电转染

摘要： 学习记忆在动物获得新的觅食技巧和食物偏好方面扮演着重要的角色.为评估学习记忆对翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)摄食调控的影响,构建翘嘴鳜学习记忆相关基因c-fos及zif268荧光过表达载体,并以pcDNA3.1-EGFP载体质粒中的绿色荧光蛋白基因为报道基因进行电转实验,优化电压、脉冲时间、质粒浓度和电击次数等电转条件,确立最佳条件.利用电击的方式转染翘嘴鳜脑细胞,检测食欲基因mch、agrp、pomc、npy表达变化.结果 显示,成功构建了学习记忆过表达载体pcDNA3.1-c-fos-EGFP、pcDNA3.1-zif268-EGFP.翘嘴鳜脑细胞电转染的最适条件:细胞密度1×106/mL、电压240 V、脉冲时间5 ms、质粒6μg、电击1次、转染48 h,可见大部分荧光蛋白表达,转染率较高,表明pcDNA3.1-EGFP在体外成功转染翘嘴鳜脑细胞.过表达c-fos基因后,食欲相关基因pomc和npy mRNA水平均显著上升.而过表达zif268基因后,并未发现食欲基因有差异表达.以上结果说明,翘嘴鳜学习记忆相关基因c-fos的表达影响了食欲相关基因pomc和npy的表达.

摘要： 目的:观察TGF-β1对背根神经节细胞轴突生长的影响。方法:取出小鼠脊柱两侧的背根神经节(dorsal root ganglion, DRG),消化、分离获得背根神经节细胞。根据电转染的质粒不同将细胞分为对照组(空白质粒)和TGF-β1组(重组TGF-β1质粒,即pBR322/TGF-β1)。Western-blot检测细胞TGF-β1, Tuj1免疫组化染色后,荧光显微镜下分析背根神经节细胞轴突长度。结果:TGF-β1组TGF-β1含量明显高于对照组,背根神经节细胞轴突明显长于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:背根神经节细胞电转染TGF-β1质粒可促进背根神经节细胞的轴突生长。

摘要： [背景]随着生物技术发展,研究的生理机制和生物功能日益复杂,提高大载体的转染效率对多基因共表达系统、基因编辑技术、转基因育种等具有重要的意义.在转基因育种中,使用的转基因载体相对较大,而且转基因动物的制备效率也与供体细胞猪胎儿成纤维(porcine Fetal Fibroblasts,PFFs)细胞的转染效率有关.[目的]研究主要从转染参数、质粒用量和拓扑结构三方面,比较3种电转仪ECM(R) 830/NEPA21/NucleofectorTM2b的大载体转染效率,以探索大载体转染PFFs的最佳条件.[方法]使用3种不同电转仪将长达26 kb的携带增强型绿荧光蛋白基因的pPXAT-EGFP质粒转染1x106个PFFs,48 h后使用流式细胞仪测定荧光细胞比例,从电转参数、质粒用量和拓扑结构三方面分别比较瞬时转染效率.[结果]首先比较电转仪不同参数的转染效率,结果显示当电转参数为脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次,NEFA 21转染PFFs的效率最高,为13.24％±1.63％,而NucleofectorTM2b的最佳电转参数为U-023,其转染效率高达46.36％±3.95％.然后在最佳电转参数下分别比较6、8、10和12μg的26 kb超螺旋质粒的转染效率,ECM(R) 830和NucleofectorTM2b转染PFFs的最佳质粒用量为12 μg,其转染效率分别为8.44％±0.90％(电转参数:脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲次数3次)和14.63％±3.21％(电转参数:U-023),而NEPA 21使用10μg质粒转染PFFs时效率达到最高(6.09％±0.72％).最后比较不同质粒拓扑结构的转染效率,结果显示线性化质粒的转染效率较低,仅为超螺旋质粒转染效率的34.96％-48.39％.[结论]因此NucleofectorTM 2b转染PFFs的最佳条件为:U-023程序、12 μg超螺旋质粒;NEPA 21为:脉冲电压200 V,脉冲长度3 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次、10 μg超螺旋质粒;ECM(R)830则在脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲次数3次条件下转染12 μg超螺旋质粒可获得最佳转染效率.综合比较上述3种电转仪,26 kb大载体转染PFFs的最佳电转仪是NucleofectorTM 2b.

摘要： 目的 采取猪尾小组织块贴壁法成功分离培养出原代猪成纤维细胞并进行细胞不同时期的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性质粒转染效率的研究.方法 猪尾小组织块贴壁培养法分离培养出原代猪成纤维细胞后,传代并进行冻存和复苏,比较猪成纤维细胞原代培养、传代培养和复苏细胞存活率.绘制细胞原代培养、传代培养和复苏后的生长情况.分别在猪尾小组织块贴壁培养获得原代成纤维细胞,细胞传代和复苏后进行细胞GFP阳性质粒的Neon电转染,比较不同转染时期细胞存活率和生长情况,转染后24 h和48 h分别采用荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞的GFP质粒阳性表达率.结果 猪尾小组织块贴壁培养可以成功分离培养出猪成纤维细胞,细胞冻存后复苏能保持原代细胞生物学特性,原代细胞活力很高,细胞存活率97.670％,传代培养后细胞存活率95.670％,复苏细胞存活率仍在90％以上.原代培养、传代培养和复苏培养细胞生长曲线均呈“S”型,复苏细胞生长略微缓慢.原代培养、传代培养和复苏细胞电转染后细胞存活率均有少许下降,细胞生长增殖能力减弱,但是细胞生长曲线仍呈“S”型曲线.Neon电转染后24 h均可获得GFP质粒阳性表达的猪成纤维细胞,荧光显微镜均检测到GFP质粒阳性表达的成纤维细胞,48h后流式细胞仪检测显示原代细胞阳性率8.01％,稍高于传代细胞的7.91％和复苏细胞的7.86％.复苏细胞存活率下降,转染后细胞活力下降,但转染后仍可得到7.86％GFP质粒阳性表达的猪成纤维细胞,原代培养细胞能够获得更高的阳性率,差异有统计学意义.结论 猪尾小组织块贴壁培养法可以成功分离培养出成纤维细胞,细胞传代会对细胞活力有影响,冻存后复苏也会影响细胞的存活率和细胞增殖能力.原代细胞、传代细胞和复苏细胞转染均能获得GFP阳性质粒表达.原代培养细胞具有更佳的细胞活力和阳性转染率,进行基因敲除或基因敲入等基因编辑和体细胞克隆研究,选择原代细胞作为转染对象能获得更好的基因编辑成功率.

摘要： 旨在对编码融合蛋白和抗体的重组质粒转染CHO-S细胞的转染条件进行摸索优化,提高外源基因的转染效率,从而增加外源蛋白的表达.应用Amaxa Nucleofector-Ⅱ 电转仪,从电转染程序、质粒用量及细胞用量三方面着手,最终发现编码融合蛋白的重组质粒的最佳电转条件为:电转程序U-030,质粒用量20μg/孔,细胞用量1×107个/孔;编码抗体的重组质粒的最佳电转条件为:电转程序U-024,质粒用量15μg/孔,细胞用量1×107个/孔;实验结果进一步显示抗体重组质粒电转染CHO-S细胞的效果要优于融合蛋白重组质粒,利用高通量细胞筛选仪Clone Pix对转染后重组细胞的阳性克隆数进行统计,证实了该抗体重组质粒的转染效率更高.这为以后的抗体及融合蛋白重组质粒电转染CHO-S细胞提供了一定的数据支持,同时提示不同类型的细胞及外源基因,都需要设计相应的电转染实验进行条件优化,进而为获得高产稳定的生产用细胞株奠定基础.

摘要： 传统构建遗传修饰小鼠的方法有2种,一种是采用显微注射技术将特定核酸序列传递到小鼠受精卵或胚胎体内,另一种是将小鼠的胚胎干细胞导入到囊胚中.较为广泛应用的是采用显微注射技术将特定核酸序列传递到小鼠受精卵或胚胎体内,即核酸传递方法,该方法可以通过注射方法、转染方式及性腺组织介导进行核酸传递.综述构建遗传修饰小鼠过程中的核酸传递方法,包括原核注射、囊胚显微注射、受精卵核酸电转染、输卵管核酸电转染、精子介导的基因转移、卵巢组织注射等方法的研究进展,并对核酸传递方法的进一步利用和发展方向进行展望.

摘要： BACKGROUND: Wharton's Jelly-derived mesenchymal stem cells are relatively primitive stem cells that are ideal vectors for gene therapy. However, there is a lack of studies on the conditions for the electrotransfection of Wharton's Jelly-derived mesenchymal stem cells. Therefore, exploring the optimal conditions for the electrotransfection of Wharton's Jelly-derived mesenchymal stem cells occupies an important position. OBJECTIVE: To investigate the effects of different electroporation conditions on the transfection efficiency of Wharton's Jelly-derived mesenchymal stem cells, and to explore the optimal conditions for cell electroporation. METHODS: By controlling the transfection conditions such as voltage, pulse duration and cell status, EEV-EGFP plasmids were transfected into Wharton's Jelly-derived mesenchymal stem cells by electroporation under different conditions. Transfection efficiency was detected by flow cytometry. RESULTS AND CONCLUSION: (1) The transfection efficiency was intended to increase when the voltage ranged from 125 V to 150 V, and the maximum transfection efficiency was obtained when the voltage was 150 V. However, when the voltage was further increased to 170 V, the transfection efficiency began to decrease considerably. (2) The maximum transfection efficiency was obtained when the pulse duration was 5.0 ms, while it was certainly decreased when the pulse duration was 2.5 and 7.5 ms. (3) The transfection efficiency of the cells cultured under normoxia was higher than that under hypoxic culture. These findings reveal that normally cultured Wharton's Jelly-derived mesenchymal stem cells can achieve higher electroporation efficiency via two pulse sessions at a voltage of 150 V, pulse duration of 5.0 ms, and pulse interval time of 50 ms.%背景:脐带华通胶间充质干细胞是目前较为原始的干细胞,为当前干细胞的研究热点之一,是基因治疗的理想载体.然而,目前尚未有对脐带华通胶间充质干细胞电转染条件的研究,因此探索脐带华通胶间充质干细胞的电转染最佳条件占据重要地位.目的:探讨不同电穿孔条件对脐带华通胶间充质干细胞转染率的影响,以确定最佳电转染条件.方法:通过控制电压、脉冲时长及细胞状态等转染条件,采用不同条件组合后用电穿孔法将质粒EEV-EGFP转入脐带华通胶间充质干细胞,流式细胞仪检测转染率.结果与结论:①电压自125 V至150 V,转染率呈现递增趋势,150 V时获得最大转染率,但将电压进一步调高至170 V,转染率开始显著降低;②脉冲时长为5.0 ms时获得最大转染率;脉冲时长为2.5 ms和7.5 ms时转染效率均有所降低;③与低氧培养比较,正常培养的细胞转染率更高;④结果表明,正常培养的脐带华通胶间充质干细胞在电压150 V、脉冲时长5.0 ms、脉冲间隔时间50 ms、脉冲数2次时可达到较高的电转染率.

摘要： 目的：为探讨干细胞移植后的体内迁移和定向分化,寻找非损伤性的方法标记移植的细胞,用加强的绿色荧光蛋白(EGFP)作为报道基因标记间充质干细胞分析了EGFP标记细胞在体内移植后的荧光变化. 方法：本研究利用电穿孔方法进行加强的绿色荧光蛋白质粒(pCVM-EGFP)转染产生具有EGFP标记的牙髓干细胞,皮肤成纤维细胞,脐带间充质干细胞.然后将EGFP标记的脐带间充质干细胞注射到裸鼠皮下,在不同时间用小动物活体成像系统观察了EGFP标记细胞在体内的荧光变化. 结果：用电穿孔方法能够在体外产生高效表达的标记细胞,EGFP在牙髓干细胞,皮肤成纤维细胞,脐带间充质干细胞中的表达超过80-85％,EGFP标记的脐带间充质干细胞注射到裸鼠皮下后表达荧光持续1周以上,能够利用小动物活体成像系统检测到移植细胞在体内的荧光变化情况. 结论：电穿孔技术能够产生高效表达EGFP的细胞用于追踪细胞体内移植后的定位与迁移,为探讨干细胞移植治疗作用提供了实验技术手段.

摘要： 本发明提供了一种电转染永生化树突状细胞的方法，属于细胞电转化技术领域，所述方法，包括以下步骤：1)永生化树突状细胞用电转缓冲液重悬后与待转染的DNA或RNA混合、冰浴获得电转液；2)对所述电转液进行电击处理获得电击后的细胞，所述电击的电压为150～400V，所述电击的电极间距为2～4mm；所述电击的场强为750～1000V/cm；所述电击的时间为3～5ms；3)将所述电击后的细胞置于培养基中培养。本发明提供的电转染永生化树突状细胞的方法针对永生化树突状细胞，24h细胞存活率高，转染效率高。

摘要： 本发明公开了一种电转染装置及使用该装置的鸡胚视顶盖电转染方法，该电转染装置包括用于与电源供应器测试端连接的第一电极和第二电极，所述第一电极为板形电极，第二电极为针形电极，所述针形电极呈弧形。本发明采用2个分别独立的电极，放置位置和角度可以灵活调整；本发明的第二电极为针形电极，直径较细，在放入鸡胚视顶盖底部时，不会对组织或卵黄膜造成损伤，避免由此引起的胚胎死亡，且能够起到良好的导电作用，同时该针形电极呈弧形，弧形设计能够在不损伤鸡胚的情况下起到固定鸡胚视顶盖的作用。

摘要： 本发明提出了对动物受精卵进行电转染基因编辑的方法及其应用。该方法包括：(1)选择S期以前的动物受精卵进行透明带弱化处理；(2)将外源物质与经过透明带弱化处理的动物受精卵混合后，进行电穿孔转染处理，其中，所述外源物质包括Cas9蛋白和sgRNA。利用该方法能有效实现对动物胚胎进行电转染并基因编辑。

摘要： 本发明属于海洋生物学应用领域，具体划分至贝类分子遗传育种领域，涉及一种电转染双壳贝类基因编辑的方法，保持重组质粒浓度≥2μg/μl、sgRNA:Cas9蛋白＝2:1的体积比混合成RNP(sgRNA和Cas9蛋白复合物)，其中sgRNA工作浓度≥50ng/μl，Cas9工作浓度≥250ng/μl，采用电转染的方法应用于双壳贝类基因编辑中，电脉冲条件脉冲间隔1s，脉冲数2个，电极距离4mm，变化脉冲电压和脉冲时间处理，脉冲电压范围50V～500V，脉冲时间为100μs～1ms。本发明涉及方法可为双壳贝类基因功能验证及基因育种应用提供依据，具有操作简单、成本低、易推广等优点。

摘要： 本发明提供了一种电转染永生化猪成纤维细胞的方法，包括以下步骤：(1)将pCAG‑floxP‑neo‑pH11载体通过单酶切得到线性载体，而后通过引物退火延伸得到hTERT片段，克隆到所述线性载体上；(2)将所述线性载体转化至感受态，进行菌落培养、PCR鉴定；(3)PCR鉴定正确的质粒进行测序鉴定，序列正确的hTERT重组质粒进行扩大培养，然后通过质粒纯化试剂盒纯化，从而构建永生化载体pCAG‑H11‑hTERT；(4)将pCAG‑H11‑hTERT及px459‑H11‑V2电转染至猪原代成纤维细胞；(5)用含有嘌呤培养基对细胞进行筛选，得到永生化成功细胞。本发明效率高、适应性强，永生化特性不易消失，适用于大多数难转染的细胞。

摘要： 本发明公开了一种流式电转染装置，包括电极组件、至少两个开口和至少一个流体导向结构。本发明解决了流式电转染电极腔室内不同位点的流体流速相对不均匀的技术问题，提高了流体经过电极腔室时受到电击次数的准确性，提高了电转染效率，同时降低了因过多次数的电击而造成的细胞损伤甚至死亡，从而提高了细胞存活率。

摘要： 本发明公开一种细胞电转染缓冲液、制备方法及其使用方法，所述缓冲液包括如下成分：0.2‑0.25 mol/L海藻糖、0.2‑0.4mol/L琥珀酸钠或是NaCl、0.04‑0.05mol/L KCl、0.1‑0.15mol/L MgCl2、1.4‑1.5mol/L NaH2PO4，以及质量分数为10%的Pluronic F‑68，其余为蒸馏水加至10mL。通过上述溶液的配制，实现细胞处于渗透压240‑270mosm的环境中，本发明公开的电转染缓冲液在节省成本的同时能够提高细胞存活率，并且目标细胞的阳性电转效率更高，其技术效果优于现有技术。

摘要： 提供了一种电转染装置及方法。电转染装置包括：第一脉冲发生电路，用于提供第一脉冲电压；第二脉冲发生电路，用于提供第二脉冲电压，第二脉冲电压与第一脉冲电压对应不同的电压范围；电泳电源电路，用于提供电泳电压；控制电路，与第一脉冲发生电路、第二脉冲发生电路和电泳电源电路连接，用于控制第一脉冲发生电路或第二脉冲发生电路处于工作状态，以为负载提供电转染所需的脉冲电压，以及控制电泳电源电路的工作状态，以为待导入细胞的物质提供电泳电压。本申请实施例通过多个脉冲发生电路可以提供不同电压范围的脉冲，有助于增加电转染装置可转染细胞的种类。

摘要： 提供了一种电转染装置及方法。电转染装置包括：第一脉冲发生电路，用于提供第一脉冲电压；第二脉冲发生电路，用于提供第二脉冲电压，第二脉冲电压与第一脉冲电压对应不同的电压范围；电泳电源电路，用于提供电泳电压；控制电路，与第一脉冲发生电路、第二脉冲发生电路和电泳电源电路连接，用于控制第一脉冲发生电路或第二脉冲发生电路处于工作状态，以为负载提供电转染所需的脉冲电压，以及控制电泳电源电路的工作状态，以为待导入细胞的物质提供电泳电压。本申请实施例通过多个脉冲发生电路可以提供不同电压范围的脉冲，有助于增加电转染装置可转染细胞的种类。

摘要： 本实用新型属于电转染技术领域，具体涉及一种环管式电转染装置。本实用新型包括：管体、管盖、导线、控制电路板和外部电源。控制电路板和所外部电源通过导线连接，可将普通交流电转化为脉冲电流，通过环形设置的正电极和中心的负电极产生高强度电场。管盖的采用了一种T型保护套，通过插接的方式可拆卸地放置在管体内并实现密封，第一空腔下方则内嵌了圆柱负电极。本实用新型采用了非直接接触细胞悬液的正负极，减少了转染过程会出现的气泡量，且提供一种覆盖范围更广的高强度电场，并且电场的强度均匀，保证了转染过程的稳定性，使转染效率大大提高。