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第六届全国组织工程与再生医学大会

第六届全国组织工程与再生医学大会

  • 召开年:2013
  • 召开地:西安
  • 出版时间: 2013-04-18

主办单位:中国生物医学工程学会组织工程与再生医学分会

会议文集:第六届全国组织工程与再生医学大会论文集

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  • 摘要:目的:合成材料如左旋聚乳酸(PLLA)制备骨组织工程支架是目前最常用的方法.此外,介孔硅纳米粒子(MSNs)因其具有介孔孔径均一、孔道规则和生物相容性好等优点,可作为骨修复生长因子或者信号分子的载体.因此,本研究中,将MSNs与PLLA复合,制备出一种可以负载特定药物分子的PLLA/MSNs复合三维纳米纤维支架,可用于骨组织工程.rn 方法:首先采用经典的模板法制备MSNs,使用场发射扫描电镜、透射电镜观测其形貌以及分散情况,动态激光光散射测试其粒径分布.采用热致相分离法(TIPS)制备含不同比例MSNs (MSNs/PLLA质量比,0.25%-5%)的PLLA复合支架,采用扫描电镜观测支架微观形貌及MSNs的分散情况,热重分析法和差示扫描量热法检测MSNs对支架的热力学性能的影响,X射线衍射分析复合支架的结晶性能.rn 结果:制备的MSNs具有良好的分散性,孔径均一,粒径在100 nm左右。PLLA/MSNs复合支架微观上都呈现良好的纳米纤维结构,但当MSNs比例大于2%时,出现比较严重的团聚现象。与纯PLLA支架相比,MSNs的掺入虽然降低了支架的热学稳定性,但对支架的玻璃化温度(Tg)、熔融温度(Tm)以及结晶性无明显影响。rn 结论:MSNs的掺入对PLLA纳米纤维支架的理化性能无明显影响,但可为支架提供可控的药物释放特性,这种有枷无机复合支架可望用于骨组织的修复。
  • 摘要:目的:伴随骨感染的骨缺损一直是临床上救治的难点,一期骨缺损移植修复往往具有较高的失败率.快速发展的组织工程骨和抗生素缓释技术为此带来了新的希望.本研究通过兔胫骨慢性骨髓炎骨缺损模型检验复合万古霉索藻酸盐缓释系统的以纤维蛋白胶为支架的可注射型抗感染组织工程骨在局部的抗感染和成骨能力.rn 方法:建立兔胫骨感染性骨缺损模型,将复合物移植胫骨干骺端骨缺损处,通过放射影像学、组织病理学和细菌学检测复合物在体内的抗感染能力和局部成骨能力.rn 结果:研究结果显示,以纤维蛋白胶为支架、复合万古霉素藻酸盐缓释系统的可注射型抗感染组织工程骨在兔胫骨慢性骨髓炎骨缺损模型体内局部可以有效的杀灭细菌,术后1月和3月的Norden评分和组织细菌学培养显示抗生素缓释系统可以显著地减少Norden评分,组织培养物无细菌生长,可减少了骨髓炎的复发。同时,一期移植的组织工程骨复合物可以促进局部的成骨修复重建,与单纯的支架材料组相比具有更明显的成骨能力。rn 结论:本研究实现了骨感染合并骨缺损的一期骨缺损的修复,为临床患者的治疗提供一条可供选择的新策略。
  • 摘要:目的:肝脏组织工程为终末期肝病人进行肝脏移植提供了可能的选择.目前已有多种异种肝脱细胞方法来制备肝组织工程三维支架.然而,鲜有研究对不同去细胞方法对细胞外基质的结构和组成的完整性进行比较研究.rn 方法:采用二种脱细胞方法,并检测胶原、弹性蛋白、糖胺聚糖的含量及其对肝细胞培养的影响.rn 结果:在用SDS和Triton X-100处理后成功获得了肝脏组织脱细胞支架,通过HE染色和SEM证实基本移除了活细胞.二种不同方法对胶原含量影响较小,弹性蛋白含量分别减少到25%和65%,糖胺聚糖含量减少到8%和55%.Triton X-100处理得到的支架更适合于肝特异性功能(如白蛋白分泌、尿液合成、氨的清除等)的发挥.rn 结论:研究表明,使用Triton X-100灌注法处理获得的肝细胞外支架为组织工程和再生医学方法的使用提供了更为有效和理想的支架材料。
  • 摘要:针对神经支架的仿真化研究,结合冷冻干燥技术和冰晶形成理论,以Ⅰ型胶原为主要原料,加入少量壳聚糖,成功制备出具有轴向平行排列微管样结构的仿真神经支架(CSS)。CCS在横截面呈蜂巢样结构,纵界面上可见大量平行排列的微管样结构,微管结构之间有相互沟通的孔隙。CCS是在重力和温度梯度的影响下,冰晶在溶液中成核并沿温度梯度方向生成,经真空低温冷冻干燥作用后冰晶升华而生成的一种轴定向三维多孔支架结构。这种多孔支架,其孔的大小可通过改变冷淋速率来调控,孔的方向可由冷淋过程中温度梯度的几何方向来控制。实验研究表明,CCS的微管直径可控制在30~300μm,支架的外表面为致密结构,可有效阻止体内纤维结缔组织的长入。在动物体内可长期保持一定外形,4个月后仍能保持较好的空间结构,该支架既可直接植入桥接神经缺损,也可作为种子细胞种植的载体。在大鼠15mm以及比格犬5cm坐骨神经缺损模型中,形态学和电生理等结果显示CCS的修复效果接近自体神经移植,此外,该仿真支架在体具有良好的生物相容性和可控的降解性,具有良好的产业化前景。
  • 摘要:神经损伤及神经退行性疾病比如脊髓损伤,帕金森病,脑损伤等由于神经细胞的再生能力差而目前尚无有效的治疗方法.通过获得并移植病人特异性的神经细胞可以替代病人本身已经损伤丧失的细胞从而达到治愈这类神经系统疾病的目的.然而通常情况下,体外很难获得并扩增病人本身的神经细胞用于临床治疗.成功的建立了一套能够利用病人尿液细胞获得神经干细胞的技术体系.研究通过特殊的手段将一些干细胞因子导入进从病人尿液中分离而来的细胞中并通过特殊的诱导培养基培养,成功的将病人的尿液细胞诱导转变为具有功能的神经干细胞.这些由尿液细胞转变而来的神经干细胞能够在体外扩增并在适当的条件下能够分化成熟为各种人体中存在的神经元和角质细胞.在进一步的动物模型的移植实验中,能够很好的在体内存活和融入宿主的脑环境中.这些重要发现为获得病人特异性的神经干细胞用于移植治疗提供了一个具有极强实用性的技术手段和途径,有望在将来的临床应用中发挥重要作用.
  • 摘要:对于治疗终末期功能衰竭的器官而言,当前最有效的治疗手段是自体器官移植;然而自体器官移植却面临着诸如供体器官数量有限以及移植后免疫排斥反应等问题.组织工程技术的发展为重要生命器官体外重建与体内移植治疗提供了全新的策略和有效途径,尤其是,近年来出现的基于全器官脱细胞基质的重要生命器官组织工程研究进展迅速,展示了广阔的发展前景,该方法利用物理、化学和酶解等脱细胞方法将器官内驻留细胞清除,同时保留其细胞外基质成分,从而获得一个具有一定组织特异性、原器官固有三维以及超微结构和血管等结构特征得以一定程度保留的新型支架材料,在获得基于全器官形貌的脱细胞支架材料之后,利用种子细胞将支架材料再细胞化以实现组织工程化人工全器官的再造.
  • 摘要:目的:在体外寻找一个有利于肝细胞生长与功能维持的细胞外基质微环境成为目前肝脏组织工程研究的焦点.通过灌注法制备猪全肝脱细胞化生物支架(decellularize pig liver biological scaffold,DLBS),并进行初步的表征鉴定,为肝脏组织工程提供临床可应用的新型支架材料.rn 方法:采用1% Triton X-100联合0.1%氨水门静脉灌注法制备脱细胞化猪全肝脏生物支架,并对脱细胞前后支架材料DNA含量,胶原、弹性蛋白、糖胺聚糖含量进行测定,观察脱细胞化效果;HE染色进行组织学观察,扫描电镜观察脱细胞支架表面形态.rn 结果:经过1% Triton X-100联合0.1%氨水灌注脱细胞法制备的猪脱细胞化全肝生物支架不含细胞成分,只剩下胶原、弹性蛋白、糖胺聚糖等支架成分。rn 结论:利用1% Triton X-100联合0.1%氨水灌注脱细胞,可以有效完整去除肝脏组织的细胞成分、细胞外基质保留较完整,整个支架呈透明状,是一种较为理想的生物支架材料。
  • 摘要:人体骨组织的损伤修复与重建一直是现代医学力求解决的难题.目前临床所使用的骨组织修复材料存在生物活性低、再生速度慢等问题.本研究的思路是模拟机体自身创伤自愈合过程,构建"特定材料+生物活性因子",借助人体微环境"生物反应器",实现待修复骨组织周围的细胞在支架表面粘附、生长、分化,在支架被降解的同时,实现原位再生新生骨组织,是一种介于单纯生物材料与传统组织工程之间的研究思路,具有较好的发展潜力和应用前景.rn 特殊结构和功能材料的构建和生长因子的负载是实现原位再生的关键和核心。本研究采用基因工程技术在大肠杆菌中成功表达并复性出高纯、高活性的重组人骨形态蛋白-2(rhBMP-2),并达到中试生产能力,为材料的活性化提供直接的物质保证。进一步研究了小分子物质(磺化壳聚糖、地塞米松等)对rhBMP-2诱导成骨活性的影响规律及机制。发现一定剂量的磺化壳聚糖和地塞米松可显著提高BMP-2的成骨活性,是实现生长因子的活性维持和剂量控制的有效手段。在此基础上,模拟人体骨组织的自愈合过程,从无机组成、细胞外基质及功能三个角度成功合成并活性组装出具有引导骨组织再生功能的类骨磷灰石、响应型水凝胶材料和活性纳米介孔硅基干凝胶等多级结构支架材料。
  • 摘要:本研究的目的是进一步完善提取天然软骨细胞外基质材料的工艺和流程,利用天然软骨细胞外基质材料制备软骨组织工程取向性支架、从生化组成及结构特性上仿生天然关节软骨组织的特点,对其理化性质进行检测,并探讨其对种子细胞生物学行为的影响以及与自体骨髓基质干细胞复合修复兔膝关节全层关节软骨缺损的效果。
  • 摘要:人口健康直接影响国家的经济发展和社会进步,是构建和谐社会和可持续发展的重要保障和基础.目前,中国在人口健康领域面临巨大挑战:首先,出生缺陷和与人口老龄化问题将成为影响中国社会可持续发展的重大问题.一方面,中国出生缺陷发生率高达5%,并以每年80~100万的速度增长,给家庭和社会带来沉重负担.另一方面,人口老龄化导致神经退行性疾病发病率显著上升.目前中国有老年痴呆患者600万人以上,60岁以上人群的患病率为4%~7%.其次,疾病谱发生改变,慢性病、代谢性疾病己成为人类健康的主要威胁。同时,重大传染病的危害依然存在。中国是世界第一人口大国,因创伤、疾病、遗传和衰老造成的组织、器官缺损或功能障碍位居世界各国之首。由于供体器官来源不足和机体对异体器官排斥反应等限制,使人体器官移植远远满足不了临床的巨大需要。当现有的医疗技术难以满足人们的需求时,基于干细胞的修复与再生能力的再生医学,将有望成为继药物治疗、手术治疗后的第三种疾病治疗途径,成为新医学革命核心,而干细胞和再生医学研究正在引领现有临床治疗模式发生的深刻变革。
  • 摘要:胶体材料的研究与应用已有多年的历史。近年来,随着纳米技术和生命科学的快速发展,越来越多的胶体微粒被用作荧光探针和药物或基因的载体,在生物分析、检测以及药物传输和基因治疗等领域得到了广泛应用。细胞内吞是细胞将细胞外基质、病毒、微组织或微粒运送到细胞内部的一个重要生理过程。本课题主要围绕细胞层次上调控胶体微粒与细胞相互作用的需要,制备与优化胶体微粒的结构与性能,获得可降解和非降解胶体微粒,以及有刺激响应型微粒的胞吞与胞吐规律及其控制条件,建立胶体微粒胞吞与转运模型,为优化胶体微粒在生物医学上的应用提供指导。
  • 摘要:天然生物材料指的是自然界天然形成或从动物植物中提取以及用生物工程技术直接制备的生物材料.天然生物材料的属性使得其在组织工程和再生医学中广泛应用.在进行组织工程和再生医学研究中,往往关注的是相关的科学问题与关键技术的解决,而对组织工程以及所用的天然生物材料的应用可能给人类带来风险以及风险分析与研究注意不够.组织工程与再生医学的目的是要在临床应用它们的成果.无论从伦理角度,还是从相关的管理法规与相关的国际、国家、行业标准看,风险因素没有控制在人体接受的范围,这些成果也不应该也不可能在临床得到应用,也不可能实现产业化。因此,相关的风险分析与风险控制与研究,特别是生物安全性评价与研究就成为组织工程产品产业化的关键之一。只有执行GBIT16886系列标准基础上,根据法规的要求及标准的要求进行相关的设计验证,工艺验证以及临床前动物实验,只有完成了这些工作,才能认为完成了产品的安全性评价与研究工作。
  • 摘要:椎间盘退行性变疾病是一类具有高发病率及高致残率疾病,目前临床上对其的治疗主要分为非手术保守治疗和外科手术治疗,但这两种治疗方式均存在不同程度的局限性.近年来,利用组织工程技术体外构建具有生物学活性和功能的组织来置换或修复发生退行性变椎间盘的研究,让椎间盘退行性变的治疗出现了新的希望.本研究在于构建一个完整的具有生物学功能的仿生学组织工程椎间盘,并观察检测其生物学功能,以期为临床治疗带来新的希望.将纤维环细胞、髓核细胞和软骨细胞分别种植于之前构建的BMG/PPCLM双相支架材料、高亲水性半透明状水凝胶壳聚糖和静电纺丝技术制备的三元复合支架材料上,在体外分别构建组织工程纤维环、髓核和软骨终板,然后将它们组装为完整的组织工程椎间盘。体外诱导培养基分别培养1,2,3,4周,检测4周后组织工程椎间盘生物力学性能、培养各时间点Aggrecan,CollagenⅡ,CollagenⅠ基因表达和免疫组织化学或免疫荧光染色、Safranin-O染色检测糖胺聚糖表达情况,最后将完整组织工程椎间盘BALB/C小鼠皮下种植4周后检测种植部位及邻近组织炎症反应。各项检测指标显示其接近于正常生理功能,有望为椎间盘退行性变疾病晚期的临床治疗带来新的希望。
  • 摘要:由于缺乏合适的支架材料,构建临床应用型组织工程化人耳廓形态软骨,仍然是一个巨大的挑战.本课题组前期研究证实,聚羟基乙酸(PGA)与软骨细胞复合构建成熟软骨组织效果稳定,并且具有良好的生物相容性和生物可降解性,经聚乳酸(PLA)包埋后可提高PGA支架的强度.但PLA含量过高会降低细胞粘附率,同时酸性降解产物增多,植入动物体内无菌性免疫反应严重.为平衡支架材料对细胞粘附率和强度的要求,本课题主要探讨构建人耳廓形态带内核组织工程化软骨的可行性.实验组以人耳廓形态的PCL-PGA(10%PLA包埋)复合材料为支架,取小乳猪耳软骨分离培养软骨细胞,将体外培养的软骨细胞,按10×107/ml的细胞浓度均匀接种于支架,即刻种植于裸鼠皮下。对照组以人耳廓形态的PGA(10%PLA包埋)为支架,同时以相同浓度的软骨细胞均匀接种于支架,阳性对照组接种后用耳廓形态的高分子聚合物作为内支撑固定,阴性对照组不作处理,分别种植于裸鼠皮下12周后取材。行大体观察、激光轮廓扫描、组织学、组织化学、免疫组化及糖氨聚糖(GAG)定量等检测。实验组所构建的产物有足够的强度对抗植入皮下所带来的张力从而维持原先复杂精确的形状。
  • 摘要:目的:骨组织再生一直都受到很多学者的关注.针对骨组织形成的微环境,构建利于骨生长的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米纤维支架材料,并加入骨组织的主要成分—羟基磷灰石(HA)和促进骨再生的药物—辛伐他汀(S),通过PLGA的缓慢降解将二者逐步释放于骨组织的微环境中,达到促进骨再生的目的.rn 方法:采用静电纺丝的方法合成PLGA,PLGA/HA,PLGA/HA/S纳米纤维支架,利用材料降解实验检测PLGA/HA/S支架释放辛伐他汀的剂量与时间的依赖关系;通过体外实验研究小鼠的前成骨细胞在三种支架材料上的黏附、增殖和分化;分别将PLGA/HA和PLGA/HA/S支架材料植入大鼠头盖骨缺损内,检测其促骨形成能力.rn 结果:扫描电镜显示三种纳米纤维支架中纤维直径在20nm-1μm;通过缓释实验可以得出:在第60天时仍有有效剂量的药物从支架材料中释放出来;前成骨细胞可以在这三种支架上较好的乳附和生长,特别是在PLGA/HA/S组有大量细胞外基质合成,细胞一细胞相互连接生长成片状;PLGA/HA/S组细胞ALP相对活性在第14天时明显高于其他组(P<0.05);通过Micro-CT和组织学分析可得PLGAlHA/S组形成大量新生骨,与其余各组有明显差异。rn 结论:载药纳米纤维支架可以通过缓慢降解将辛伐他汀释放于微环境,在体外促进了细胞的黏附、增殖和分化,在体内对骨组织的再生起到了正向调节作用。
  • 摘要:完全性房室传导阻滞是各种心脏病的重要并发症,严重威胁人类的身体健康和生命,近年来生物心脏起搏是其治疗研究的热点.生物起搏治疗房室传导阻滞目前涉及基因导入和细胞移植两类方法,但基因和细胞在体内极易迁移和弥散,难以形成稳定统一的功能.组织工程化心传导束是体外制备的人工生物化传导组织,利用其修复病损的传导通路从理论上来说应比基因导入及细胞移植更为理想,但目前国内外尚无组织工程化心传导束相关研究的报道.在前期研究中分离培养了骨髓源性成体多能祖细胞并对其生物学特性进行了检测,初步证实该细胞具有向心脏传导系组织细胞分化的可能;进一步的研究拟将骨髓源性成体多能祖细胞诱导分化为心脏传导组织细胞,并将该诱导成功的细胞种植到胶原海绵支架上体外构建组织工程化心传导束;在此基础上,通过导管在房室传导阻滞模型犬的房室隔区植入构建成功的组织工程化心传导束,探讨通过生物工程化组织定点修复房室传导通路的可行性及机制。
  • 摘要:目的:最近的研究结果提示肾源性干细胞治疗不可逆的肾病成为研究的热点.神经干细胞标志物Nestin在小鼠胚胎肾及成熟肾组织中有表达,本研究观察Nestin是否为肾祖细胞重要标志物.rn 方法:利用Nestin-GFP转基因小鼠观察Nestin在肾组织中的表达及分离Nestin阳性细胞鉴定自我更新及分化能力及判定在肾损伤修复中的作用.rn 结果:本研究发现,利用Nestin-GFP转基因小鼠,通过流式分选获得的Nestin阳性细胞,培养后可见克隆球形成;细胞传代三十代后仍可见克隆球的形成;可从单个细胞形成克隆球,并且明显表达Nestin;染色体核型正常.通过CCK8活性检测发现具有明显的增殖能力。经体外不同诱导分化培养后,发现其可向成骨,成脂,成神经,成肌细胞分化,提示该Nestin阳性细胞具有向多胚层细胞分化能力。Nestin阳性细胞经静脉注入到肾缺血再灌注损伤小鼠体内,3天后在肾小球中可见标记的Nestin阳性细胞,7天后可分化为nephrin,vementin阳性的足细胞。并且,降低了血肌配水平及细胞凋亡,改善了肾功能的恢复。rn 结论:上述结果表明肾源性Nestin阳性细胞具有较强的自我更新能力及多组织器官分化能力。提示其是肾胚胎发育过程中遗留下来的,最有力的肾源干/祖细胞标志物,尤其是肾小球足细胞的前体细胞的重要标志物。
  • 摘要:研究表明肌腱干细胞可能是修复肌腱损伤的最有效的细胞来源,而周期性牵张应力刺激在肌腱的生理代谢中起关键作用.肌腱中最主要的成分是Ⅰ型胶原,其次是Ⅲ胶原.目前关于不同周期性牵张应力刺激(例如,应变振幅,频率和循环周期等)对肌腱干细胞的增值及胶原合成的影响并不清楚.为此,将兔肌腱干细胞接种到小肠粘膜支架上,将细胞支架复合物培养于定制的生物反应器中,分别予以不同频率和幅度的周期性牵张应力刺激,测定肌腱干细胞的增殖与胶原合成情况.实验组频率设置为0.3HZ,O.5HZ,1.OHZ;幅度设置为2%,4%,8%,未予以刺激的静止组作为对照组,培养l4天。MTT检测1,3,5,7天细胞增值的情况,14天时用Real time PCR检测各组细胞基质中Ⅰ和Ⅲ胶原表达的水平,以及COLⅠ/Ⅲ表达比例。研究表明,O.5Hz/4%的周期性牵张应力可能是促进肌腱干细胞增殖及胶原合成的最佳应力刺激方式。
  • 摘要:种子细胞来源不足一直是限制软骨再生研究与应用的瓶颈问题,也是人耳形态软骨一直未转化为临床应用的核心问题之一.干细胞研究的兴起与蓬勃发展,为解决这一难题带来了福音.研究表明,软骨的细胞外基质具有一定的软骨诱导作用。在明确软骨微环境诱导干细胞软骨分化机制的基础上,又进一步分析了皮下环境中干细胞再生软骨失败的主要可能原因。通过干细胞体外不同诱导时间后的体内转归分析,发现,干细胞体外构建软骨的成熟程度是决定其体内转归的关键,体外构建的软骨越成熟,体内软骨的稳定性就越好。进一步检测还发现,这主要与干细胞再生软骨过程中促血管化因素(如VEGF)与抗血管化因素(如Chm-1)的调控平衡有关。基于这些发现,通过体外长期诱导基本克服了干细胞皮下环境中再生软骨的难题,这显然为干细胞在皮下环境中再生人耳形态软骨的临床转化奠定了基础。在克服这一核心难题后,又结合机算机辅助技术建立了人耳软骨形态精确调控技术。近期还有一个全新的发现:小耳症病人的残耳软骨中含有大量高纯度的软骨干细胞,这些细胞具有很强的增殖能力和软骨再生能力,目前应用这一干细胞已能在体外成功构建出具有正常人耳大小和精确形态的三维软骨,这一发现及相关核心技术的建立,无疑是耳重建外科的一大福音。
  • 摘要:材料表面微米及纳米形貌对干细胞的生长和分化均有很重要的影响.许多研究表明我们可利用这种效应来控制干细胞的命运并应用于生物材料及组织工程.但是,大部分有关研究均局限于二维平面材料,因为在三维材料表面制备可精密控制的表面形貌十分困难.在目前各种用于制备组织工程骨架材料的方法中,还很少见到有可控制表面形貌的组织工程程骨架材料.在这里将报告一种新型微加工结合微浮雕工艺来制备具有可控表面形貌的陶瓷及复合材料组织工程骨架材料,以期用于大缺陷可承载骨再生.
  • 摘要:目的:细胞外基质不仅仅是一种结构组成,而且也是一种信息方式,这种信息在引导细胞分化和组织构成上起重要作用,本文尝试以软骨细胞外基质Ⅱ型胶原(CollagenⅡ,COLⅡ)-透明质酸(Hyaluronic acid,HA)-硫酸软骨素(Chondroitin sulfate,CS)为原料,通过静电纺丝的方式构建软骨组织工程支架,这种支架能够同时在成分和形态模拟组织工程软骨.rn 方法:将COLⅡ、HA、CS按一定比例溶于三氟乙醇和水的混合溶剂中制成溶液,通过静电纺丝技术制备出具有三维多孔纳米支架材料,通过扫描电镜观察其表面形貌和直径,测定其孔隙率、吸水率、接触角.将兔软骨细胞种植于支架上,用CCK-8法评价其细胞粘附性及增殖情况,用H&E染色、番红染色和免疫组化染色观察软骨细胞在支架上的生长和细胞外基质分泌情况.rn 结果:扫描电镜观察支架材料表面形貌良好,纳米纤维直径均一,孔隙率良好;纳米纤维平均直径200±25nm,孔隙率92.5±5.0%,表面触角为35.60±3.40;细胞实验结果显示,支架生物相容性良好,软骨细胞在其上具有高度的粘附性,能进一步的生长增殖,并分泌出相应的细胞外基质。rn 结论:以COLⅡ, HA和CS为原料,通过静电纺丝方式制备的纳米三维支架材料具有良好的孔隙率、吸水率、接触角;生物学性能良好,在软骨组织工程重建中具有广泛的应用前景。
  • 摘要:目的:食道运送食物的功能主要是靠肌层组织收缩引起的蠕动完成的,食管等消化道中的肌层组织结构相似,是由内环形和外纵形两层肌层结构组成.设计了一种能够模拟平滑肌的生物支架,目的是为将来构建具有上皮层和肌层结构的完整的组织工程食道.rn 方法:首先用实验室自主设计的二氧化硅模具复制出PDMS(聚二甲基硅氧烷)子模板,然后用其作为母版制备出具有内环形和外纵形微槽的PU(聚氨酯)管状支架,用丝素蛋白和明胶接枝支架表面进行改性.将原代培养的SMC(平滑肌细胞)以3~5 104 ml的密度种植到上述支架上,采用H&染色、扫描电镜、免疫组化、MTT法等检测了细胞表型、生长活性,以证实体外构建内环外纵肌层的可行性.目前正在进行动物体内食管肌层的在体替代实验.rn 结果:SMC在200m,30m,30m(沟宽墙高墙厚)的双面微槽PU聚氨酯)上生长良好,细胞具有沿着微槽方向取向生长的趋势,这种取向生长的趋势与天然的肌组织形貌相近,有望维持平滑肌细胞的收缩功能。rn 结论:此PU微槽支架可以模拟食道平滑肌层内环外纵的特殊结构,正在尝试种植具备多向分化能力的骨髓间充质干细胞,并诱导其向上皮细胞和平滑肌细胞分化,有望在不久的将来构建出功能完整的工程化食道组织。
  • 摘要:目的:人工构建的骨软骨再生材料逐渐替代自体、异体或异种骨软骨移植进入临床应用,能否再生出与自身骨软骨相匹配的组成和结构是评估其治疗效果的关键.模拟骨软骨天然多层结构研发出一种新型关节骨软骨复合支架,即一体化胶原基骨软骨三层支架,拟实现大面积骨软骨缺损的再生修复.rn 方法:综合利用酸处理和酶处理法从猪跟腱中提取Ⅰ型胶原,并利用一体化构建技术和生物矿化原理,制备出具有致密胶原层(致密软骨层)、多孔胶原层(多孔软骨层)和多孔胶原-纳米羟基磷灰石层(软骨下骨层)的一体化骨软骨复合支架,并检测其显微结构、物相组成、体外细胞毒性和体内骨软骨再生性能.rn 结果:所制备的一体化胶原基骨软骨三层支架,层与层之间具有自然过渡的无缝界面,多孔胶原层与多孔胶原-纳米羟基磷灰石层均形成孔径大于100μm的内连通孔,且纳米羟基灰石为原位组装到胶原孔壁的弱结晶相;该三层支架无细胞毒性,移植到新西兰大白兔5mm直径、4mm深的膝关节骨软骨缺损处6周后再生出具有与天然骨软骨相似结构的组织。rn 结论:模拟骨软骨天然多层结构研发出的新型关节骨软骨复合支架,即一体化胶原基骨软骨三层支架,有利于关节骨软骨的再生修复,其生物安全性高、制备方法简单、易于操作,有望应用于骨软骨缺损的临床治疗。
  • 摘要:组织工程医疗产品(tissue engineered medical products,TEMPs)通常是复合产品,细胞及细胞类成分在TEMPs中占有重要的地位,细胞作为TEMPs的重要组份,其质量与TEMPs产品的质量密切相关.rn 目前,中国生产用TEMPs产品所用人源细胞的质量控制主要分为四个环节:1.细胞培养用材料,2.细胞来源人源供体的筛选,3.细胞操作过程的控制,4.细胞的检定.
  • 摘要:研究人员发明了针对脂质的脱细胞方法,利用磷脂酶A2选择性的消化细胞膜磷脂2-位脂键。由于细胞外基质成分中完全不含该脂键,因此该方法脱细胞具有特异性强、速度快、不损伤基质的优势。该方法不但能够有效的脱去所有的细胞成分,而没有对胶原成分产生明显影响,较好地保留了角膜基质的超微结构,制作的去细胞角膜基质具有良好的生物相容性、足够的生物力学强度、良好的稳定性、高度的透明性。针对角膜组织的生理学特点研究人员发明了连续灌注培养联合单面负压-气液界面培养的动态培养体系构建板层生物角膜,目前在构建组织工程产品时,提高细胞与支架的粘附,多采用对支架材料表面改性的方法,实际上,通过生物场及机械外力处理细胞及细胞外基质,也可以提高细胞与载体粘附力。近年来,日本学者利用温敏式专利技术用自体口腔豁膜上皮细胞、角膜缘上皮细胞等构建了上皮细胞片移植治疗角膜缘缺乏,取得了一定效果。此外,利用酶原-酶降解法和离心速构法体外快速构建复层组织工程角膜上皮,辅以眼表生物膜固定装置-羊膜制成接触镜也能重建兔角膜上皮。
  • 摘要:随着组织工程研究的深入,支架材料的选择方式已经由过去的就易取材转变为现在的选择取材,即根据特定应用所需要的性能来选择支架材料.利用脱细胞基质产品,作为组织工程学的构建基础具有合成材料无法比拟的优势和潜力。已用于临床的同种或异种脱细胞基质支架:脱细胞异体气管;脱细胞异体神经;脱细胞异种角膜。由日本Teruo Okano教授首创,通过培养基底与细胞在不同温度时的粘附和脱离行为获得体外细胞单层,是体外组织工程的重要创新:温敏性聚合物:聚N-异丙基丙烯酰胺(poly N-isopropylacrylamide),37℃时为疏水性,利于细胞豺附、伸展,温度降低到临界温度32℃以下时为亲水性,细胞脱附;细胞从聚合物表面脱附后,整体细胞群则在保持细胞间连接状态下保持片状形态,从而获得保留细胞活性的细胞层片。
  • 摘要:目的:研究异种异体组织修复材料(SIS)的制备技术,并对其生物学性能及力学性能进行表征.rn 方法:SIS组织修复材料是经严格筛查、检验,排除各种疾病及人畜共患疾病,封闭饲养的猪小肠为主要原料.经过一系列的病毒灭活、脱细胞、脱脂、清洗、冷冻干燥及辐照灭菌等工艺进行了去抗原、去病毒及灭菌处理,以获得制品的生物安全性及有效性.对制品进行了生物学检测及评价和力学性能测试及表征.rn 结果:SIS制备过程中通过温和的化学处理和成型工艺,得到一种平整致密且有一定力学强度的片状修复材料,使SIS修复材料完整地保留了天然细胞外基质的网架结构、多种胶原及一定的生物活性,在组织修复过程中不仅能够实现组织学再生,而且同时实现了功能重建,并在其修复过程中起到一定的防粘连作用。对材料的细胞毒性、致敏、皮内刺激、亚急性毒性、遗传毒性及动物体埋植试验结果符合相关标准要求。生物力学试验结果也表明符合相关的拉伸、顶破和缝合强度。rn 结论:经一系列去抗原、去病毒及灭菌处理的SIS修复修复材料具有良好的生物学性能和组织修复性能。是一种很有潜力的人体软组织修复产品。
  • 摘要:组织工程技术除了涉及骨形成细胞和生长因子,还涉及材料科学的相关技术,尤其是合成生物材料的发展使其修复大面积骨缺损成为可能.为提高材料的生物性能,多年来课题组设计合成了一系列新的聚合物及复合材料,并且在材料的仿生设计与制备等方面进行了不限的努力.首先,采用原位聚合或表面接枝的方法将PLLA、低聚乳酸、聚谷氨酸和聚苯胺等有机分子对无机纳米粒子进行表面修饰改性,发展了一系列以PLLA或PLGA为基体的纳米羟基磷灰石(n-HA)或生物玻璃复合材料.以上述材料为基础,开发了一系列组织工程支架的加工制备方法和工艺,包括静电纺丝,离心纺丝,粒子沥滤,气体发泡,相分离等,并采用二种或三种方法相结合的工艺制备了具有不同组分和微观结构的仿生支架。同时,为提高材料的智能性和组织再生能力,还设计合成了系列生物降解的导电高分子材料,探索了采用电活性智能材料和电刺激增强组织再生能力的新技术。结果表明,通过共混方式制备的HA/PLLA(或PLGA)的纳米复合材料则不仅模拟了天然骨骼的组分,还极大地提高了聚合物材料的机械性能、加工性能和生物性能,尤其适合于作为骨科固定和修复材料。加工制备的骨组织工程支架在动物实验中取得了明显效果。目前,开发的部分材料和制品正在产业化和临床试验。
  • 摘要:目的:近年来通过组织工程方式构建仿生纤维环的研究逐渐受到重视.为此,需全面了解该组织的微观结构、生化组成及力学特性.尽管已知纤维环组织沿径向不同区域在细胞和基质组成方面差异明显,但仍缺乏详实数据.本研究拟提取兔椎间盘纤维环外、中、内各区组织及细胞,鉴定它们之间在基质组分、细胞基因表达和力学性能等方面的差异性,以作为纤维环不同区域表征的参考标准.椎间盘纤维环各区域所承担的生物学功能有所不同,其细胞类型、基质组成和力学特性也具有明显差异。本研究通过定量、半定量或定性的方式系统考察了纤维环的区域特异性,可以此作为纤维环不同区域表征的参考标准,将有益于纤维环及椎间盘组织工程的研究。
  • 摘要:目的:检测组织工程骨中牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)残余量,并探讨减少其残留量的方法.rn 方法:体外分离培养人骨髓基质干细胞,接种完全脱钙骨支架材料并体外成骨诱导2周,构建组织工程骨.组织工程骨先经1:100 (v:v)生理盐水浸洗3次,然后加入磷酸盐缓冲液,37℃振荡浸提24h,获取浸提液.采用酶联免疫法检测其中BSA的残余量.以单纯支架材料作为对照组,比较二者单位重量材料中残余BSA含量.rn 结果:随洗涤次数增多,组织工程骨样品洗涤液中BSA含量明显降低。单位重量组织工程骨与单纯支架材料的BSA残余量分别为0.2808±0.1713 ng/mg和0.2104±0.1117ng/mg,两者相比无显著性差异。rn 结论:酶联免疫法适用于组织工程骨中BSA残余量的检测。因为支架材料较细胞更为容易吸附BSA,现有条件下构建的组织工程骨BSA残余量仍然较高,需要继续探索降低BSA残余量的新方法。
  • 摘要:目的:组织工程研究的目的是将其研究结果应用于临床,解决临床问题,修复临床所遇到的组织损伤,本文章回顾组织工程软骨基础研究、临床前研究和临床应用,以为组织工程走向临床提供经验.rn 方法:1.从临床寻找问题;2.通过基础研究证实临床困境;3.从基础研究寻找解决方案;4.模仿临床问题,进行临床前研究;5.逐步开展临床应用.rn 结果:本研究组进过20多年的组织工程软骨基础研究、发现取向性脱细胞软骨支架是较好的组织工程软骨支架,将其与自体细胞复合,修复动物关节软骨损伤区,修复效果满意.基础研究取得了突破性研究结果,但是还需要和临床应用实际情况相结合,进过周密的临床前研究,将其应用于患者关节软骨的修复,术后最长随访病例6年效果满意.rn 结论:组织工程的研究课题首先来源于临床医生遇到的问题,在开始设计课题的时候就需要有长远的计划,在获得较满意基础研究的同时,必须和临床相结合,才能较快的走向临床应用。
  • 摘要:目的:对于大面积烧伤病人,自体皮肤移植皮源不足和异体皮肤移植中的免疫排斥反应给患者的救治带来了极大不便.聚合物基人工皮肤具有材料来源广泛,价格低廉,组织相容性好等优点,是一种快速有效保护伤口的重要方法.尝试制备多孔硅橡胶薄膜做为人工皮肤,防止体液的过度流失和外界细菌的感染,进而促进伤口的愈合.rn 方法:利用溶剂挥发诱导相分离法制备厚度和孔径可调的多孔硅橡胶膜.对多孔硅橡胶薄膜的孔结构进行了扫描电镜观察,并对其力学性能和水蒸气透过率进行了测试.rn 结果:扫描电镜结果表明硅橡胶薄膜中均匀分布着微米级的小孔,能有效增加薄膜的水蒸气透过率;拉仲强度为2.5 Mpa;水蒸气透过率为74.03 g/m2·24h,与同类产品Integra相似。rn 结论:利用溶剂挥发诱导相分离法制备的多孔硅橡胶薄膜,能够做为人工皮肤对大面积烧伤病人伤口起到有效的保护作用。
  • 摘要:目的:探索利用冷冻干燥技术制作多孔脱细胞角膜基质作为支架材料构建活性角膜基质的可行性.rn 方法:使用磷脂酶A2制备脱细胞猪角膜基质(Acellular porcine comeal stroma,APCS),通过预冻温度-10℃、-80℃及-198℃冷冻干燥加工成多孔脱细胞角膜基质,评价制备冻干脱细胞角膜基质(Freezing-dry acellular porcine corneal stroma,FD-APCS)物理学特点.利用动态培养系统体外构建带细胞活性角膜基质,评价细胞增殖活性,确定体外构建最适宜载体及影响参数.囊袋板层角膜移植以评价FD-APCS透明性、生物稳定性及愈合.rn 结果:体外实验证实FD-APCS孔径随预冻温度下降而逐渐减小;孔隙率随预冻温度下降而增高,均较APCS明显增高;比表面积随预冻温度下降而增大,均较APCS明显增大;孔径分布≥1Oμm随预冻温度下降而减少,<10μm孔径比例随预冻温度下降而增加;三组FD-APCS渗透胜较APCS明显增高,-10℃ FD-APCS渗透性最强。三组FD-APCS均可作支架材料构建活性角膜基质,-10℃ FD-APCS组基质细胞表现出最强增殖活性。角膜移植证实:FD-APCS植片完全透明时间、体外透过率与APCS无显著差异;胶原纤维间距恢复与正常兔角膜无显著性差异。rn 结论:磷脂酶A2脱细胞方法制作角膜支架,冷冻干燥技术在-10℃时加IFD-APCS最利于角膜基质细胞生长,角膜移植后植片透明,胶原纤维间距恢复正常。该材料适用于构建活性角膜基质。
  • 摘要:目的:探索骨髓神经组织定向干细胞(NTCSCs)向谷氨酸能感觉神经元的诱导分化.rn 方法:取SD大鼠骨髓在无血清神经培养液中,采用细胞球的悬浮培养方法进行扩增,得到NTCSCs.待细胞球形成后,吹散并采用SHH和RA联合诱导NTCSCs向神经元方向进行分化.观察诱导前后细胞形态学的改变,检测谷氨酸能感觉神经元相关基因及蛋白的表达.rn 结果:SHH和RA联合诱导NTCSCs 72h,神经细胞相关蛋白Nestin,NSE,Map-2,β-tubulin Ⅲ高表达,谷氨酸能感觉神经元相关基因GluR4,Calretinin,P2X3的表达明显升高。rn 结论:NTCSCs具有干细胞特性,在SHH和RA的联合诱导作用下可分化为谷氨酸能感觉神经元。
  • 摘要:组织工程化组织形变是制约组织工程发展的瓶颈之一,本研究拟通过对组织工程化心传导束形变影响的研究,寻求改善组织工程化心传导束形变问题的解决方法.将胚胎心脏祖细胞种植于胶原海绵支架材料构建组织工程化心传导束后,通过种植不同密度的种子细胞和不同时间体外培养等的观察研究,找出引起形变的原因;在培养体系中添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)分别从细胞层面和三维层面,采用免疫荧光,实时定量PCR,酶联免疫吸附法(ELISA)以及Western Blot等方法,研究bFGF对组织工程化心传导束形变影响及机制.组织工程化心传导束的形变是由细胞的类型引起的,并且是细胞的收缩功能引起的。添加细胞生长因子bFGF后,细胞层面结果:平滑肌肌动蛋白(SMA-α)免疫荧光结果显示,bFGF可以明显的降低SMA-α的表达;实时荧光定量PCR,酶联免疫吸附法(ELISA)以及Western Blot等结果均显示,bFGF可以明显的降低SMA-α的表达,并且具有统计学差异。组织层面结果:通过大体观察显示bFGF的添加可以改善组织工程化心传导束的形变;实时荧光定量PCR,酶联免疫吸附法(ELISA)等结果均显示,可以明显的降低SMA-a的表达,并且具有统计学差异;电传导测试表明,bFGF的添加对组织工程化心传导束的电传导性能没有明显的影响。
  • 摘要:目的:从体外实验与体内实验两方面,探讨两种荧光染料CM-DIL与DAPI标记的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)之间的差异.rn 方法:用贴壁培养法获取、培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,CM-DIL与DAPI分别标记第2代BMSCs,未标记细胞为对照组.台盼蓝计数检测BMSCs的活力;MTS法检测BMSCs的增殖能力并绘制增殖曲线;倒置相差荧光显微镜下动态观察标记后1、2、3代BMSCs的阳性标记率及荧光衰减情况.结扎SD大鼠冠状动脉前降支致心肌梗死,并随机分为2组;CM-DIL组与DAPI组.3天后于心肌梗死边缘处注射标记的细胞,细胞移植后3天取材制备冰冻切片与石蜡切片,在荧光显微镜下观察标记的BMSCs的分布情况.rn 结果:体外实验中,CM-DIL标记的BMSCs与DAPI标记的BMSCs在细胞活力及增殖能力方面没有统计学差异,但两者的增殖能力均低于对照组;两种染料标记后的第1代细胞的荧光阳性率均为100%,但DAPI标记后的第3代细胞的荧光强度明显减弱。体内实验中,CM-DIL组与DAPI组心肌组织冰冻与石蜡切片均检测到集中分布的荧光;CM-DIL组冰冻切片红色荧光要比DAPI组的蓝色荧光边界清晰并且非特异性背景低;CM-DIL%进一步通过含DAPI的封片剂封片排除荧光假阳性。rn 结论:CMVI-DIL染料比DAPI更适合对BMSCs进行体外标记与体内示踪。
  • 摘要:使用纤维环穿刺抽吸法造模兔椎间盘退变模型.探讨三种常用种子细胞髓核细胞(NPC),骨髓间充质干细胞(MSC)和脂肪间充质干细胞(ADSC)对兔受损椎间盘髓核结构的修复作用,寻求一种最佳的种子细胞.NP,MSC和ADSC三种细胞移植能够有效抑制椎间盘损伤后发生的进行性的退变过程。12周后NPC组显示出比MSC组更强的细胞外基质合成能力。提示外源性NPC能够在受体椎间盘内存活,并有效修复受损椎间盘,而MSC可认为是一种治疗椎间盘退变得良好的种子细胞,可作为NPC的替代种子细胞,ADSC修复效果虽不如MSC,但由于其来源较为广泛,获取方法较为简便,可认为是一种有治疗效果的种子细胞。
  • 摘要:目的:以骨髓源性间充质干细胞(BMSCs)为种子细胞,温敏性水凝胶为三维支架,心肌组织裂解液为生物因素,构建体外复合体培养体系,探索BMSCs在三维支架内生长、分化的规律.rn 方法:建立稳定的骨髓源性间充质干细胞系;将壳聚糖,β-甘油磷酸钠及羟乙基纤维素按8:3:2.5比例混合,制备温敏性水凝胶.选取生长良好的第三代BMSCs接种于支架上连续培养2w后,加入心肌组织裂解液培养5d.倒置相差显微镜下连续观察细胞形态变化的特征,收集细胞支架复合物行苏木精-伊红染色,扫描电镜观察超微结构.rn 结果:MSCs经流式细胞仪检测阳性表达CD29,阴性表达CD34。倒置显微镜下观察,可见温敏性水凝胶含交织呈网格状的纤维样结构,纤维间孔隙内含胶冻样物质:BMSCs接种后呈球形,折光性好。HE染色支架呈嗜酸性,BMSCs接种后,部分细胞分布于纤维样结构表面,部分渗入孔隙内。扫描电镜下观察可见支架具有良好的孔径率,细胞在支架上分裂增殖活跃,并以对称分裂为主,呈8字型、品字型;添加心肌组织裂解液后,细胞逐渐拉长呈梭形。rn 结论:骨髓源性间充质干细胞与温敏性水凝胶生物相容性良好,细胞在支架上可保持低分化状态,并表现活跃的分裂增殖现象;在特定的三维微环境培养体系中,能够较好的模拟体内组织结构,促进BMSCs的分化。
  • 摘要:目的:丝素蛋白因其优良的力学性能、生物相容性、可降解性等良好的性能,在生物材料领域受到高度的关注.然而,如何消除材料中残留的化学试剂以及如何提高其力学性能,一直以来是丝素多孔支架材料制备中亟待解决的难题.rn 方法:本研究使用了一种简单且环保的方法来制备具有较强力学性能的多孔丝素支架材料,即从五龄第7天家蚕幼虫中部丝腺中提取的的丝素蛋白水溶液(ASF)制备多孔支架.通过该方法得到的ASF分子量高于250 kDa,与完整的丝素蛋白重链的分子量相近,通过冷冻干燥法将ASF制备成多孔性支架材料.rn 结果:本研究所制备的多孔支架材料孔隙大小均匀,而且,随着ASF浓度的增加,其孔隙率逐渐降低,最大的抗压强度可高达6.9±0.4MPa。与此同时,ASF具有较高的细胞粘附率和增殖率,表现出良好的生物相容性。rn 结论:从丝腺中提取丝素蛋白作为原料,可以制备具有较高的力学性能和优良的生物相容性多孔支架材料,该材料有望用于组织工程中的骨修复材料。
  • 摘要:目的:制备由蛋白或者多肽形成的水凝胶并将其应用于细胞培养和药物控释方面.rn 方法:通过自组装的形成制备多肽形成的小分子水凝胶;通过巯基和马来酰亚胺共价反应的形式制备蛋白-PEG杂化水凝胶.考察细胞在这些水凝胶中三维培养情况下的行为;考察药物释放行为.rn 结果:通过理性设计的多肽可很好的溶解于纯水溶液中(pH 7.4),在添加缓冲液或者细胞培养基的条件下可诱发水凝胶的形成.水凝胶的形成过程仅需2分钟,由于无pH值的改变,可实现细胞均匀包裹,各类细胞在水凝胶中生长情况极佳.由四臂PEG和蛋白ULD形成的水凝胶成胶迅速,也可实现细胞均匀包裹.通过理性设计蛋白质,可通过蛋白-多肽特异性识别力强弱调控药物释放速率.rn 结论:两类水凝胶都可应用于各类细胞的均匀包裹,成胶过程对细胞无影响,非常适合细胞的三维培养。这两类水凝胶都为可注射类,可应用于细胞治疗、药物控释等领域。
  • 摘要:天然生物高分子材料壳聚糖(CTS)作为构建组织工程支架的常用材料已被通过不同的途径电纺成纳米纤维结构.然而,通常制备的壳聚糖纳米纤维耐水性能不佳,影响应用时的纤维形态;同时,壳聚糖的湿态力学性能较低,难以满足组织工程对生物材料支架的力学性能要求.针对上述问题,本研究采用天然交联剂—京尼平来交联壳聚糖纳米纤维,并对交联后的纳米纤维进行理化和生物相容性进行评价,以求发展一种性能优良的组织工程支架.用京尼平为交联剂,戊二醛为对照,对壳聚糖纳米纤维进行化学交联。通过扫描电镜观察交联前后壳聚糖纳米纤维形貌:红外光谱检测交联剂对壳聚糖的化学交联作用;X-射线衍射分析结晶性;并检测纳米纤维交联前后的溶胀度和降解性等理化性能;最后,对交联前后的纳米纤维的细胞/生物相容性评价。研究结果表明,与传统交联方法制作的壳聚糖纳米纤维相比,本实验采用京尼平可以较好提升壳聚糖纳米纤维的各项理化性能并具有较好的细胞/生物相容性,这为研究制备基于壳聚糖的一类新型仿生纳米纤维支架提供了可能。
  • 摘要:目的:第三代生物材料不仅要求材料能够生物可降解,而且要求材料能够促进材料与细胞之间的相互作用,从而促进机体自身的修复.导电高分子在电刺激下可以调控细胞的行为,但是导电高分子材料用于组织工程的最大缺陷是他的不可降解性.合成一系列具有生物可降解性的导电高分子材料水凝胶及多孔管状支架,并通过大分子构造来调控这些聚合物的导电性、亲水性、热性能、机械性能、降解性能,来满足不同组织工程的需要.rn 方法:通过结合导电高分子的导电性和脂肪族聚酷的可降解性,通过化学手段合成了一系列具有线性、星形、超支化和交联结构的大分子构造的可降解导电性聚合物,并通过溶液浇铸/粒子沥滤的方法制备了电活性可降解的多孔管状支架,并对这些材料结构和性能进行了全面的表征。rn 结果:成功合成了具有不同大分子构造的可生物降解导电性聚合物,并把它们制备成多孔管状支架,这些材料具有可以调控的导电性、亲水性、热性能,并具有较好的细胞相容性。rn 结论:得到一系列新型大分子构造的可生物降解性导电聚合物和管状支架,并成功利用大分子构造来调控可降解导电聚合物的性能来满足不同组织工程对材料性能的需求。这些可降解导电高分子材料在心脏、神经、肌肉和骨骼组织工程中具有潜在的应用价值。
  • 摘要:目的:动物源性材料已被广泛应用于组织工程和再生医疗领域.动物组织内广泛存在一种含有半乳糖基糖蛋白或糖脂肪的细胞膜抗原(Gal抗原),这种抗原由于人类的半乳糖基转移酶基因(a-1,3-GT)存在两个碱基错位不表达在人类组织.因此,动物源性材料中的Gal抗原成为引起人体强烈免疫排斥反应以及慢性免疫毒性反应和钙化的主要原因,而这种特殊的免疫毒性无法用野生型动物来评价.本研究旨在研发一种模拟人体不表达Gal抗原的模型动物,用于动物源性材料或异种器官的免疫毒性评价.本报告将介绍研发模型动物时重组a-1,3-GT-/-小鼠胚胎细胞(C57 ES)的构建.rn 方法:将PCR扩增的小鼠a-1,3-GT基因(GGTA1)功能区(Exon9)的上游同源片段、抗生素耐药基因(Neon-PA)片段和下游同源片段经过重复亚克隆、得到pL452-A-Neon-B质粒,再将其电转至含细菌人上染色体(BAC)的细菌进行重组,最后亚克隆进携带同源臂的pDTA-GGTA1下游载体,构建打靶载体。利用同源重组方法,将打靶载体导入C57BL小鼠来源的胚胎干细胞,置换野生型小鼠胚胎干细胞的半乳糖基转移酶基因,获得重组干细胞仁阳性克隆);然后将重组干细胞导入鼠的囊胚中,再将此囊胚植入假孕母鼠体内,使其发育成嵌合体小鼠;再经与野生型回交获得F1代杂合子,杂合子之间交配繁殖即可得到基因敲除的纯合子模式小鼠。rn 结果和结论:利用BAC重组技术成功构建了pDTA-GGTA1-Neon重组载体。将此打靶载体进行ES细胞转染后成功获得了携带a-1,3-GT+/-的C57 ES阳性克隆。
  • 摘要:骨细胞占骨组织中细胞比例的90%,长期被认为是相对静止的细胞,近年研究发现骨细胞是应答机械力刺激的主要感应细胞,通过胞浆突起在骨组织中形成三维的网络结构,传递信息,对维持骨代谢的平衡起至关重要的作用.间隙连接蛋白是位于骨细胞轴突上的力学感受蛋白,感受力学刺激,并将力学信号转化为分子信号,与骨组织表面的成骨细胞、破骨细胞进行胞间的信号传递.Connexin 43(Cx43)是骨细胞中最主要的间隙连接蛋白,能调节骨细胞的功能,在机械力刺激下的骨改建中发挥作用,但其具体的作用机制还不太清楚.本研究的目的是观察流体剪切力刺激下骨细胞中Cx43的表达及其与骨细胞内信号分子传导和骨细胞的功能之间的相互关系.研究表明:流体剪切力影响骨细胞的间隙连接蛋白Cx43的表达,并与力值大小相关。间隙连接蛋白Cx43表达的变化影响的骨细胞凋亡信号。间隙连接蛋白Cx43表达的变化影响骨细胞对成骨和破骨细胞分化的调节。
  • 摘要:目的:研究组蛋白去甲基化酶FBXL11在间充质干细胞分化中的功能。rn 方法:使用FBXL11 ShRNA,FBXL11过表达方法观察FBXL11在根尖牙乳头干细胞和骨髓间充质干细胞体外诱导分化中的功能,并观察这些细胞移植入裸鼠体内后对成骨的影响.rn 结果:利用FBXL11ShRNA抑制FBXL11表达后,根尖牙乳头干细胞和骨髓间充质干细胞向成牙本质/骨方向分化增强,移植入裸鼠体内的细胞成牙本质/骨也强于空白对照组,而过表达FBXL11则导致根尖牙乳头干细胞和骨髓间充质干细胞向成牙本质/骨方向分化减弱,移植入裸鼠体内的细胞成牙本质/骨少于空白对照组.rn 结论:FBXL11抑制间充质干细胞成牙本质/骨分化.
  • 摘要:双网络水凝胶具备较高力学强度,可部分克服普通水凝胶力学性能较差的缺点,有望作为软骨组织工程支架材料;但其制备过程涉及小分子单体及较苛刻反应条件,细胞毒性大,其作为支架材料的应用受到限制.本研究探索合适的双网络水凝胶支架材料制备及细胞三维包覆技术,并初步评价该方法对细胞的影响.分别以聚(2,2-二甲基-三亚甲基碳酸酯)-聚乙二醇-聚(2,2-二甲基-三亚甲基碳酸酯)二丙烯酸酯和甲基丙烯酸缩水甘油酯-透明质酸衍生物为第一和第二前驱体,两步光聚合制备双网络水凝胶;包覆原代猪关节软骨细胞,体外培养三周.通过压缩实验研究双网络水凝胶包覆软骨细胞前后的力学性能;使用活/死细胞荧光染色检测细胞在不同时间点的存活率,生化检测和免疫荧光染色检测细胞外基质分泌情况.本研究所制备的双网络水凝胶不仅具有与软骨组织相当的强度,而且能促进软骨细胞分泌软骨组织细胞外基质。该双网络水凝胶及其制备技术拓展了双网络水凝胶在组织工程中的应用。
  • 摘要:目的:家蚕丝素蛋白由于其独特的力学性能和良好的生物相容性、降解性和稳定性,目前已成为组织工程领域引人注目的一类特殊生物材料.而海洋贻贝足丝粘附蛋白具有极强的粘附功能,因此,本研究为了提高丝素蛋白的细胞粘附性能,在家蚕丝素蛋白溶液中加入海洋贻贝足丝粘附蛋白,制备家蚕丝素蛋白与海洋贻贝粘附蛋白的复合生物材料支架.rn 方法:把家蚕丝素蛋白和海洋贻贝粘附蛋白按不同的比例混合,溶解于六氟丙酮(HFA)制备成溶液,利用静电纺技术将其加工成生物材料支架.rn 结果:通过SEM观察表明,家蚕丝素蛋白和海洋贻贝粘附蛋白混合溶液,通过静电纺丝可以得到生物材料支架;细胞培养结果证明其具有细胞粘附性能。rn 结论:利用静电纺丝技术得到具有细胞粘附性能的蚕丝素蛋白/海洋贻贝粘附蛋白的复合生物材料支架。
  • 摘要:在骨缺损和畸形的整复治疗中,可注射型骨组织工程材料可以微创注射重塑畸形外观和填塞任意形状的骨缺损.高分子有机天然材料具有良好的生物相容性和可降解活性,制备成凝胶可成为具有可注射特性的骨组织工程支架材料.本文介绍海藻酸钠/壳聚糖可注射组织工程支架材料的制备方法.海藻酸钠和壳聚糖同为天然来源的具有良好生物相容性和降解活性的生物高分子材料,二者交联组分比单一组分具有更好的细胞亲和性,提高细胞结合密度并维持良好生长状态。以聚阴离子海藻酸钠和聚阳离子壳聚糖二者互为交联剂交联,避免使用某些交联剂不易清除造成的细胞毒性,形成的复合凝胶具有良好的可塑性和可注射特性。经必要的理化和生物相容性验证符合后可以作为可注射组织工程骨支架材料用于进一步的实验研究。
  • 摘要:目的:骨髓基质细胞是骨髓中存在的一种具有多向分化潜能的多能干细胞,在特定培养条件下,可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及成肌细胞等.本实验通过对家兔骨髓基质细胞体外分离培养、增殖活力与成骨活性检测,探讨骨髓基质细胞体外分离培养条件与生长特征,为其用于骨缺损组织工程修复的研究奠定基础.rn 方法:利用全骨髓贴壁培养法分离培养新生兔骨髓基质细胞;通过台盼兰染色和细胞形态观察判定骨髓基质细胞的性状与增殖活力;对骨髓基质细胞进行体外钙化诱导培养,通过钙化结节Von Kossa染色,检测骨髓基质细胞的成骨活性.rn 结果:全骨髓贴壁培养法分离培养的骨髓基质细胞为不规则星形、多角形,呈条索装、团块状贴壁生长,细胞性状较为稳定,生长旺盛,分离培养后第3天即开始进入快速增长期,平均细胞倍增时间约为3.4天。Von Kossa染色显示,经钙化诱导培养三周后,有较多明显的低透光度钙化结节形成;未进行钙化诱导的骨髓基质细胞中亦存在少量体积较小的钙化结节,说明骨髓基质细胞具有诱导分化成骨的特性。rn 结论:新生家兔全骨髓贴壁培养法可获取数量充足的、增殖活力与成骨分化活性较好的骨髓基质细胞,拟作为种子细胞用于后续的领骨缺损组织工程修复方法研究。
  • 摘要:目的:比较观察年轻小鼠和自然衰老小鼠的骨质特征及骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)的生物学功能.rn 方法:分别取12月龄和2月龄C57BL/6J小鼠,Micro-CT活体扫描两组小鼠股骨骭骺端,三维图像重建后观察其骨质特征;体外分离、培养两组小鼠的BMMSCs,通过MTT、克隆形成和成骨诱导观察其增殖、自我更新和成骨分化能力;并采用实时定量基因扩增荧光检测系统(Real-time PCR)对成骨诱导14d后的BMMSCs重要相关基因OCN进行检测.rn 结果:与2月龄小鼠相比,12月龄小鼠出现了骨衰老症状,主要表现为骨密度及骨小梁强度下降;BMMSCs的增殖、自我更新和成骨分化能力以及OCN mRNA表达水平均明显降低.rn 结论:BMMSCs可能在骨衰老中发挥了重要作用。
  • 摘要:探索使孤雌胚胎干细胞向成骨细胞定向诱导分化的条件,为骨组织工程寻找理想的种子细胞.将建系的孤雌胚胎干细胞在体外稳定培养,通过碱性磷酸酶染色,全能性表面抗原SSEA-1、端粒酶和细胞因子的免疫组化,RT-PCR检测全能性转录因子,孤雌胚胎干细胞体内外分化检测验证KM×129/SV孤雌胚胎干细胞系的全能性.通过向培养液中添加地塞米松、β-甘油磷酸、维生素C等成骨细胞诱导因子诱导孤雌胚胎干细胞向成骨细胞定向分化,通过RT-PCR检测成骨细胞特异性基因、透射电镜、茜素红、von Kossa染色等方法检测孤雌胚胎干细胞向成骨细胞定向分化的情况.将诱导后的孤雌胚胎干细胞接种于三维支架材料珊瑚上,通过激光共聚焦显微镜和扫描电镜观察细胞在材料上的生长情况.建立的孤雌胚胎干细胞系在体外可以稳定培养并传代,具有与胚胎干细胞相似的全能性,通过直接诱导的方法可以将孤雌胚胎干细胞定向诱导为成骨样细胞。
  • 摘要:目的:采用熔融纺丝方法制备可降解PGA纤维,并对PGA纤维的理化性能、体外降解性能和生物学性能进行检测.rn 方法:将PGA原料干燥抽真空后,在熔融液化状态下喷丝,并进行牵伸,形成纤细而具有一定力学强度PGA长纤维.采用单纤强力仪测定纤维的断裂强度,以PBS为介质,通过测定纤维质量损失率,pH值以及SEM观察检测PGA纤维的体外降解性能.将成纤维细胞接种在PGA纤维上,采用SEM观察PGA纤维的生物相容性.rn 结果:PGA纤维断裂强度大于4cN/dtex,PGA纤维在4周后开始加快降解,质量损失率大于30%,12周降解率达到65%。pH值随降解时间的增加持续下降。SEM可观察到,在降解过程中,纤维表面出现断裂层,直至大量断裂的细小纤维。细胞在纤维表面紧密粘附,分泌大量的细胞外基质。rn 结论:通过熔融纺丝制备的PGA纤维表面光滑均匀,力学强度高,细胞相容性好,是组织工程领域较好的可降解聚酯材料。
  • 摘要:基于自体软骨细胞移植技术(Autogenous Chondrocyte Implantation-ACI)与细胞膜片技术(Cell Sheet)开发自体软骨细胞膜片移植技术(Cell Sheet-Autogenous Chondrocyte Implantation),探讨和研究该技术修复膝关节软骨缺损的临床效果和临床应用的可行性,为临床软骨损伤修复提供新的治疗技术.体外分离不同动物以及人软骨细胞,建立软骨细胞体外扩增培养及膜片制备技术体系;采用RT-PCR、组织学染色、免疫组化等方法,完成软骨细胞及软骨细胞膜片体内外不同条件下的评价;建立不同动物软骨损伤模型,完成细胞膜片移植技术对软骨损伤有效性评价体系,并完成软骨细胞膜片安全性评价.利用自体软骨细胞膜片移植术进行治疗,术后进行严格的康复训练.术后定期进行随访,术前及术后6月Lysholm主观评分膝关节MRI扫描.自体软骨细胞膜片技术能够完成患者软骨损伤后的治疗,实现损伤软骨组织再生及功能恢复,提高患者工作及生活质量,是修复关节软骨损伤性疾病的一种可行的方法。
  • 摘要:目的:作为可注射性心肌组织工程的支架材料,OPF水凝胶心梗部位注射后具有明显的抑制纤维化、改善心室重塑的作用,然而其机制尚未明确.Cardiac fibroblasts(CF)向Myofibroblast(MF)的转分化(CFT)在心梗后的心室重塑中发挥重要作用.本研究探讨OPF水凝胶对CFT的作用及其携带细胞及生长因子修复损伤心肌的效果.rn 方法:将分离培养的CF与OPF及OPF降解产物(富马酸)体外共培养研究其对CFT的影响,并利用OPF水凝胶携带报告基因标记的iPS-CM及bFGF小鼠心梗部位移植研究其修复作用.rn 结果:OPF及富马酸均能够通过下调TGF-β介导的SRF信号来降低α-SMA的表达,从而抑制CF的转分化作用,且添加bFGF后,上述作用进一步增强。心梗移植后,OPF水凝胶能显著降低心梗部位的CFT及胶原沉积。以OPF水凝胶作为载体携带iPS-CM及bFGF注射到心梗部位后能够显著提高细胞在心梗部位滞留及存活,促进心梗区域的血管化,减少心梗面积并显著改善心梗的心脏收缩功能及心肌活性。rn 结论:OPF水凝胶通过抑制心肌成纤维细胞转分化改善心梗后的心室重塑。以其为载体携带iPS-CM及bFGF具有明显的心梗修复作用。
  • 摘要:目的:为解决目前肝脏组织工程研究中肝细胞可植入量不足和移植后肝细胞血供不足的问题,利用去细胞化天然肝脏支架初步构建新型门静脉植入型组织工程肝脏(Tissue engineering liver,TEL).rn 方法:获取Lewis大鼠肝脏右中叶,通过预留门静脉交替灌注离子型和非离子型去垢剂完成肝脏去细胞化,获得天然去细胞化肝脏支架.利用层层自组装(LbL)技术对所获肝脏支架进行内表面肝素抗凝修饰.然后将天然肝脏支架与经过24小时摇动培养形成的Lewis大鼠原代肝细胞球进行复合培养,构建完成门静脉植入型TEL.测定TEL和天然肝脏中的DNA含量,计算TEL中肝细胞量.最后将构建完成的TEL植入90%肝切除Lewis大鼠爆发性肝衰模型门静脉系统中,检验TEL体内肝功能发挥和治疗情况.rn 结果:通过灌注去细胞化过程获得具有完整三维结构,同时保留肝脏原有血管系统的肝脏支架。经过LbL支架内表面肝素抗凝修饰,天然肝脏支架在接入大鼠血液循环系统后未出现凝血和血栓。与原代大鼠肝细胞球复合培养,肝细胞在支架内部贴附生长。天然支架内部能容纳大鼠天然肝脏10%的肝细胞量。完成TEL构建后,TEL可成功植入大鼠门静脉系统中。植入大鼠门静脉系统的TEL,其内部肝细胞均处于门静脉血液灌流中,可表达多种肝脏特异性功能基因,合成白蛋白和糖原;TEL可暂时降低爆发性肝衰模型大鼠血氨浓度,使其生存时间由16小时延长至72小时。rn 结论:利用去细胞化天然肝脏支架成功构建了新型门静脉植入型TEL。它可能成为一种潜在的肝移植替代疗法。
  • 摘要:目的:介绍几种组织修复产品的产业化研究进展.rn 方法:利用深低温冷冻、冷冻干燥及去抗原技术研究开发了同种异体骨修复材料、同种异体骨椎间融合器、同种异体生物衍生肌腱、SIS生物补片及细胞富集器等组织修复材料及产品.对产品的理化性能、生物学性能及力学性能进行了系统研究和临床验证.其中,有的产品已获得SFDA注册证并已投放市场,也取得了较好的经济效益和社会效益.rn 结果:国外同种异体及异种异体移植物的产品开发及临床应用己有较长的的历史,其技术及产品安全性己得到证实。本单位研制的同种异体骨修复材料、同种异体骨椎间融合器、同种异体生物衍生肌腱、SIS生物补片及细胞富集器等产品具有良好的理化性、生物学性能及力学性能不产生免疫排斥反应,是很好的组织修复材料,具有良好的市场前景和发展空间。rn 结论:经深低温冷冻、冷冻干燥及脱细胞等工艺制备的组织修复产品具有良好的生物安全性及有效性,是具有良好前景的植入物产品。
  • 摘要:目的:探讨去分化脂肪(dedifferentiated fat,DFAT)细胞向心肌细胞分化的可能性,旨在为治疗心肌梗死、心脏生物起搏器的构建提供新的种子细胞.rn 方法:用天花板培养法分离获得大鼠DFAT细胞并鉴定;5-AZA、EBIO、与新生鼠窦房细胞共培养等方法对DFAT细胞进行诱导,观察形态变化,用RT-PCR和免疫细胞化学检测心肌和起搏细胞标记物,并将其与静息心室肌细胞共培养观察其带动心肌细胞跳动的情况.rn 结果:获得的DFAT细胞与间充质干细胞类似,可以表达CD29, CD44和CD90,但不表达CD31和CD34,可以向脂肪细胞和骨细胞方向分化。在培养中未发现自发性搏动的细胞。5-AZA、EBIO、与新生鼠窦房细胞共培养诱导后,细胞变大,并呈长梭形,表达心脏早期标志基因GATA-4和Nkx2.5、心肌相关标志基因HCN、Cx和Tn等;免疫细胞化学显示诱导后细胞可以表达起搏细胞相关标志物HCN,Cx和Tn;5-AZA诱导的细胞与静息心室肌细胞共培养后未发现自主搏动的细胞,而与窦房结共培养的DFAT细胞可以带动静息心室肌搏动。rn 结论:5-AZA、EBIO与窦房结细胞共培养都可以将DFAT细胞诱导分化为具有一定心肌细胞、起搏细胞表型的细胞,而与窦房结细胞共培养的DFAT细胞还可以带动静息心室肌搏动,更接近起搏细胞。
  • 摘要:目的:在体外、器官培养和体内三个层面上研究生长激素(GH)和骨形态发生蛋白9(BMP9)对间充质干细胞成骨分化的影响,并试图探讨其中的分子机制.rn 方法:通过RT-PCR检测BMP9腺病毒感染的C3H10T1/2间充质干细胞中GH表达的表达变化;用 Ad-GFP/Ad-RFP(对照组),Ad-GFP/AdR-GH,Ad-BMP9/Ad-RFP,Ad-BMP9/AdR-GH,这4组腺病毒分别感染C3H10T1/2细胞,并检测成骨细胞分化标记物碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素和骨桥蛋白的表达以及基质的矿化作用;用上述4组病毒感染胚胎期E18.5天的小鼠后肢,将钙黄绿素作为荧光指示剂追踪骨发育过程,并测量记录胫骨横截面面积,进行统计学分析和组织学分析;将感染病毒的细胞注射到裸鼠皮下,4周后取出移植部位进行微型计算机断层扫描,并进行三维重建和统计分析,以及组织学分析;通过免疫共沉淀和小分子抑制剂探讨分子机制.rn 结果:GH是MSCs细胞中BMP9信号的一个直接下游靶点,GH与BMP9发生协同作用,共同促进C3H10T1/2细胞体外成骨分化;GH能促进BMP9介导的生长板的软骨内成骨;干细胞移植实验证明,GH加快了BMP9诱导的基质矿化作用;GH与BMP9通过激活MSCs中的JAK/STAT/IGF1信号通路协同促进间充质干细胞的成骨分化,且GH和BMP9之间的协同成骨活性能被JAK/STAT的抑制剂阻断。rn 结论:生长激素与BMP9存在协同作用,通过激活JAK/STAT/IGF1信号通路促进间充质干细胞的成骨分化。
  • 摘要:目的:矿化胶原是骨和牙等天然矿化组织承担应力并提供强度的主要成分.由于纤维内矿物质被证实在天然矿化组织的机械性能中起主要作用,因此本研究的目的是探讨纤维内矿化对胶原支架纳米力学性质和生物相容性的影响,为制备理想的组织工程支架材料奠定基础.rn 方法:分别采用“bottom-up”及“top-down”两种矿化方式对Ⅰ型胶原分子进行组装,利用原子力显微镜(AFM)原位检测胶原组装过程及纳米结构特征,同时通过透射电子显微镜(TEM)判定矿物质结晶程度.待自组装完成后,利用PeakForce QNM技术比较两种矿化方式对胶原支架纳米机械性能的影响,并利用成骨样MG-63细胞系检测矿化胶原对细胞增殖与分化的影响.rn 结果:AFM和TEM显示,利用“bottom-up”方式组装的纤维内矿化胶原呈现67-nm的周期性横纹结构,且板状晶体在纤维内的排列方向与纤维长轴平行;而在“top-down”矿化方式中,针状晶体无规则地排列在纤维表面。两种矿化方式均能提高胶原支架的杨氏模量,其中“bottom-up”矿化方式作用更显著。细胞实验提示,与胶原支架和纤维外矿化胶原支架相比,纤维内矿化胶原支架更能促进细胞的增殖与分化。rn 结论:“bottom-up”矿化方式能在纳米尺度上组装与天然矿化胶原类似的等级结构,且这种矿化模式能改善胶原支架的纳米力学性质和生物相容性。
  • 摘要:目的:针对常规胶原提取方法存在的胶原降解严重,分子量范围宽以及类型均一性差,并导致其应用存在局限性等问题,考察了羟脯氨酸含量对猪皮胶原热稳定性和热变性动力学的影响,研究出一种类型均一、羟脯氨酸含量可控的胶原制备方法.rn 方法:在40℃条件下采用流动提取的方式从脱脂猪皮中提取胶原,分时取样后并对提取的胶原进行氨基酸组成分析,采用DSC法测定不同羟脯氨酸含量胶原的临界变性温度,并进行热变性动力学分析.在此基础上采用多级逆流提取结合酶解方法提取胶原.采用亲和层析的方法进行胶原蛋白类型分离,利用生物质谱特征多肽法进行胶原的类型识别.rn 结果:在多级逆流提取过程中,整体上原料和提取的胶原溶液移动方向相反且存在温度梯度,物料停留时间可控。多级逆流固液萃取实验结果表明:与传统方法相比,多级逆流提取方式可以将溶出的蛋白及时移出,避免长时间变性处理导致胶原随机降解。在最佳固液比例、温度及梯度、pH、水相流速以及停留时间的条件下可获得未降解胶原,通过亲和层析法获得了类型均一的Ⅰ型和Ⅲ型胶原。rn 结论:SDS-PAGE分析结果表明提取出的胶原中不含分子量低于100kDa的组分,a,b和g比例与Sigma样品一致。质谱检测结果表明I型胶原中不含其它类型胶原。
  • 摘要:目的:在分析天然心肌组成与结构特点的基础上,针对心肌组织工程体外构建中的血管化和有序组装问题,提出了组织工程心肌仿生构建的工艺路线.此工艺的主要特点在于,模拟天然心肌的材料、结构特点,构建具有微观定向结构及多通道结构的组织工程心肌结构体,并设计制造生物反应器,进行体外的培养训练,并进行了结构体的性能表征和评价.rn 方法:设计了基于胶原/壳聚糖/连接蛋白的仿生材料体系,基于模铸工艺制造具有多通道结构的组织工程心肌支架,基于具有温度梯度场的定向凝固热致相分离工艺制造具有定向结构的组织工程心肌支架,并种植乳鼠心肌细胞,设计不同种生物反应器,对构建的组织工程心肌结构体进行了体外培养训练,并进行生物学评价。rn 结果:设计的材料体系具有良好的生物相容性,多通道结构实现了心肌细胞在通道周围的高密度种植和连接,定向结构有效促进了心肌细胞的定向排布与连接。体外训练结果表明,力学训练可促进心肌细胞沿应力方向的连接和排布,体外的电刺激最终实现可控的一致性收缩。rn 结论:本文提出了组织工程心肌仿生构建工艺路线和平台,同时,也为其他软组织的体外构建提供方法和理论基础。
  • 摘要:目的:大段骨缺损后构建的组织工程骨中间的营养供应是影响其修复效果的重要因素之一,其根源是缺乏有效的血液供应,如何在早期即可具有良好的血管形成是研究者追随的目标.通过VEGF缓释和周期性压应力来协同处理血管内皮细胞并观察其变化,为探讨新的织工程骨血管化策略提供实验依据.rn 方法:将多聚赖氨酸包被的VEGF藻酸盐缓释微球与血管内皮细胞共培养,通过模拟山羊步态的周期性压应力刺激仪来作用于VEGF藻酸盐缓释微球,观察缓释的VEGF和血管化策略对内皮细胞的效应.rn 结果:通过累计释放曲线观察到周期性的压应力可以促进VEGF的释放,缓释的VEGF可以促进血管内皮细胞的增殖,缓释的VEGF和周期性压应力可以促进内皮细胞分泌MMP-2,MMP-9,Flk-1,这些均与早期的血管化密切相关。rn 结论:缓释的VEGF和周期性压应力可以促进内皮细胞的增殖和加速其分泌早期血管形成相关的金属蛋白质酶和受体,可能具有加速组织工程骨血管化的效应。
  • 摘要:目的:如何标记体外分离的干细胞,并实现干细胞的体内追踪是干细胞组织工程和干细胞基础研究的核心问题之一.旨在建立一种高效、简便的利用超顺磁纳米粒子体外标记脂肪干细胞(ASC)的方法.rn 方法:利用贴壁培养法从小鼠腹股沟脂肪中分离小鼠脂肪干细胞进行体外培养,利用流式细胞仪检测脂肪干细胞CD11b、CD44和CD90表达情况.利用细胞膜穿透肽修饰超顺磁纳米粒子,并利用修饰后的超顺磁纳米粒子标记体外分离的脂肪干细胞.利用生化手段研究超顺磁纳米粒子标记对脂肪干细胞的多功能性以及定向分化能力的影响.利用核磁共振成像技术追踪标记的脂肪干细胞在体内的分布情况,以及研究标记后的脂肪干细胞在体内的分化情况.rn 结果:90%的脂肪源干细胞可成功被标记;标记超顺磁纳米粒子对脂肪源干细胞的增殖和细胞周期无影响;流式细胞数据表明对脂肪干细胞的多功能性的维持无影响。油红O染色和流式细胞检测表明,标记策略对脂肪干细胞向脂肪细胞和神经细胞的定向分化能力无影响。rn 结论:超顺磁纳米粒子可以作为示踪剂在体外标记脂肪干细胞,为干细胞的体外标记和体内追踪提供了新的策略。
  • 摘要:生物反应器是组织工程椎间盘体外培育的关键设备,其技术的不断发展和完善为组织工程椎间盘的体外培育提供了更广阔的技术平台.自行研制了一种智能化组织工程仿生培育系统,在这个系统中气-液和液-液组合式交换器是一个重要组成部分,该交换器主要是根据肺膜交换原理和肾过滤原理,并应用中空纤维半透膜制成的.本次实验目的就是针对交换器的性能进行检测,继而为整个生物反应器的构建和后续实验提供主要理论和条件支持.整个组合式反应器是由膜式氧合器氧、透析器、伸缩泵和管路系统组成。为了验证其物质交换性能和气体交换能力,以DMEM/F12培养基作为循环液,并向其中注入500μL乳酸,以高糖培养基作为新鲜液并加入1OmL氨基酸,目的在于使两侧的在细胞或组织培养中起重要作用的物质存在一个明显的浓度差,以便验证其交换性能。在循环一侧充入配好的循环液,向循环另一侧充入配好的新鲜液,并顺序充入CO2和N2,将变容伸缩泵的行程设定为5mm.频率设定为0.2Hz,并于开始循环和通气后的第Omin,1min,2min,3min,4min,5min,1Omin,15min,20min,25min,30min时用注射器抽取循环培养液和新鲜培养液,行葡萄糖含量检测、总氨基酸检测、乳酸检测和血气分(着重PO2观察)。结果表明,膜式氧合器氧和透析器的交换效果良好,且交换速度快,可以用于物质和气体交换。并为后续体外生物反应器中组织工程椎间盘培育提供了基础。
  • 摘要:尿失禁的手术治疗常用尿道中段悬吊术,其植入的吊带材料为聚丙烯等人工合成的聚合物,此类产品存在严重的近期排异反应和远期侵蚀反应.突破目前寻找合成材料研究的局限,采用网状蚕丝编织物用于尿失禁的治疗.网状蚕丝编织物的理化性能结果表明,它具有良好的力学性能,达到疾病治疗所需要的力学要求。生物学性能表明,网状蚕丝编织物无细胞毒性、不会引起宿主的迟发型超敏反应、无皮内刺激反应、无遗传毒性、体内植入后,与周围组织相容性良好。证明网状蚕丝编织物具有良好的生物安全性能。大鼠尿失禁动物模型研究表明,经过网状蚕丝编织物处理的大鼠,体内植入12周后LPP值接近正常组,且显著高于未处理的空白对照组。网状蚕丝编织物具有良好的生物相容性和尿失禁治疗的有效性。
  • 摘要:目的:构建类似天然结构和功能的管状结构,用于血管生理、病理基础研究及组织工程.rn 方法:首先制作经过预拉伸的双层弹性膜,然后利用微流控通道先在平面弹性膜基底上图案化一层修饰了生物素的平滑肌细胞,在其上面再修饰一层修饰了链霉亲和素的血管内皮细胞,当两层细胞生长并完全覆盖好平面膜表面后,将预拉伸的弹性膜释放,弹性膜在回缩应力作用下卷曲,形成带有多层细胞的管状结构.rn 结果:建立了一种可以在平面上构建多层细胞的方法,在此基础上将其由二维平面结构形成包含多种细胞的三维多层管状结构,可以最大程度地模拟大血管的天然结构。该结构的优点是尺寸可控、材料来源广泛、操作简单、省时(3-5天)、细胞精确定位等。rn 结论:建立的方法可以模拟各种在体内自然存在的管状结构,不但可以用于研究血管内的基本生理病理过程,而且并有望应用于组织工程。
  • 摘要:牙发育有赖于上皮及其下间充质之间的序列性交互性的诱导信号.因此,目前牙组织再生工程的各种尝试都有着共同特点,即重建和模仿牙发育过程中细胞和信号分子的变化.观察体外培养的人牙源性间充质细胞(胚胎牙乳头细胞)对非牙源性口腔上皮的成釉向分化的诱导潜能以及生长因子在这个过程中的作用,以实现成釉细胞的再生.非牙源性口腔上皮分别与人胚胎牙源性间充质细胞或成人牙髓细胞进行二维共培养或在MatrigelTM中三维共培养.二维共培养1周后,收集细胞,提RNA,qPCR检测细胞角蛋白14和釉原蛋白mRNA的表达水平.同时包埋三维共培养的MatrigelTM细胞复合体,冰冻切片后免疫荧光检测细胞角蛋白14和釉原蛋白的表达.此外,qPCR检测人胚胎牙乳头细胞和成人牙髓细胞FGF3,WNT5a的表达水平,同时利用高通量qPCR构建了人胚胎牙乳头细胞核成人牙髓细胞的生长因子表达谱.体外培养的胚胎牙乳头细胞能够诱导非牙源性口腔上皮细胞向能够表达釉原蛋白的细胞分化,可能是钟状后期牙源性间充质表达FGF3和WNT5a对上皮细胞产生诱导作用。
  • 摘要:目的:使用快速成型(RP)技术制造的β-TCP支架联合兔成骨细胞进行体外灌注接种和培养以构建理想化的组织工程骨,探究其体内修复骨缺损的能力.rn 方法:以RP技术制备的可控微结构β-TCP支架为载体进行兔成骨细胞的灌注接种和灌注培养(PSPC),以静态接种和静态培养(SSSC)以及静态接种和灌注培养(SSPC)方法为对照,对比三种方法的细胞增殖和分布情况.将组织工程骨植入兔桡骨节段性骨缺损,加以缺损旷置、自体骨和单纯β-TCP支架为对照,通过影像学和组织学检查比较骨缺损的修复效果.rn 结果:FSPC组的葡萄糖日耗量、细胞活力和碱磷酶活性显著高于SSPC和SSSC组(P<0.05)且PSPC组的细胞数量高于SSPC和SSSC组(P<0.05)且细胞分布更均匀。植入兔桡骨缺损12周后自体骨组6例全部愈合(6/6), PSPC组有4例愈合(4/6)SSPC组有2例愈合(2/6),其余各组缺损均未愈合。PSPC组的新骨生成量和生成速度显著高于SSPC组、SSSC组和单纯β-TCP组(P<0.05)。新生骨主要分布在支架的近尺骨端,部分未降解的材料仍可见。rn 结论:RP技术制造的β-TCP支架联合灌注接种和培养系统使构建理想化的组织工程骨成为可能,然而尽管其修复节段性骨缺损的效果优于SSSC法和SSPC法,但仍低于自体骨。为了克服其植入后营养供应障碍,RP支架的降解性和体内血管化问题有待研究。
  • 摘要:目的:探讨低渗联合冻干技术改良制备脱细胞周围神经支架的可行性,检测其理化性能和细胞相容性.rn 方法:采用低渗联合冻干技术改良制备脱细胞神经支架,并进行组织学、扫描电镜、孔隙率及空隙直径测定、生物力学评估,MTT法分析支架浸提液毒性.分离兔脂肪干细胞(ADSCs),采用PKH-26标记,将标记后的ADSCs种植到支架上;用HE染色、荧光显微镜、Live/Dead荧光染色观察细胞在支架上生长、存活情况.rn 结果:组织学显示支架中无细胞碎片残留,层粘连蛋白、Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原免疫荧光染色阳性.扫描电镜显示支架内髓鞘、轴突等结构均消失,纵切面上可见平行排列的基底膜管,组织结构较为疏松,支架孔隙率为49.3%±9.8%,空隙直径为(17.6±3.7)μm.MTT法显示不同浓度支架浸提液与对照培养液对细胞增殖影响无统计学差异.HE染色、荧光显微镜及Live/Dead染色显示细胞在支架上存活及生长情况良好.rn 结论:低渗联合冻干技术改良制备的脱细胞神经支架,具有良好的孔隙率及空隙直径,良好的生物力学特性,无毒,细胞相容性良好,可作为一种更有利于细胞复合的神经支架材料。
  • 摘要:目的:使用合成材料制备血管组织工程支架是目前研究的热点.然而,采用左旋聚乳酸(PLLA)单一材料制备的纳米纤维血管支架质硬而且韧性较差,缺乏柔性和弹性,难以满足临床需求.本研究中,采用PLLA与弹性体左旋聚乳酸-聚ε-己内酯共聚物(PLCL,50:50)混合体系,制备一种既具有合适力学性能,又具有良好血液相容性的血管支架.rn 方法:利用热致相分离技术(TIPS)制备不同比例PLLA/PLCL(质量比,100:0到40:60)的复合纳米纤维血管支架.经过扫描电镜、拉伸力学性能测试后,选出最佳比例的PLLA/PLCL复合支架,对其进行肝素化处理后,检测血管支架表面体外蛋白吸附量,测试体外抗凝血性,分析肝素化对血管支架血液相容性的影响.rn 结果:当PLLA中加入PLCL时,复合支架微观上仍保持良好的纳米纤维结构。随着PLCL比例的提高,血管支架的拉伸强度从纯PLLA的0.16 MPa提高到PLLA/PLCL40:60时的3.6 MPa,断裂延伸率从8.9%提高到203%,显著提高了拉伸力学性能肝素化后支架亲水性显著提高,其表面的蛋白吸附量也明显低于未肝素化支架。体外抗凝血测试结果表明肝素化后血管支架的抗凝血性能得到很大提高。rn 结论:肝素化PLLA/PLCL复合纳米纤维血管支架不仅具有良好的拉伸力学性能和弹性,而且具有良好的血液相容性,在血管组织工程应用中具有一定的前景。
  • 摘要:哺乳动物视神经如同脑和脊髓一样,损伤后难以再生.因此,促进受损视神经再生一直是神经科学和眼科学的研究热点和难点之一,也可为脑和脊髓伤的修复提供一定启示.为此,近年来应用羊膜上皮细胞移植结合基因治疗、组织工程等方法在视神经损伤修复方面进行了一些探索.体外培养的大鼠羊膜上皮细胞具有一些干细胞的特性,用神经干细胞培养基能诱导成类似神经干细胞;转染碱性成纤维细胞生长因子的羊膜上皮细胞具有更强的生长能力和神经营养作用;羊膜上皮细胞种植于胶原海绵支架后增殖活跃,其特性未发生明显变化.在成年大鼠视神经横断伤后,伤区分别移植羊膜上皮细胞、羊膜上皮细胞诱导的神经干细胞、碱性成纤维细胞生长因子转染羊膜上皮细胞、胶原海绵羊膜上皮细胞复合体,能提高视网膜节细胞存活率,引导再生轴突长入伤区,促使少量轴突继续长入远段神经1~2 mm。虽然各种治疗方法均取得一定效果,仍未从根本上促使大量的轴突再生通过横断伤区,有待采用新的治疗策略,如持续增强受损视网膜节细胞低下的内在再生力以及综合治疗方法。
  • 摘要:目的:探索小鼠棕色脂肪干细胞(ASCs)向起搏样细胞诱导分化.rn 方法:取C57小鼠肩胛区棕色脂肪,用Ⅱ型胶原酶(0.1%)消化,裂解掉血细胞后,将离心沉淀的细胞用含15%FBS/DMEM完全培养基培养,每三天观察并换液.rn 结果:ADSCs贴壁后形态各异,第6天出现肌管样结构,第8天部分细胞开始节律性自主收缩;通过基因和蛋白的水平检测,发现细胞高表达Sarcomeric α-actin、TNTT、TNT I等心脏细胞标志,起搏细胞标志HCN2、HCN4起初也有表达,但随培养时间延长而降低,电生理检测以及药理学实验正在进行中.rn 结论:小鼠棕色脂肪ADSCs可以自发向起搏样细胞分化。
  • 摘要:目的:探讨视神经损伤后视网膜及视神经内神经营养因子Neuritin(又名CPG15)的时空表达变化规律,进而研究Neuritin蛋白对视网膜神经节细胞系的保护作用,为以Neuritin为靶治疗视神经损伤提供依据.提出采用Yasagil脑动脉瘤夹夹伤视神经可建立视神经不完全损伤模型。视神经损伤早期视网膜及视神经内Neuritin的瞬时高表达,随后下调并低于正常水平,提示为视神经损伤后视网膜节细胞大量死亡和轴突再生夭折的原因之一。Neuritin蛋白对损伤后RGCS的存活具有保护作用,通过抑制Caspase 3的表达减少其凋亡。
  • 摘要:目的:体外肿瘤模型被广泛应用在肿瘤生物学研究和抗癌药物筛分中.但传统二维平面培养模型缺乏体内三维细胞微环境的特征,动物模型缺乏人体特异的响应能力.现有体外三维肿瘤模型(如多细胞球状体和三维支架模型等)也难以模拟体内真实肿瘤的复杂生理结构和功能.细胞受控组装技术(又称细胞三维打印)可以根据设计的结构,可控地组装生物材料和细胞单元,高效地构建大尺寸非均质(多细胞)体外仿生结构体.本文将报道尝试利用细胞受控组装技术构建仿生三维体外肿瘤模型的初步研究.rn 方法:利用细胞受控组装机将明胶,海藻酸钠和细胞(分别用Hela和HepG2细胞)的混合液逐层的打印成设计的三维肿瘤细胞结构体,并进行体外培养。通过荧光染色技术和激光共聚焦显微镜观察结构体稳定性,细胞存活率和细胞形态。rn 结果:通过细胞受控组装构建的三维肿瘤细胞结构体具有约80%的细胞存活率。在后续体外培养中,结构体具有良好的结构稳定性和细胞活性,且通过对比发现三维结构体中的HepG2细胞形态与二维平面培养时具有明显差别。rn 结论:通过初步的结果表明,细胞受控组装技术有潜力构建更为仿生的三维体外肿瘤模型,有望应用在肿瘤病理学和抗癌药物筛分研究中。
  • 摘要:观察富血小板血浆(Platelet Rich Plasma,PRP)对体外培养的SCs生物行为学影响,并将去细胞同种异体神经复合PRP修复大鼠坐骨神经缺损,探讨其促进神经再生的可行性、疗效及作用机制.体外实验取纯化的大鼠SCs,将其分为实验组与对照组共6组进行处理,实验组以含20%、10%、5%和2.5%PRP的条件培养液干预,并设立空白对照组.于干预不同时间点采用CCK-8法测定SCs增殖活性情况,用PT-PCR方法检测细胞神经营养因子(NGF)和胶质细胞源神经营养因子(GDNF) mRNA表达的变化,ELISA检测SCs分泌NGF和GDNF的水平,Transwell小室检测各组SCs的迁移能力;体内实验选用56只SD大鼠随机分成4组,A组:自体神经移植组;B组:单纯去细胞神经组;C组:复合PRP组;D组:复合PPP(乏血小板血浆)组;术后不同时间点观察神经移植修复后的效果.结果表明,PRP可以促进SCs的分裂增殖,合成分泌NGF和GDNF以及迁移的能力,复合去细胞同种异体神经后可提高其修复周围神经缺损的疗效。
  • 摘要:目的:组织工程骨体内植入后的早期血运尚未建立,材料上复合的骨髓基质干细胞营养供给不足,成骨分化功能受限.针对该问题,尝试在组织工程骨体内植入部位局部长期灌注淫羊藿苷培养基,在营养供给的同时促进成骨分化,探索在体内环境下早期构建组织工程骨的方法.rn 方法:36只兔子随机分成A、B、C3组,制造1.5cm桡骨骨缺损,A组为BMSC复合β-TCP材料,并在植入处局部灌注浓度为10-6mol/L的淫羊藿苷培养基;B组为BMSC复合β-TCP材料,无局部灌注;C组为单纯β-TCP材料组,无BMSC复合及局部灌注.术后4周、8周、12周对骨缺损修复效果进行大体观察、影像学、骨密度、组织形态学评估,比较各组骨修复效果.rn 结果:大体观察、影像学观察、骨密度检测、组织形态学结果均显示,各时间点A组组织工程骨植入的成骨效果明显好于其他两组,其中第4周时差异最明显;而B组的成骨效果又明显好于C组。以上所有差异都具有显著性,P<0.05。rn 结论:局部灌注淫羊藿普培养基能够提高组织工程骨的体内植入效果,并在植入的早期效果更明显。
  • 摘要:目的:软骨细胞构建的组织工程软骨用于软骨修复取得良好的修复效果,但软骨细胞来源困难,为寻找适合于软骨组织修复的种子细胞,选择细胞来源广泛、分离培养方法简便的骨髓间充质干细胞(BMSC)及更易于产业化的脂肪间充质干细胞(ADSC)进行软骨损伤修复有效性验证.rn 方法:无菌采集2~4w幼龄兔骨髓及脂肪,分离原代BMSC及ADSC,传代培养至2~3代后制备细胞膜片,培养至膜片具有一定厚度及韧性后进行体内软骨损伤有效性验证.rn 结果:BMSC及ADSC细胞均可以制备厚度、韧性较好的细胞膜片,且两种细胞膜片原位软骨损伤修复效果良好,组织学切片结果显示修复部位为透明样软骨修复。细胞膜片修复软骨损伤恢复期短,4w可获得良好修复损伤部位。rn 结论:利用BMSC及ADSC作为软骨损伤修复的种子细胞可行,能够获得良好的修复效果。且ADSC比BMSC来源更广泛,取材容易,更容易实现产业化。
  • 摘要:目的:明确FGFR3对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖、BMSCs向软骨细胞分化的作用.rn 方法:利用(R3CKOf/f×CreERT2)小鼠,培养上述小鼠的BMSCs,Tamoxifen诱导敲除FGFR3并进行软骨分化诱导,采用细胞计数、定量PCR等手段检测细胞的增殖、分化情况.rn 结果:分离培养(R3CKOf/f×CreERT2)小鼠BMSCs,倒置显微镜下观察发现接种48h内基本上铺展呈小的短梭形或三角形,密度大时呈菊花状、漩涡状或平行排列.Tamoxifen (0.5μM)处理后,FGFR3敲除效率为60%.敲除FGFR3后对BMSCs的增殖没有影响;敲除FGFR3后BMSCs向软骨分化过程中软骨分化相关标记基因(Col10,Comp,Ihh,Mmp13)表达升高.rn 结论:以上的研究结果表明FGFR3对BMSCs的增殖没有明显作用,FGFR3可能抑制BMSCs向软骨细胞的分化。这为下一步构建FGFR3可控的组织工程软骨提供了实验基础和理论依据。
  • 摘要:目的:聚富马酸丙二醇酯(PPF)是一种在骨修复领域具有潜在应用前景的线形可降解聚酯材料,尤其是作为可注射型填充材料和骨组织工程支架材料已得到广泛的研究.PPF主链上双键的存在使其可以与N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)等单体进行共聚形成交联网状结构,但由于交联密度过高,材料脆性过大,限制了其使用.尝试将甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)作为共聚单体增韧改性PPF以改善材料性能.rn 方法:采用酯交换法合成PPF,并利用过氧化二苯甲酰热引发PPF和HEMA的共聚。测试不同共聚单体配比下,材料的化学组成、吸水性能以及湿态/干态机械性能并利用扫描电子显微镜观察固化交联后材料内部微观结构。rn 结果:通过HEMA与PPF共聚,相较传统的PPF-NVP共聚体系,能够有效改善材料的脆性,干态拉伸过程中样条的断裂伸长率可提高至10%左右。浸泡水之后,PPF-HEMA体系的模量下降,但韧性得到进一步增强,断裂伸长率达30%以上。rn 结论:HEMA共聚改性PPF是一种有效的提高材料韧性的方法,能够进一步拓展PPF在骨修复领域的应用。
  • 摘要:目的:利用组织工程学技术实现牙髓牙本质复合体的再生是目前牙髓治疗的新方向,而种子细胞和支架材料是其中的两大核心要素.本实验采用牙髓干细胞和胶原支架材料进行三维复合培养,以期在体内体外构建出组织工程化牙髓.rn 方法:采用酶消化法体外培养成人牙髓干细胞,通过免疫荧光染色和流式细胞术鉴定干细胞表面特异性抗原.将成人牙髓干细胞接种于细胞外基质胶原支架材料中,建立体外牙向分化诱导的三维培养体系,采用倒置相差显微镜、cck8、流式细胞术和qPCR等方法分别检测细胞在胶原支架材料中的形态、增殖、凋亡和分化情况.将牙髓干细胞-胶原支架复合体植入SD大鼠背部皮下,取样后进行HE染色及DSPP免疫组化染色,以观察牙髓组织的新生情况.rn 结果:成人牙髓干细胞Stro-1,CD146表达阳性,CD34,CD45表达阴性,具有间充质干细胞的表面标志特性。胶原支架材料具有良好的生物相容性,支持牙髓干细胞的增殖与牙向分化。牙髓干细胞-胶原支架复合体可以在大鼠体内形成牙髓牙本质样的组织结构。rn 结论:利用牙髓干细胞-胶原支架复合体制备组织工程化牙髓具有一定的可行性。
  • 摘要:目的:探讨鼠口腔黏膜固有层前体细胞(oral mucosal lamina propria progenitor cell,OMLPPC)在不同支架材料上的生物学特性.rn 方法:体外筛选培养OMLPPC,扩增培养,然后分别与胶原凝胶、陶瓷化骨、胶原-壳聚糖支架材料复合,利用扫描电镜、HE等方法,观察细胞在支架材料上体外生长情况;并分别移植入裸鼠体内,于4周、8周后取材,利用HE及Masson染色等方法观察OMLPPC复合支架材料在体内环境中的生长情况.rn 结果:体外环境中,细胞在胶原凝胶、陶瓷化骨、胶原-壳聚糖支架材料上都可以复层生长。体内环境中,胶原凝胶组,4周细胞在胶原凝胶内生长;8周细胞数量增加,未发现形成特殊结构;陶瓷化骨组,在体内4周生成基质样物质,8周形成典型的骨样组织;胶原-壳聚糖支架材料组,体内4周、8周在材料间隙内可见生长的细胞和胶原基质样成分。rn 结论:进一步证明OMLPPC的前体细胞特性,不同支架材料对其生物学行为具有重要影响,OMLPPC在特定环境中可以形成硬组织,因此可为组织工程骨或牙齿硬组织构建提供种子细胞。
  • 摘要:目的:研究根吸收不同时期乳牙牙髓干细胞(DDPSCs)的体外扩增与成骨分化能力的不同.rn 方法:根据根吸收长度将乳牙分为3组:S(早期)、M(中期)和F(晚期),从12颗乳切牙中分别分离培养DDPSCs.通过流式细胞仪和免疫荧光鉴定细胞表型,MTT细胞活性实验检测细胞增殖能力,并采用体外成骨诱导检测细胞成骨分化能力.rn 结果:DDPSCs表达间充质细胞表面分子CD146, CD105, CD29和CD90等。M组细胞增殖最快(Dunnett-T3,p<0.05)。成骨诱导3周以后,各组DDPSCs均有矿化结节形成,茜素红染色并进行半定量分析后发现F组形成钙结节最多(LSD-t,p<0.05)。rn 结论:本研究发现生理性根吸收过程中DDPSC、分化与增殖能力发生改变,吸收中期增殖较快,吸收晚期成骨分化能力较强。
  • 摘要:近年来,microRNAs(miRNAs)的发现将干细胞分化的调控研究引入转录后水平时代.已有研究表明,miRNA与Notch信号通路存在广泛的串话,其中miR-34a已被报道在多种疾病的发生发展中起到了重要的调控作用.Notch信号通路成员在根尖牙乳头干细胞SCAP中的分布模式及miR-34a与Notch信号通路串话调控细胞分化至今尚未见报道.分离培养SCAP细胞,常规PCR和免疫荧光染色分析Notch信号通路成员在SCAP细胞中的表达.利用Notch信号通路的激动剂JAG1重组蛋白和抑制剂DAPT处理体外培养的SCAP,实时定量荧光PCR检测miR-34a和成牙和成骨向分化各相关基因的变化.体外培养的SCAP转染miR-34a模拟物及抑制物,qRT-PCR及western blot检测Notch信号通路各成员及分化相关基因及蛋(DSPP,ALP,RUNX2,OSX,OCN,OPN)的变化.通过双荧光素酶报告基因检测验证miR-34a对NOTCH2及HES1的直接作用.研究表明,Notch信号通路抑制SCAP细胞成牙和成骨向分化,参与维持其未分化状态和自我更新。miR-34a通过识别并负性调控NOTCH2及HES1,与Notch信号通路串话促进SCAP的成骨和成牙向分化。
  • 摘要:随着牙齿形成机理研究的逐步深入及组织工程学的飞速发展,牙齿组织工程化已成为国内外所共同关注的课题,组织工程化牙齿被认为是好的生物学牙齿,它能够被重组到颌骨并且执行天然牙的正常功能包括受损后再生的能力.作为种子细胞来源的人牙髓细胞的研究也越来越受到重视.本实验通过组织块培养法培养人健康牙髓组织细胞,为本实验室开展牙髓组织工程研究提供种子细胞.结论:本实验采用组织块贴壁法成功分离培养和保存了人健康牙髓组织细胞。由于人牙髓组织位于空间有限的牙髓腔中,量少,细胞活性低且随着年龄增长而较早发生退形性变,实验取材的样本年龄较低。组织块培养法操作环节少,污染率低,对组织损伤小。但是,由于牙髓干细胞具有多向分化潜能:能分化成为包括成牙本质细胞、成骨细胞、软骨细胞等,因此目前牙齿组织工程中的种子细胞多采用牙髓干细胞。后续实验拟在对人牙髓组织细胞增殖活性和生物学特性进行深入研究的基础上,对牙髓细胞进行进一步分离提纯,得到牙髓干细胞,并且对牙髓干细胞进行相关生物学特性的鉴定,包括基质抗原-1等表面标志物的检测。为进一步进行牙齿组织工程研究做好种子细胞准备。
  • 摘要:制备聚乙烯亚胺-藻酸盐(PEI-alginate)纳米复合物携带BMP-2基因,利用转基因技术,通过宿主细胞表达BMP-2蛋白达到促进骨再生的目的.利用阳离子聚合物PEI与天然阴离子聚合物海藻酸钠通过静电作用构建了PEI-alginate纳米基因载体,并对其理化性质进行表征;将PEI-alginate纳米复合物与EGFP质粒混合后转染MC3T3-E1细胞,计算其转染效率;以明胶海绵为支架、分别吸附PEI-alginate/pBMP-2基因纳米复合物及PEI-alginate纳米复合物,植入大鼠颅骨缺损模型,于8周时处死大鼠,通过Micro-CT及组织学观察骨形成情况.本实验制备的PEI-alginate纳米复合物作为一种有效的基因载体,其携带BMP-2基因作用于体内,明显促进了骨缺损的再生修复,为今后转基因治疗口腔颌面部骨组织的损伤和缺陷提供了一条可行的方法。
  • 摘要:目的:使用自体细胞构建的组织工程皮肤是快速有效修复各类皮肤缺损的重要方法,而足够数量的种子细胞是成功构建组织工程皮肤的关键.尝试使用Cytodex-3微载体和高截面纵横比的旋转式生物反应器(RCCS)容器作为培养系统,大规模扩增人皮肤成纤维细胞.rn 方法:利用组织贴壁法从人皮肤中分离出人真皮成纤维细胞(hDFBs)进行体外培养,使用DIO标记细胞后结合微载体在旋转式生物反应器中培养,细胞贴附微载体的状况使用荧光显微镜、扫描电镜观测.并且检测细胞周期和分析细胞群体倍增时间来比较微重力培养与平面培养的体外增殖能力差异.rn 结果:在旋转式生物反应器的微重力培养体系中,人成纤维细胞能快速贴附到微载体表面,在培养过程中达到很大的细胞密度,并且表现出很强的增殖能力和细胞活性。rn 结论:利用旋转式生物反应器和微载体悬浮培养人皮肤成纤维细胞,是大量制备皮肤组织上程种子细胞的一种有效方法。
  • 摘要:目的:探讨小分子化合物(阿司匹林Aspirin、蛇床子素Osthol)对体外培养人的牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,HPDLSCs)和颌骨来源的骨髓间充质干细胞(Jaw of bone marrow rnesenchymal stem cells,JBMMSCs)膜片性能的影响及体内组织再生能力的研究.rn 方法:利用组织贴壁法从人牙周膜及颌骨中分别分离出牙周膜干细胞(hPDLSCs)和骨髓间充质干细胞(JBMMSCs)并进行体外培养.通过在细胞膜片形成的不同阶段(前、后、整个过程)加入小分子化合物(阿司匹林Aspirin、蛇床子素Osthol)刺激,在膜片水平通过HE染色和扫描电镜检测膜片的性能,成膜后成骨诱导,分别通过ALP染色、茜素红染色、Real Time-PCR和Western Blot检测其骨相关的变化;并验证其在裸鼠体内的再生效果.rn 结果:成功的培养并鉴定了牙周膜干细胞(hPDLSCs)和骨髓间充质干细胞(JBMMSCs);在膜片形成的不同阶段加入化合物的刺激,细胞的增殖和骨向分化能力都有所提高,但在前期加入效果更明显。rn 结论:在膜片形成的前期加入小分子化合物刺激,可以明显的促进细胞膜片的形成及其骨向分化能力。
  • 摘要:目的:再生出具有生物活性的牙髓不仅是构建组织工程生物牙根不可或缺的一部分,也是一种对于不可复性牙髓炎很有希望的治疗方法.rn 方法:培养并鉴定了来源于人根端牙乳头组织的含有间充质干细胞的混合细胞,并在细胞膜片的基础上构建出一种三维结构的、无支架材料的干细胞团块,并对对其进行组织学、生物学检测及基因蛋白表达分析,并在裸鼠体内进行异位组织再生实验.rn 结果:该细胞聚合体含有大量的包裹其内部细胞的细胞外基质,并且可以观察到团块内部的结构随着培养时间的延长而变得愈加紧密。对比相同培养条件下的细胞膜片,细胞团块表达更多的成骨及成牙相关的基因和蛋白,如碱性磷酸酶、人类相关转录基因2、骨涎蛋白和牙本质涎磷蛋白等。异位再生实验结果显示细胞团块形成了充满根管的类牙髓疏松结缔组织,且在根管壁周边观察到具有极性的、整齐排列的类成牙本质细胞,在该细胞与原有牙本质还可见类牙本质结构的薄层矿化组织形成。免疫组织化学染色表明再生出的组织表达多种成牙及成骨相关蛋白,并且来源于人类。rn 结论:这种含有丰富细胞外基质的细胞团块具有很强的异位再生牙髓组织的能力,将来可用于组织工程生物牙根的构建,同时也为牙髓病的治疗提供了一种新的方案。
  • 摘要:目的:探讨损伤坐骨神经匀浆上清液对脂肪干细胞分泌的神经生长因子(NGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)的影响.rn 方法:采用钳夹法建立兔坐骨神经损伤模型,并采用组织匀浆器制作神经匀浆,高速离心取其上清液.酶消化分离纯化兔脂肪干细胞,稳定传到第3代后,分别用正常及损伤3d、7d、14d兔坐骨神经匀浆上清液诱导培养7天.免疫细胞化学检测细胞内S-100蛋白和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP),ELISA法检测不同培养时间及不同诱导组培养液内NGF、bFGF和BDNF的含量.rn 结果:损伤坐骨神经匀浆上清液诱导培养脂肪干细胞后,S-100蛋白、GFAP阳性细胞率和培养液内NGF、bFGF、BDNF的含量在各个时间点均较正常神经匀浆上清液对脂肪干细胞培养组高,且生长因子水平呈时间依赖性增长,既与培养时间有关,也与损伤时间有关。rn 结论:损伤坐骨神经匀浆上清液能够诱导脂肪干细胞分泌NGF、bFGF、BDNF,有利于向神经细胞方向分化。
  • 摘要:皮肤瘢痕是临床工作中至今尚未攻克的难题之一,如何达到创伤的无瘢痕修复是医学工作者长久以来的目标.研究显示,胚胎创伤能够无瘢痕愈合主要得益于两个条件:(1)胚胎皮肤中含有大量的皮肤前体细胞;(2)胚胎皮肤中有良好的再生微环境,如较低的TGF-β生物学活性.提出"土壤和种子"假说,即通过敲除Smad3 (TGF-β通路下游信号转导因子)优化成体创伤的微环境(土壤)并给予皮肤前体细胞(种子),以达到成体创伤无瘢痕愈合的目的.结论:阻断TGF-β效应能够减少皮肤的纤维化,提供一个有利于胚胎皮肤发育的微环境;利用这种再生微环境联合干细胞移植,能够达到创伤的无瘢痕愈合。这为瘢痕的预防及治疗带来了崭新思路,并为将来局部改善微环联合成体干细胞移植促进创伤无瘢痕修复提供了坚实的理论依据和实验基础。
  • 摘要:目的:探讨降钙素基因相关肽(CGRP)对人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)增殖的影响,并从ERK1/2信号通路角度初步探讨其可能的机制.rn 方法:实验分为4组,分别为空白对照组、CGRP组、CGRP+ CGRP 8-37组、CGRP+ PD98059组.AlarmarBlue法检测各组人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)的增殖变化情况;免疫印迹技术观察CGRP诱导后ERK1/2的磷酸化,及CGRP8-37、PD98059对ERK1/2磷酸化的影响.rn 结果:(1)CGRP可诱导HWECs细胞增殖,该作用可被CGRP8-37和PD98059阻断;(2)CGRP可时间依赖性地诱导HUVECs细胞ERK1/2的磷酸化,CGRP8-37和PD98059可减弱其作用。rn 结论:CGRP可诱导HUVECs细胞增殖,ERK1/2信号通路参与其调控机制。
  • 摘要:目的:采用角膜支架材料复合骨髓间充质干细胞膜片的组织工程角膜有效地治疗各种角膜疾病.rn 方法:首先,选用新鲜猪角膜为原料,经过PBS清洗,脱细胞处理后,制备成角膜支架材料;同时,取新生兔骨髓间充质细胞原代培养,第3代时按5x105细胞/孔浓度接种,隔天更换含Vc条件培养基,培养14天时形成骨髓间充质干细胞膜片;接着,将角膜支架材料和骨髓间充质干细胞膜片复合,制备成组织工程角膜.将组织工程角膜移植于成年新西兰大白兔血管化或化学烧伤角膜模型,验证组织工程角膜有效性.rn 结果:分别在术后两周,1个月,2个月,3个月和6个月时拍照并取材观察,角膜新生血管和炎症逐渐减少,未形成瘢痕组织并角膜逐渐透明。组织学评价结果显示,组织工程角膜在两周时己完成上皮化,在1个月时整合性良好,在3个月时己有角膜自身的基质细胞爬入组织工程角膜,6个月时角膜无新生血管并完全透明。rn 结论:脱细胞角膜支架材料复合骨髓间充质干细胞膜片的组织工程角膜对受损角膜可有效地修复。
  • 摘要:目的:用大肠杆菌表达蛋白质的技术制备基因重组脑源性神经营养因子FBD-BDNF,对这种重组脑源性营养因子的生物学活性和特异结合纤维蛋白的能力进行检验.rn 方法:使用大肠杆菌表达目的蛋白,对大肠杆菌表达出的目的蛋白的包涵体进行纯化、复性,并通过PAGE胶观察纯度.用ELISA的方法观察FBD-BDNF与纤维蛋白的结合能力.用DRG细胞观察FBD-BDNF促进DRG神经轴突生长的能力.rn 结果:本实验成功制备出较纯的FBD-BDNF,结果表明,FBD-BDNF能够特异结合纤维蛋白,具有与BDNF相似的神经营养功能,在神经组织工程中具有良好的应用前景.
  • 摘要:目的:近期研究表明,来源于脱细胞组织的生物材料对于干细胞的生长和分化具有特殊作用.本研究拟通过去除纤维环组织中的细胞而获取脱细胞纤维环基质材料,并研究其对骨髓间充质干细胞(BMSC)的生长和分化潜能的影响.rn 方法:将猪纤维环组织剪碎,先后以0.25%的胰酶、含50 U/ml DNase和1 U/ml RNase的Tris-HCl溶液消化并经1% Triton X-100处理后,将所得脱细胞的纤维环基质用3%醋酸溶解.将溶液制膜,通过DAPI染色观察脱细胞效果.将兔BMSC分别接种到普通培养板和脱细胞纤维环基质膜上,检测BMSC在培养板和膜上的增殖能力.通过成脂、成骨、成软骨诱导分化实验检测细胞的分化潜能.rn 结果:脱细胞纤维环基质膜经DAPI染色呈阴性,表明纤维环组织里的细胞己被彻底去除。MTT结果显示,BMSC在膜上的生长速度比在普通培养板上更快,表明脱细胞纤维环基质有利于BMSC增殖。细胞在培养板和膜上经过成脂、成骨、成软骨诱导分化后,通过Oil Red O, Alizarin Red, Safranin O染色显示在膜上生长的细胞形成的脂滴、钙结节、软骨基质较培养板上的明显增多,说明脱细胞纤维环基质能较好维持BMSC的多向分化潜能。rn 结论:种子细胞、支架材料、生长因子是组织工程必不可少的三要素。本研究所获得的脱细胞纤维环组织里含有大量有利于细胞生长的细胞外基质。通过比较BMSC在普通培养板和脱细胞纤维环基质上的生长和分化潜能,证明脱细胞纤维环基质有助于干细胞的生长并维持干细胞的多向分化潜能。这种材料将在纤维环组织工程研究中具有重要意义。
  • 摘要:目的:采用人羊膜进行脱细胞,粉碎,均质处理,制备得到一种可注射的美容填充剂,可用于面部皱纹及褶皱的修复.本文对其长期皮下填充的有效性进行了深入研究.rn 方法:采用大鼠皮下植入模型,按照点状注射的方式,将脱细胞羊膜微粒注射至大鼠背部脊柱两侧的真皮组织的深层及皮下组织浅层部位,每只大鼠注射2点,每点注射量为0.5mL,共注射30只大鼠.在注射后1周,2周,4周,8周,12周,16周,24周,32周,40周,52周后将大鼠处死取材,每个时间点取材3只大鼠.取材前观察注射部位大体隆起情况,再小心剪开注射部位周围皮肤组织,拍照记录真皮深层或皮下浅层注射的材料形态,最后将材料及周围皮肤组织剪下进行常规HE染色检测,评价材料的炎症反应及降解情况.rn 结果:各大鼠饲养期间健康状态良好,通过各时间点取材前观察及取材后的组织学检测,证实脱细胞羊膜微粒具有良好的组织相容性,注射部位无红肿,溃烂等短期急性不良反应,未出现长期肉芽肿等长期慢性不良反应。脱细胞羊膜微粒可在大鼠皮下植入52周仍保持一定的隆起修复效果,材料仍有较多剩余,具有良好的体内抗降解能力。rn 结论:脱细胞羊膜微粒具有良好的生物相容性及良好的长期修复效果,在美容注射除皱领域具有广阔的应用前景。今后尚需补充评价脱细胞羊膜微粒的免疫原性实验。
  • 摘要:目的:透明质酸水凝胶作为细胞3D培养基质能够支持细胞的生长行为,例如表型、活性、增殖、迁移和分化等,而这些生长行为跟水凝胶的机械性能和内部结构关系密切.本研究初步探讨透明质酸水凝胶浓度的改变对其基本性能以及大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs) 3D培养生长行为的影响.rn 方法:制备3种浓度的透明质酸水凝胶:0.4%、0.8%、1.2%(w/v),并分析其机械性能,包括凝胶时间、溶胀率、降解速率以及粘弹性,用这3种浓度水凝胶分别包封MSCs进行3D培养,并与普通培养皿的2D培养作对照.通过激光扫描共焦显微镜观察MSCs在不同浓度水凝胶3D培养的形态,检测MSCs在水凝胶内的活性、增殖及凋亡情况,并分析MSCs在水凝胶内的"干性"及分化潜能.rn 结果:透明质酸水凝胶浓度越大,其凝胶时间越短,溶胀率越低,降解速率越慢,水凝胶强度越大(P<0.05)。MSCs在水凝胶内呈立体圆球形,与2D培养时呈现的梭形明显不同。MSCs在水凝胶内3D培养表现出的增殖率要高于2D培养,并且在浓度为0.8%水凝胶内的增殖率要高于0.4%和1.2%水凝胶组(P<0.05),MSCs在0.8%的水凝胶内可保持较高的活性和分化潜能。rn 结论:不同浓度的透明质酸水凝胶性能存在差异,对大鼠骨髓间充质干细胞的增殖、分布、生长状态也有不同影响,浓度为0.5%的水凝胶性能较为优越,可能更适合大鼠骨髓间充质干细胞的3D培养。MSCs在此水凝胶内可保持较高的增殖活性和分化潜能。
  • 摘要:目的:骨髓间充质干细胞(BMMSCs)是治疗肝损伤最具临床应用前景的成体干细胞之一,但目前对肝组织微环境调控BMMSCs经肝向分化参与肝组织再生的过程尚不清楚.本研究通过制备不同浓度的肝脏细胞外基质(L-ECM)凝胶对BMMSCs进行三维培养,初步探讨L-ECM对BMMSCs肝向分化的促进作用和调控机制.rn 方法:采用去垢剂灌注法获得小型猪脱细胞肝脏基质,经低温研磨和均质化作用获得L-ECM凝胶,并与Ⅰ型胶原按0%、25%、50%、75%和100%混合.将P3代BMMSCs以1×104/ml的密度与上述凝胶混匀后三维培养,2w后对其中细胞进行观察,检测培养液中白蛋白和尿素的含量,确定细胞的功能;提取RNA和总蛋白检测肝实质细胞/胆管内皮细胞特异性分子marker表达;通过PAS染色和ALB免疫荧光检测三维培养体系中成熟肝细胞的形成,探讨L-ECM作为组织微环境对BMMSCs肝向分化的促进作用.rn 结果:BMMSCs在各浓度L-ECM凝胶中生长良好;L-ECM各组培养液中白蛋白含量和尿素含量较胶原组均有显著上升,且白蛋白含量随培养时间不断增加;早期肝向分化基因HNF6,肝实质功能基因ALB,CYP1A1,胆管内皮细胞基因CFTR, CK-19的表达均随L-ECM浓度的增加而上升,并于50%L-ECM组达到峰值,之后随L-ECM浓度增加逐渐下降;组织切片经PAS染色后发现,L-ECM凝胶中BMMSCs呈阳性,说明其具备一定的糖原合成能力;组织切片的ALB免疫荧光显示,L-ECM中约70%的BMMSCs表达ALB,而胶原组未见阳性细胞。rn 结论:L-ECM凝胶材料可诱导BMMSCs肝向分化,且该诱导作用呈一定的剂量依赖性关系。
  • 摘要:目的:内皮祖细胞(EPC)移植是治疗冠心病、肢体缺血等血管损伤疾病的新策略,而诱导人胚胎干细胞(hESC)分化为EPC可能提供新的细胞来源,流体剪切力(LSS)可以提高EPC的分化效率,尝试通过转基因Hath6模拟LSS作用提高hESC的内皮分化效率.rn 方法:通过LSS处理hESC确定流体剪切力对内皮分化及Hath6基因表达的调节作用.利用过表达和shRNA表达敲除的方式对hESC进行Hath6基因修饰,再以分阶段添加细胞因子的方式诱导hESC内皮分化,通过分析细胞表面标志、内皮特异基因表达、以及细胞在基质胶(matrigel)上形成血管样结构的能力判断内皮分化水平.rn 结果:Hath6基因能响应流体剪切力的作用提高表达。通过基因修饰,Hath6过表达有效提高了hESC向内皮细胞的分化效率,而抑制Hath6表达出现对应的抑制内皮分化的效果。rn 结论:诱导人胚胎干细胞可以为血管损伤类疾病的治疗提供有效的种子细胞,利用Hath6基因转染能模拟流体剪切力提高hESC的内皮分化效率,提供充足的种子细胞来源。
  • 摘要:目的:观察细胞外基质来源的骨-软骨双层支架联合骨髓基质干细胞(BMSCs)修复犬膝关节负重区骨软骨联合缺损的疗效.rn 方法:利用软骨细胞外基质作为软骨支架部分,以脱细胞骨作为骨支架部分,采用相分离技术制备骨软骨双相支架,将成软骨诱导的BMSCs种植到双相支架上构建组织工程骨软骨复合体,并以此复合体修复犬膝关节股骨髁负重区骨软骨缺损,分为细胞-双相支架组(实验组)和单纯支架组(对照组),分别在3和6个月时取材,根据大体、组织学、Micro-CT等检测结果进行半定量或定量评估.rn 结果:组织学显示双层支架去细胞彻底,支架内孔洞相互贯通,骨-软骨部分结合良好。动物实验中,两组以纤维软骨或透明软骨对缺损有不同的修复,大体以及组织学评分表明实验组明显优于对照组,生物力学测试表明6月实验组修复软骨的刚度为正常膝关节软骨的70.1%,与生物化学分析结果一致;软骨下骨的刚度达到正常膝关节的74.96%。Micro-CT结果表明实验组与对照组软骨下骨重建不具备明显差异。rn 结论:CECM/ACBM骨软骨双层支架保留了骨、软骨的细胞外基质成分,具备良好的孔径和孔隙率,骨一软骨两层间结合良好,无毒,生物相容性良好。骨软骨双相支架复合成软骨诱导的BMSCs能成功修复犬膝关节负重区的骨软骨缺损。
  • 摘要:目的:探讨RNA干扰(RNAi) aggrecanases后的软骨细胞作为种子细胞的可行性,为组织工程软骨提供一种新的种子细胞.rn 方法:采用正常的软骨细胞以及aggrecanase-1,2受抑制软骨细胞分别作为种子细胞,将之复合到壳聚糖/明胶材料上进行体外培养,通过常规HE、甲苯胺蓝、番红O、Masson三色染色、免疫组织化学染色、扫描电镜观察以及RT-PCR等方法检测在培养的过程中蛋白多糖以及aggrecanase-1,2含量的变化情况.rn 结果:在培养2周时,壳聚糖/明胶-软骨细胞以及壳聚糖/明胶-干扰后的软骨细胞常规染色未见明显差别。随着培养时间的延长,常规染色、免疫组化以及RT-PCR均显示正常组和干扰组蛋白多糖和Ⅱ型胶原染色差别明显,干扰组蛋白多糖和Ⅱ型胶原含量明显高于正常组。RT-PCR结果显示干扰组aggrecanase-1,2基因表达明显低于正常组,蛋白多糖含量明显高于正常组,其差别具有统计学意义。rn 结论:RNAi后的软骨细胞可以作为种子细胞,其在材料上分泌蛋白多糖及胶原含量明显高于正常软骨细胞,可作为一种较为理想的种子细胞。
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