A，5’CTC TCC CTTCTC CTT T3’    编号B，5’AAA GGA GAA GGG AGA G3’    编号C，5’CTCTCC ACCCA CCTCT CGCAC TCTCC CTTCT CCTTT CCC 3’    编号D，5’GGG AAAGG AGAAG GGAGA GTGCG AGAGG TGGGT GGAGA GAGCT3 

其中，编号A、B退火双链为PDGF-B基因的5’上游启动子核心的嘧啶区；编号C、D退火双链为PDGF-B基因的5’上游启动子核心两端各加上SacⅠ和SmaⅠ酶切位点。

以上寡核苷酸均在Beckman-Olig01000 DNA合成仪上，用磷酰胺三酯固相法，用0．2μmole dT固相柱(Glen Research产品)，以0．2μmole合成程序合成。

二，寡核苷酸的纯化

用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法纯化。

1，合成柱注入3ml浓氨水，放置10分钟，抽出浓氨水，装入可密封的小瓶，盖紧瓶口，55℃保温过夜。

2，吸出瓶中液体，真空浓缩至干，重新溶于100μl 50％甲酰胺(0．05％二甲苯青，0．05％溴酚蓝)

3，7mol／l尿素-15～20％聚丙酰胺凝胶电泳。

4，回收：在增感屏上割下紫外照射下的黑色目的条带，用核酸浸泡液(0．1％SDS，0．5mol／l乙酸胺，10mmol／l乙酸镁)浸泡，测A₂₆₀，计算产物量，乙醇沉淀两次，吹干，-20℃保存。

实施例2凝胶阻滞电泳实验

所用的缓冲液：

TE(pH 8．0)：10mmol／l Tris．Cl(pH 8．0)；lmmol／l EDTA(pH 8．0)

10×T4 Polynucleotide kinase缓冲液：700mmol／l Tris-HCl(pH 7．6)，100mmol／l MgCl₂，50mmol／l DTT

Asb：20mmol／l二甲砷酸盐缓冲液(pH 7．4)；10mmol／l MgCl₂

TBM：89mmol／l Tris-硼酸；20mmol／l MgCl₂

一，以c-sis／PDGF-B基因的5’上游启动子核心的嘧啶区为靶双链

1，合成的寡核苷酸(编号A，5’CTC TCC CTT CTC CTT T3’；编号B，5’AAA GGA GAA GGG AGA G3’)各1OD，分别溶于100μl TE。取1μlA进行5’γ-P标记。    寡核苷酸A        1μl    10×kinase缓冲液 1μl    γ-p³²ATP       1μl(10μCi，3000Ci／mmol／lol)    T4kinase         1μl(2U)    H₂O          6μl

37℃ 30分钟，加入2μl寡核苷酸B，100℃ 3分钟，退火，15％非变性胶回收退火双链。

2，双链沉淀一次，溶于20μl Asb，终浓度为～1μmol／l。

3，合成的寡核苷酸(TFO1，5’G AGA GGG AAG AGG AAA3’)5OD，溶于100μl Asb，按一系列稀释度用Asb进行稀释。终浓度分别为0．1μmol／l、0．19μmol／l、0．38μmol／l、0．75μmol／l、1．5μmol／l、3μmol／l、6μmol／l、12μmol／l，各取2．5μl，100℃ 3分钟，骤冷至0℃，立即与等体积的标记双链混合，65℃ 10分钟，室温2小时，4℃过夜。15％非变性聚丙烯酰胺凝胶4℃，75V电泳4小时。抽干，-70℃放射自显影。

15％非变性聚丙烯酰胺凝胶：参见分子克隆(金冬雁，黎孟枫等译，第二版，1996)。将TBE换成TBM。

结果(见图1)：

寡核苷酸A与B退火双链AB即为PDGF-B基因启动子核心中的3’端嘧啶区。即下图中斜体部分。

5’TCTCC ACCCA CCTCT CGCAC TCTCC CTTCT CCTTT 3’

                      SPE

3’AGAGG TGGGT GGAGA GCGTG AGAGG GAAGA GGAAA 5’

TFO1是据此设计的可与之结合成反平行三链的寡核苷酸。凝胶阻滞实验结果表明，同位素标记的靶双链可全部与TFO1结合，生成迁移率相对较低的三链复合物。从图1上可看出，当TFO1的浓度为0．38μmol／l时，同位素标记的靶双链有一半参与了三链形成，因而TFO1与靶双链AB的表观结合常数Km为0．38μmol／l。

二，以PDGF-B基因的5’上游启动子核心为靶双链

1，合成的寡核苷酸(编号C 5’C TCTCC ACCCA CCTCT CGCACTCTCC CTTCT CCTTT CCC 3’；编号D 5’GGG AAAGG AGAAGGGAGA GTGCG AGAGG TGGGT GGAGA GAGCT3’)各2OD，分别溶于40μl TE。取1μl D进行5’γ-P标记。

寡核苷酸D        1μl

10×kinase缓冲液 1μl

7-p³²ATP        1μl(10μCi，3000Ci／mmol／lol)

T₄kinase        1μl(2U)

H₂O           6μl

37℃ 30分钟，加入1μl寡核苷酸C，100℃ 3分钟，退火，15％非变性胶回收退火双链。

2，双链沉淀一次，溶于20μl Asb，终浓度为～1μmol／l。

3，合成的寡核苷酸(TFO1，5’G AGAGG GAAGA GGAAA3’；TFO2，5’GGAGA GCGTG AGAGG GAAGA GGAAA 3’； TFO3， 5’GGAGAGCGAG AGAGG GAAGA GGAAA 3’； TFO4， 5’GGAGA GGGAG AGAGGGAAGA GGAAA 3’； TFO5，5’AGAGG AGGGA GGAGA GGGAG AGAGGGAAGA GGAAA3’)5OD，分别用Asb，稀释至终浓度为12μmol／l，各取5μl，100℃ 3分钟，骤冷至0℃，立即与1μl步骤2中标记的双链混和，65℃ 10分钟，室温2小时，4℃过夜。12％非变性胶4℃，75V电泳4小时。抽干，-70℃放射白显影。

结果(见图2)：

寡核苷酸C与D退火双链C-D即为PDGF-B基因启动子核心区(两端加上SacⅠ和SmaⅠ酶切位点)。TFO1～TFO5在等浓度下与之结合的情况如图2所示：TFO1使靶双链完全漂移，即全部生成三链复合物。相比较而言，最易形成三链的是TFO1，其次是TFO5，再其次是TFO4，而TFO2和TFO3使靶双链漂移较少。

实施例3 DNaseⅠ印迹法的检测实验

所用的缓冲液：

TE(pH 8．0)：10mmol／l Tris．Cl(pH 8．0)；1mmol／l EDTA (pH 8．0)

10×Klenow酶缓冲液：500mmol／1 Tris-HCl(pH 7．2)，10mmol／l MgSO₄，1mmol／l DTT

Asb：20mmol／l二甲砷酸盐缓冲液(pH 7．4)；10mmol／l MgCl₂

甲酰胺上样缓冲液：98％甲酰胺，10mmol／l EDTA(pH 8．0)，0．1％二甲苯青，0．1％溴酚蓝

1，质粒pucSPE18的构建(图3)

合成的寡核苷酸(编号C 5’C TCTCC ACCCA CCTCT CGCACTCTCC CTTCT CCTTT CCC 3’；编号D 5’GGG AAAGG AGAAGGGAGA GTGCG AGAGG TGGGT GGAGA GAGCT3’)各1OD，分别溶于100μlTE。退火，克隆至puc18质粒(购自华美生物工程公司)的SmaⅠ和SacⅠ酶切位点之间，所得的质粒命名为pucSPE18。

2，合成的寡核苷酸(TFO4，5’GGAGA GGGAG AGAGG GAAGAGGAAA 3’)用Asb分别稀释到10、20μmol／l。

3，pucSPE18用PvuⅡ和HindⅢ双酶切，1％低熔点胶回收含有C-D的PvuⅡ-HindⅢ片段。

4，Klenow酶标记

PvuⅡ-HindⅢ片段       3pmol

10×Klenow酶缓冲液     1μl

Klenow酶               1μl(5U)

α-p³²ATP             1μl(10μCi，3000Ci／mmol／lol)

H₂O                 7μl

室温15分钟，补加1μl 2mmol／l dNTP，继续室温5分钟，90℃ 3分钟使酶失活。乙醇沉淀。溶于TE至终浓度为30nmol／l。

5，DNaseⅠ印迹

a，标记的PvuⅡ-HindⅢ片段分别与一系列稀释度的TFO2各4μl等体积混和，65℃ 10分钟，室温2小时，4℃过夜。(FFO2：5-80μmol／l，PvuⅡ-HindⅢ片段30nmol／l)；

b，8μl三链混合物中，加入0．9μl 10×(10mmol／l Tris．Cl，5mmol／lMnCl2)，5μl(0．1U／μl)DNaseⅠ，室温40秒，立即加入14μl甲酰胺上样缓冲液，90℃ 3分钟，9％变性胶上样。

DNaseⅠ5U稀释至50μl，用(20mmol／l NaCl，2mmol／l MgCl₂，2mmol／lMnCl₂)稀释。

结果(见图3、图4)：

合成的寡核苷酸(编号为C和D)的退火双链(35bp左右)即c-sis／PDGF-B基因启动子核心两端加上SacⅠ和SmaⅠ限制性酶切位点，克隆至puc18中得到的pucSPE18(见图3)用PvuⅡ和HindⅢ酶切处理后，得到了包含PDGF-B基因启动子核心在内的260bp左右的PvuⅡ-HindⅢ片段，Klenow酶选择性标记其中一条链，DNaseⅠ在Mn²⁺存在下可在双链DNA分子底物上随机切一刀。当TFO4结合到靶双链中的SPE区时，三链便不能被DNaseⅠ所识别，因此在放射自显影胶片上在三链形成区域出现“足迹”。如图4所示，最左边是未加TFO对照，向右依次是浓度递增的TFO4掺入，在TFO4终浓度低至5μmol／l时，就有明显的“足迹”出现，充分证明了TFO4可以与靶双链形成稳定的三链。

实施例4 T7RNA聚合酶体外转录的抑制实验

所用的缓冲液：

TE(pH 8．0)：10mmol／l Tris．Cl(pH 8．0)；1mmol／l EDTA(pH 8．0)

5×转录缓冲液：200mmol／l Tris-HCl(pH 7．9)，30mmol／l MgCl₂，10mmol／lspermidine，50mmol／l NaCl．

Asb：20mmol／l二甲砷酸盐缓冲液(pH 7．4)；10mmol／l MgCl₂

甲酰胺上样缓冲液：98％甲酰胺，10mmol／l EDTA(pH 8．0)，0．1％二甲苯青，0．1％溴酚蓝

1，质粒pT7SPE18的构建(图5)

合成的寡核苷酸(编号1093 5’C TCTCC ACCCA CCTCT CGCACTCTCC CTTCT CCTTT CCC 3’；编号1094 5’GGG AAAGG AGAAGGGAGA GTGCG AGAGG TGGGT GGAGA GAGCT3’)各1OD，分别溶于100μl TE。退火，克隆至pT718质粒(购白GibcoBRL公司)中(用SmaⅠ和SacⅠ双酶切)，所得的质粒命名为pT7SPE18。

2，合成寡核苷酸(TFO1，5’G AGAGG GAAGA GGAAA3’；TFO2，5’GGAGA GCGTG AGAGG GAAGA GGAAA 3’； TFO3， 5’GGAGAGCGAG AGAGG GAAGA GGAAA 3’； TFO4， 5’GGAGA GGGAG AGAGGGAAGA GGAAA 3’； TFO5， 5’AGAGG AGGGA GGAGA GGGAG AGAGGGAAGA GGAAA3’)各用Asb溶解至终浓度为100μmol／l。

3，体外转录

(一)，模板制备

a)BglⅠ酶切pT718和pT7SPE18使之完全线性化；

b)蛋白酶K处理；

在上述酶切液中加入1／10体积的10×蛋白酶K缓冲液(500mmol／l NaCl，50mmol／l EDTA(pH 8．0)，100mmol／l Tris．Cl(pH 8．0))，1／10体积5％SDS，终浓度为100μg／ml的蛋白酶K，37℃温育1小时，酚：氯仿抽提及乙醇沉淀。

c)处理后的线性pT718和pT7SPE18模板混和溶于TE至终浓度分别为0．5 μg／μl。先分别与TFO1～TFO5各1μl等体积混合，65℃ 10分钟，室温2小时，4℃过夜。对照组用1μl Asb代替TFO。

(二)，转录反应

模板(TFO1～5分别与线性pT718、pT7SPE18混合物)2μl

5×转录缓冲液    2μl

NTP(20 mmol／l)  0．25μl

RNasin(50U／μl) 0．5μl

T7RNA聚合酶      0．5μl(5U)

α-p32ATP        0．25 μl(10μCi，3000Ci／mmol／lol)

H₂O           3．5μl

30℃ 30分钟，加入等体积的甲酰胺上样缓冲液，100℃ 3分钟，迅速冰浴，6％变性胶上样5μl。抽干，放射自显影。扫描转录物的黑度以定量。

结果(见图5、图6)：

合成的寡核苷酸(编号为C和D)的退火双链(35bp左右)即PDGF-B基因启动子核心两端加上SacⅠ和SmaⅠ限制性酶切位点，克隆至pT718的T7启动子下方，得到的pT7SPE18(见图5)用BglⅠ限制性酶切使之线性化后，可作为T7RNA聚合酶的转录模板，但当启动子核心区域分别与TFO1～3结合成三链后，会阻碍转录的延伸。为减少实验误差，在转录体系中加入了空载体pT718的线性模板，作为内参。设对照中pT7SPE18和pT718的转录物量的比例为100％，经计算得到，加入TFO1～5后，pT7SPE18和pT718的转录物量的比例分别为72．7％、72．1％、62．4％、45．5％和72．1％(见图6)。这表明，在TFO与pT7SPE18结合成三链后阻碍了转录的延伸，从而以空载体pT718为模板的转录作用加强，同时也反映了TFO的作用专一性。

实施例5TFO干扰蛋白因子与启动子核心区的结合实验

所用的缓冲液：

PBS：NaCl 8g；KCl 0．2g；Na₂HPO₄ 1．15g；KH₂PO₄ 0．2g，定容至1000ml．缓冲液A：10mmol／l HEPES(pH 7．9，4℃)；1．5mmol／l MgCl₂；10mmol／lKCl；0．5mmol／l DTT

缓冲液C：20mmol／l HEPES(pH 7．9)；25％V／V甘油；0．42mol／l NaCl；1．5mmol／l MgCl₂；0．2mmol／l EDTA；0．5mmol／l PMSF；0．5mmol／l DTT

缓冲液D：20mmol／l HEPES(pH 7．9)；20％V／V甘油；0．1mol／l KCl；0．2mmol／l EDTA；0．5mmol／l PMSF；0．5mmol／l DTT

缓冲液E：2×缓冲液D与等体积的甘油混合。

TE(pH 8．0)：10mmol／l Tris．Cl(pH 8．0)；1mmol／l EDTA(pH 8．0)

Asb：20mmol／l二甲砷酸盐缓冲液(pH 7．4)；10mmol／l MgCl₂

10×T4 Polynucleotide kinase缓冲液：700mmol／l Tris-HCl(pH 7．6)；100mmol／l MgCl₂；50mmol／l DTT

10×PCR缓冲液：100mmol／l Tris．HCl；pH8．8at 25℃；500mmol／l KCl；0．8％NP40

10×Klenow酶缓冲液：500mmol／l Tris-HCl(pH 7．2)，10mmol／l MgSO₄，lmmol／l DTT

5×Binding缓冲液：100mmol／l Tris．HCl(pH8．0)；25mmol／l MgCl₂；25mmol／l CaCl₂；0．5mmol／l EDTA；0．5mmol／l DTT；250μg／ml BSA：500mmol／l KCl；15％甘油

TBE：90mmol／l Tris-硼酸；2mmol／l EDTA

(一)细胞核蛋白抽提

1，细胞培养K562细胞(慢性髓原白血病细胞，购白上海实生细胞公司)，培养于5％CO₂，37℃，RPMI-1640培养基中加入10％小牛血清；

2，4-6×10⁵K562细胞／毫升，室温2000rpm，10分钟；

3，细胞重悬于5倍体积的4℃的PBS，同1离心；

4，细胞悬于5倍体积缓冲液A，10分钟，离心收获细胞；

5，悬于2倍体积(第一次用缓冲液A洗之前的体积)缓冲液A，然后用匀浆器匀浆；

6，匀浆液2000rpm，10分钟，弃上清；

7，沉淀第二次高速离心，25000g，20分钟，去上清；

8，沉淀每10⁹细胞悬于3ml缓冲液C，匀浆器匀浆；

9，匀浆液对50体积的缓冲液D透析5hr；

10，透析液25000g，20分钟；

11，上清即为核蛋白抽提物，继续对缓冲液E透析，得到的是已含50％甘油的核蛋白。

(二)PDGF-B基因5’上游启动子(-252～+3)的克隆

l，合成寡核苷酸(编号A：5’C CCATG GTCAC TGTGC TGAGGGGCGG GACGG TGGGT CACCC CTAGT TCTTT TTTCC CCAGGGCCAG ATTCA TGGAC TGAAG GGTTG 3’； B： 5’C CTTCA GTCCATGAAT CTGGC CCTGG GGAAA AAAGA ACTAG GGGTG ACCCACCGTC CCGCC CCTCA GCACA GTGAC CATGG GAGCT 3’； C：5’CTCGG CTCTC AGAGA CCCCC TAAGC GCCCC GCCCT GGCCCCAAGC CCTCC CCCAG CTCCC GCGTC CCCCC CCTCC TGGCGCTGAC 3’； D：5’G CGCCA GGAGG GGGGG GACGC GGGAG CTGGGGGAGG GCTTG GGGCC AGGGC GGGGC GCTTA GGGGG TCTCTGAGAG CCGAG CAAC 3’；E：5’TCCGG GCCAG AAGAG GAAAGGCTGT CTCCA CCCAC CTCTC GCACT CTCCC TTCTC CTTTATAAAG GCCGG AACAG CTGAA AGGGT CCC 3’；F：5’GGG ACCCTTTCAG CTGTT CCGGC CTTTA TAAAG GAGAA GGGAG AGTGCGAGAG GTGGG TGGAG ACAGC CTTTC CTCTT CTGGC CCGGAGTCA 3’；引物1：5’ATTCG AGCTC CCATG GTCAC TGTGC3’(SacⅠ)；引物2：3’TTGTC GACTT TCCCA GGGCC CCTAG5’(SmaⅠ))

2，合成的寡核苷酸A、B、C、D、E、F，T4激酶使之磷酸化。

寡核苷酸(A-F)100pmol 20μl

10×kinase缓冲液     10μl

ATP(10mmol／l)       0．5μl

T₄kinase1μl(7．5U)

H₂O      69μl

37℃ 30分钟，68℃ 10分钟，1／2体积无水乙醇沉淀回收。溶于TE缓冲液，测A₂₆₀，定量。

3，取A-F各7．5μl(约80pmol)两两退火(AB、CD、EF)，混合，45℃ 5分钟，冰浴。

4，连接反应

AB、CD、EF(各15μl)  45μl

10×T4连接酶缓冲液   6μl

ATP(10mmol／l)       3μl

T₄DNA连接酶         6μl(6U)

16℃连接过夜。

5，PCR克隆

10×PCR缓冲液10μl(100mmol／l Tris．HCl．pH8．8 at 25℃；500mmol／lKCl；0．8％NP40)

dNTP(10mmol／l)     2μl

MgCl₂(25mmol／l)  6μl

引物1               1μl(100pmol)

引物2               1μl(100pmol)

步骤4中连接液       1μl

Taq酶               0．5μl(2U)

H₂O              79μl

94℃ 30s；72℃ 1∶30s；53℃ 1∶30s，30 cycle。回收260bp左右片段，克隆至puc18(购自华美生物工程公司)的SacⅠ，SmaⅠ位点间。这样构建的质粒命名为puc18PDGFpromoter。

(三)³²P标记的^*PROMOTER探针制备

1，puc18PDGFpromoter质粒24μg，用EcoRⅠ SmaⅠ酶切，2％低熔点胶回收PDGFpromoter片段，乙醇沉淀，抽干。

2，向管中加入

10×Klenow酶缓冲液：2μl

H₂O              15μl

Klenow酶            1μl

α-P³² dATP        2μl

室温15分钟，补加1μl 2mmol／l dNTP，继续反应5分钟，加入80μlH₂O，50μl 7．5mol／l NH₄Ac，300μl无水乙醇沉淀，抽干，溶于50μlTE，至终浓度为0．1μmol／l。

(四)凝胶阻滞法检测TFO干扰核蛋白因子与^*PROMOTER结合

1，合成寡核苷酸(TFO1，5’G AGAGG GAAGA GGAAA3’；TFO4，5’GGAGA GGGAG AGAGG GAAGA GGAAA  3’；TFO5，5’AGAGGAGGGA GGAGA GGGAG AGAGG GAAGA GGAAA3’)各用Asb溶解至终浓度为100μmol／l。

2，³²P标记的^*PROMOTER探针(3×10⁶cpm／pmol)与相应的TFO(100^-1，10^-1，1稀释度)各1．5μl，预先65℃10分钟，室温2hr，4℃过夜。

3，核蛋白抽提物3μl(6μg)预先与Poly(dI-dC)1μl(1μg／μl)、5×Binding缓冲液2μl和H₂O 1μl室温10分钟，³²p标记的^*PROMOTER探针与相应的一系列稀释度的TFO混合物及非放的竞争性PROMOTER探针然后加入，继续室温10分钟。

4，电泳：5％非变性聚丙烯酰胺胶，0．25×TBE，4℃ 200V电泳至溴酚兰到底。

抽干，放射自显影。

结果(见图7、图8、图9)：

由于DNA合成仪合成长度大于100Nt的核苷酸的产率较低，因此采取分段合成后再退火连接的方法(见图7)，通过PCR(聚合酶链式反应)，扩增出足量的PDGF-B基因5’上游启动子(-252～+3)片段，再克隆至puc18质粒的SacⅠ和SmaⅠ酶切位点之间，这样构建的质粒命名为puc18PDGFpromoter(图8)。用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切该质粒得到的含PDGF名为^*PROMOTER。选用K562细胞作为研究对象，因为K562细胞经PMA(佛波酯)处理后可高表达PDGF-B基因。通过抽提经PMA处理后的K562细胞核蛋白，与同位素标记的^*PROMOTER探针作凝胶阻滞电泳，结果见图9。第1道为游离的新鲜热变性的^*PROMOTER探针，第2道为新鲜热变性的^*PROMOTER探针与核蛋白结合，第3道为新鲜热变性的^*PROMOTER探针与20倍量的非放射性的PROMOTER探针混合后再与核蛋白结合。由图可见，第2道有清晰的蛋白结合条带，而相应的游离探针(第1道)和含有非放竞争性探针结合(第3道)的均未出现蛋白结合条带，说明这种DNA与蛋白质的结合是序列特异性的。第4道为三链形成条件下的游离^*PROMOTER探针，第5道为三链形成条件下的^*PROMOTER探针与核蛋白结合，结果第5道同第2道一样出现蛋白结合条带，而对照第4道未出现。第6～8道、第9～10道、第12～14道分别为TFOl(1μmol／l、10μmol／l、100μmol／l)、TFO4(1μmol／l、10μmol／l、100μmol／l)、TFO5(1μmol／l、10μmol／l、100μmol／l)与^*PROMOTER探针的三链混合物与核蛋白的结合。由图可见，随着TFO浓度的递增，^*PROMOTER探针与核蛋白的结合逐渐减弱，尤其是TFO4和TFO5，在100μmol／l高浓度时，几乎完全占据了^*PROMOTER探针与蛋白的结合位点，使之不能与相应的蛋白因子结合。由于与^*PROMOTER探针结合的蛋白因子已被证明是Sp家族的转录因子(Yuxin Liang，et al．，Oncogene，13：863，1996)，因此，本实施例结果证明，本发明所设计的TFO可以干扰PDGF-B基因启动子核心区与转录因子的结合。

实施例6 TFO抑制肿瘤细胞c-sis／PDGF-B基因表达实验

所用的缓冲液：

PBS：NaCl 8g；KCl 0．2g；Na₂HPO₄1．15g；KH₂PO₄ 0．2g，定容至1000ml。

Asb：20mmol／l二甲砷酸盐缓冲液(pH 7．4)；10mmol／l MgCl₂

细胞裂解液，底物Ⅰ及底物Ⅱ：均来自Promega公司荧光素酶分析试剂盒。

(一)瞬时表达抑制实验

载体ⅠpGL3promoter的构建：实施例5中PDGF-B基因5’上游启动子(-252～+3)从puc18PDGFpromoter亚克隆至pGL3basic荧光素酶表达载体(Promega公司)的SacⅠ和HindⅢ之间。

1，TFO与载体Ⅰ的三链形成

合成的寡核苷酸(TFO1，5’G AGAGG GAAGA GGAAA3’；TFO4，5’GGAGA GGGAG AGAGG GAAGA GGAAA 3’：TFO5，5’AGAGGAGGGA GGAGA GGGAG AGAGG GAAGA GGAAA3’)5OD，分别用Asb，稀释至终浓度为60μmol／l，各取5μl，100℃ 3分钟，骤冷至0℃，立即与5μl pGL3promoter(5μg／μl)混和，65℃ 10分钟，室温2小时，4℃过夜。

2，电转

对数生长期的K562细胞计数，离心，收获，重悬于RPMI1640培养基(不含血清)至细胞浓度为1．25×10⁷／ml。500μl K562细胞与1中三链混合物以及0．5ng pRLSV40质粒(Promega)于冰上混合，Bio-Rad基因电转仪电转，参数分别为300V，975μF。立即重悬于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基于37℃，5％CO₂，通气培养。

3，荧光素酶测活

电转24小时后，将细胞均分两半，一半用2ng／mlPMA处理，24小时后收获。冰PBS洗3次。加入500μl裂解液，室温放置1小时，取30μl细胞裂解液与30μl底物Ⅰ混匀，立即放入荧光计数计(Lumat LB9507，EG@G BERTHOLD)计数，计数时间定为10秒，该数值为pGL3promoter来源的荧火虫荧光素酶的活力。再加入30μl底物Ⅱ，同上计数，该数值为内参照质粒pRLSV40来源的Renilla荧光素酶活力，二者的比例为相对荧光素酶活力。

(二)稳定转染抑制实验

载体Ⅱneo^rpGLpromoter构建：质粒pCatneor(本组保存)用KpnⅠ和SacⅠ酶切下neo^r片段，亚克隆至载体ⅠpGLpromoter中。

载体neo^rpGL3control构建：质粒pCatneo^r(本组保存)用KpnⅠ和SacⅠ酶切下neo^r片段，亚克隆至载体ⅠpGL3control中。20μg载体Ⅱneo^rpGLpromoter或neo^rpGL3control分别与1．25×10⁷／mlK562细胞500μl冰上混合，同上做电转。电转48小时后向培养基中加入G418至终浓度为0．5mg／ml。培养2周后，新霉素抗性的单克隆分别命名为稳定转染K562细胞和K562对照细胞。移至96孔板用含有0．01，0．1，1，10，100μmol／l的TFO1，4，5的培养基加入2ng／mlPMA培养72小时后，收获细胞，冰PBS洗3次。加入500μl裂解液，室温放置1小时，取30μl细胞裂解液与30μl底物Ⅰ混匀，立即放入荧光计数计(Lumat LB9507，EG@G BERTHOLD)计数，计数时间定为10秒，该数值为pGL3promoter来源的荧火虫荧光素酶的活力。

结果(见图10、图11)：

人慢性髓原K562白血病细胞在PMA诱导下可高表达c-sis／PDGFB基因，为了检测方便，本发明利用荧光素酶报告基因系统，即将c-sis／PDGFB基因启动子克隆到荧光素酶报告基因上游，使后者的表达完全依赖于前者的活力。当TFO与c-sis／PDGFB基因启动子结合成三链后，阻碍了相关的转录因子结合，使该启动子失活，因而荧光素酶报告基因的表达量降低，表现在酶活的降低，因此可以很方便地从荧光素酶的酶活力高低来检测c-sis／PDGFB基因启动子的活力。当质粒载体Ⅰ电转入K562细胞内部，48小时内荧光素酶可得到瞬时表达。同时电转pRLSV40质粒作为内参照，该质粒自带强启动子及Renilla荧光素酶，图10所示的相对荧光素酶活力均为来自于pGL3promoter的荧火虫荧光素酶活力相对于来自pRLSV40的Renilla荧光素酶的比例。第1道为电转的pGL3basic质粒(Promega)对照，该质粒的荧光素酶报告基因上游无任何启动子，因此电转后无活力。证明其它道中酶活力完全来自于c-sis／PDGFB基因启动子。第2道为未加TFO的载体Ⅰ对照。第3，4，5道分别为TFO1，4，5先与载体Ⅰ形成三链后再电转后测的酶活。由图10可见，酶活分别降低了56．2％，85．3％和76．3％，即TFO1，4，5对c-sis／PDGF-B基因的启动子的抑制率达到了56．2％，85．3％和76．3％。载体Ⅰ虽在48小时内有瞬时表达，但之后随着细胞的传代分裂，质粒会逐渐丢失。因此，又构建了载体Ⅱ，携带新霉素抗性基因neo^r，在药物G418筛选下，得到载体Ⅱ稳定整合至细胞染色体内部的细胞株。这种细胞株在PMA处理下可高表达荧光素酶基因，可方便地用来检测c-sis／PDGFB基因启动子的活力。在细胞培养基中加入100μmol／l TFO1，4，5，培养72小时后，发现其细胞荧光素酶活力下降了50．7％，65．8％，84％(见图11)。进一步证明本发明所设计的TFO可在肿瘤细胞水平上有效地抑制c-sis／PDGF-B基因的启动子的转录活力，TFO对荧光素酶活力的影响有浓度依赖性，即随着TFO浓度的增加，荧光素酶活力逐渐下降(数据未全列出)，图11为100μmol／l TFO时的酶活数据。K562对照细胞为稳定转染了neo^rpGL3control质粒，该质粒自身携带CMV强启动子控制下的荧火虫荧光素酶报告基因。CMV强启动子不含有本发明所设计的TFO的靶序列，因而TFO不会影响它控制下的荧光素酶活力，图11也证明，在100μmol／l TFO作用下，其荧光素酶活力未受影响。