一种从赭色小莫勒菌中提取三萜类物质泽渥萜的方法

摘要

本发明公开了一种从赭色小莫勒菌中提取三萜类物质泽渥萜的方法。包括菌株活化，初级培养，次级培养，发酵液抽滤，菌丝体冷浸提取，旋蒸浸泡液，加水溶解，有机溶剂摇瓶萃取得粗提物，粗提物经硅胶柱层析纯化，收集洗脱液，旋蒸浓缩，氯仿溶解，放在4℃冰箱里挥干，得泽渥萜晶体。本发明原料取材简单；设备简单，容易操作，成本低；制得的化合物纯度高。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从赭色小莫勒菌中提取三萜类物质泽渥萜的方法。

背景技术

    赭色小莫勒菌（Moelleriella ochracea）隶属于子囊菌门、粪菌纲、肉座菌目、麦角菌科、莫勒菌属。莫勒菌，是粉虱的重要病原真菌，在生物防治方面取得了显著效果，其代谢产物也呈现较好的抗菌、杀疟原虫活性，并对昆虫和肿瘤细胞有较强的毒性。人们已从其代谢产物中分离、纯化出一些有活性的物质，如泽渥萜，其分子式C₃₀H₅₂O₂，分子量444，是三萜类五元碳环物质，具有抗结核杆菌的作用，IC₅₀=12.5μg/ml。可见，莫勒菌在医学上具有潜在的应用价值。若要大规模生产应用，首先要考虑目标物的提取方法、提取量优化。

发明内容

本发明的目的是公开一种从赭色小莫勒菌中提取三萜类物质泽渥萜的方法，以促进其在医学领域的开发和应用。

本发明采取的技术方案如下： 

一种从赭色小莫勒菌中提取三萜类物质泽渥萜的方法，包括以下步骤：

1) 赭色小莫勒菌活化后，取菌块接种到PDB培养基中，在100~160r/min、24~28℃条件下连续培养7~10天即初级培养，按8％~10％接种量再次转接到PDB培养基中，在24℃~28℃条件下静止培养35~40天即次级培养；

2) 菌液与菌丝体过滤分离，菌丝体在3℃～15℃、有机溶剂中浸泡48～100小时，过滤得浸泡液，旋蒸温度控制在35℃～40℃得浸膏，回收有机溶剂；

加水溶解浸膏，水：浸膏重量比＝50:1～100:1，将水溶物倒入分液漏斗中，加入1～2倍的乙酸乙酯进行摇瓶萃取，摇瓶转速150r/min～280r/min，摇20～60min静止150min,旋蒸乙酸乙酯部分浓缩得粗提物，回收乙酸乙酯；

3）1倍粗提物体积的乙酸乙酯溶解粗提物，上200-300目硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯体积比60:1开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比30:1～10:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得提取物A；

4）1倍粗提物体积的乙酸乙酯溶解提取物A，上200-300目硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯体积比30:1开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比15:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得浸膏，氯仿溶解，放在4℃冰箱里挥干，得晶体状物质即泽渥萜。

其中，所述步骤1)中PDB培养基为：4g马铃薯粉，20g葡萄糖，沸水煮30min，经4层纱布过滤后加单蒸水定容至1L。

所述步骤2)中有机溶剂可以选丙酮、乙醇、甲醇。

本发明的显著优点：

1）            原料取材简单；

2）            设备简单，容易操作，成本低；

3）            制得的化合物纯度高。

附图说明

图1 ：提取的泽渥萜在硅胶板上纯度验证图

图2 ：提取的泽渥萜¹H NMR谱

图3 ：提取的泽渥萜¹³C NMR谱

图4 ：泽渥萜的化学结构。

具体实施方式

以下是本发明的几个具体实施例，进一步说明本发明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

1) 赭色小莫勒菌（邱君志等，赭色小莫勒菌在中国的发现. 菌物学报，2009.28(1): 148-150）活化后，取菌块接种到PDB培养基（4g马铃薯粉，20g葡萄糖，沸水煮30min，经4层纱布过滤后加单蒸水定容至1L）中，在150 r/min、25℃条件下连续培养8 d即初级培养，按9％接种量再次转接到PDB培养基中，在25℃条件下静止培养38 d即次级培养；

2) 菌液与菌丝体过滤分离，菌丝体在4℃、乙醇中浸泡70小时，过滤得浸泡液，旋蒸温度控制在38℃得浸膏，回收乙醇。加水溶解浸膏，水：浸膏重量比＝70:1，将水溶物倒入分液漏斗中，加入1.5倍的乙酸乙酯进行摇瓶萃取，摇瓶转速200 r/min，摇40 min静止150 min,旋蒸乙酸乙酯部分浓缩得粗提物，回收乙酸乙酯；

3）1倍粗提物体积的乙酸乙酯溶解粗提物，上200-300目硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯体积比60:1开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比25:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得提取物A；

4）1倍粗提物体积的乙酸乙酯溶解提取物A，上200-300目硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯体积比30:1开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比15:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得浸膏，氯仿溶解，放在4℃冰箱里挥干，得晶体状物质即泽渥萜。

5）提取物的纯度验证：如图1所示，展开剂为甲醇：二氯甲烷体积比=1:20，R_f=0.43，可以确定得到的泽渥萜纯度为99%。

6）提取物的结构验证：从图2（¹H NMR₃)可以看到，δ1.208(3H，s)，1.183(3H，s)，1.159(3H，s)，1.043(3H，s)，1.016(3H，s)，0.978(3H，s)，0.870(3H，s)，0.764(3H，s)提示有8个连在季碳上的角甲基，推测其为三萜类化合物。δ3.965(1H，m)显示为1个连氧次甲基上的氢信号。图3（¹³C NMR）提示化合物中不存在苯环共轭双键、烯键和叁键结构。δ73.938，69.326提示有2个连氧碳存在，δ22.121，21.918，21.052，18.526，18.277，17.129，17.078，16.089提示有8个角甲基存在，这与¹H NMR的推断结果一致。通过化合物¹³C NMR谱与DEPT谱对比发现，化合物中含有6个季碳，10个仲碳。通过图2、图3的数据与文献 （Isaka M, Hywel-Jones NL, Sappan M, Mongkolsamrit S, Saidaengkham S. Hopane triterpenes as chemotaxonomic markers for the scale insect pathogens Hypocrella s. lat. and Aschersonia. Mycological Research, 2009,113(4):491-497）对比，可证明该物质是泽渥萜，化学结构如图4所示。

7）提取率：3.13%（提取率%=纯泽渥萜重量/菌丝体浸膏总量×100%）。

 

实施例2

1) 赭色小莫勒菌活化后，取菌块接种到PDB培养基中，在100r/min、24℃条件下连续培养7天即初级培养，按8％接种量再次转接到PDB培养基中，在24℃条件下静止培养35天即次级培养；

2) 菌液与菌丝体过滤分离，菌丝体在3℃、丙酮中浸泡48小时，过滤得浸泡液，旋蒸温度控制在35℃得浸膏，回收丙酮；加水溶解浸膏，水：浸膏重量比＝50:1，将水溶物倒入分液漏斗中，加入2倍的乙酸乙酯进行摇瓶萃取，摇瓶转速150r/min，摇20min静止150min,旋蒸乙酸乙酯部分浓缩得粗提物，回收乙酸乙酯；

3）1倍粗提物体积的乙酸乙酯溶解粗提物，上200-300目硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯体积比60:1开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比30:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得提取物A；

4）1倍粗提物体积的乙酸乙酯溶解提取物A，上200-300目硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯体积比30:1开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比15:1部分洗脱液，旋蒸浓缩，氯仿溶解，放在4℃冰箱里挥干，得晶体状物质经证明是泽渥萜。

5）经验证，得到纯度为99%的泽渥萜。

提取率：2.58%（提取率%=纯泽渥萜重量/菌丝体浸膏总量×100%）。

 

实施例3

1) 赭色小莫勒菌活化后，取菌块接种到PDB培养基中，在160r/min、28℃条件下连续培养10天即初级培养，按10％接种量再次转接到PDB培养基中，在28℃条件下静止培养40天即次级培养；

2) 菌液与菌丝体过滤分离，菌丝体在15℃、甲醇中浸泡100小时，过滤得浸泡液，旋蒸温度控制在40℃得浸膏，回收甲醇；加水溶解浸膏，水：浸膏重量比＝100:1，将水溶物倒入分液漏斗中，加入1倍的乙酸乙酯进行摇瓶萃取，摇瓶转速280r/min，摇60min静止150min,旋蒸乙酸乙酯部分浓缩得粗提物，回收乙酸乙酯；

3）1倍粗提物体积的乙酸乙酯溶解粗提物，上200-300目硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯体积比60:1开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比10:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得提取物A；

4）1倍粗提物体积的乙酸乙酯溶解提取物A，上200-300目硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯体积比30:1开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比15:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得浸膏，氯仿溶解，放在4℃冰箱里挥干，得晶体状物质泽渥萜。

5）经验证，得到纯度为99%的泽渥萜。

提取率：2.67%（提取率%=纯泽渥萜重量/菌丝体浸膏总量×100%）。