T-DNA

摘要： 对高中生物学教学中有关农杆菌转化法的原理和过程进行简要分析探讨,为学生深刻理解该实验背后的原理提供借鉴,为生物学教师提供教学参考.

摘要： 为深入研究水稻立枯病原菌尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum Schelcht)致病分子机理,利用根癌农杆菌介导遗传转化技术构建尖孢镰孢菌突变体库,筛选致病力降低突变体,检测其T-DNA插入数量和位点。结果表明,691个突变体库构建成功,且突变体可稳定遗传后代。选取34个不同菌落形态变化突变体测定其致病力,筛选到6个致病力降低最严重突变体,分析其菌落形态、菌落生长速率和产孢量。与野生型相比,菌落形态存在差异,其中4个突变体B9、C36、D65、E17生长速率降低,6个突变体产孢数量均降低。通过Southern blot分析发现突变体B92有两个T-DNA插入,其余5个突变体为单个T-DNA插入,利用Hi TAIL-PCR确定6个突变体T-DNA插入位点。结果有助于更好理解尖孢镰孢菌与水稻之间分子相互作用,为进一步确定尖孢镰孢菌致病基因及其功能提供参考。

摘要： 为揭示油菜黑胫病菌的致病分子机理,基于已建立的Leptosphaeria biglobosa突变体库,随机挑选16个突变体,对其致病力进行检测,筛选到12个致病力下降的突变体.并对其中6个致病力显著减弱突变体的菌落生长特性、生长速率、产孢量进行测定,结果显示,T1、T3、T4、T7突变体与野生型nm-1菌落形态相比没有明显差异,T9、T11与野生型nm-1相比,菌丝形态致密,没有产孢;T1、T3、T4、T7、T9突变体生长速率比野生型nm-1快,而T11显著低于野生型nm-1;6个突变体的产孢能力与野生型nm-1相比都显著下降;Southern Blot分析其T-DNA插入的拷贝数为单拷贝插入.并通过Hi TAIL-PCR技术扩增了6个突变体的右侧翼序列,经Blast比对分析,初步确定了T-DNA插入Lepto-sphaeria biglobosa基因组的位置,T-DNA插入的右侧翼序列可能为致病基因的部分序列,为进一步确定油菜黑胫病菌致病基因及其功能提供参考依据.

摘要： 目的 探讨一株根瘤农杆菌T-DNA插入介导的烟曲霉突变菌(M7)耐药性产生的分子机制.方法 通过基因组重测序鉴定M7中T-DNA的插入位置并分析SNP位点,然后在烟曲霉A1160背景上将相应的突变基因进行敲除并验证.敲除成功后,比较分析敲除菌和野生型菌株的表型.结果 通过基因组重测序发现M7中T-DNA的插入位点位于基因Afu5g08910中,但其敲除菌(ΔM7)并未发现有耐药性产生.SNP分析以及验证实验发现,M7中Cyp51A第54位氨基酸由Gly突变成Arg是M7产生耐药性的根本原因.结论 M7突变株耐药性产生的原因并非Afu5g08910基因突变,而是Cyp51A位点突变所致.

摘要： 探讨“农杆菌转化法”中的知识点,并解析Ti质粒及T-DNA结构、转化原理、转化及筛选方式等3个方面的疑难问题。

摘要： 对转基因株系的PCR检测以及对T-DNA侧翼基因组序列的深入分析,可以充分了解转基因株系的特异性分子特征.本研究利用农杆菌(Agrobacterium)介导的大豆(Glycine max)子叶转化方法,获得了3个转GmWRKY70基因的大豆株系.本研究对除草剂抗性基因(bialaphos resistance,Bar)、目标基因GmWRKY70以及载体构建特异性片段进行PCR检测,利用高效热不对称交错PCR(high-efficient thermal asymmetric interlaced PCR,Hi-TAIL PCR)对T-DNA侧翼序列进行整合位点分析.结果表明,3个转GmWRKY70基因的大豆株系均为阳性株系.T-DNA在43119699～43119712 bp之间反向整合到大豆染色体Chr07中.T-DNA整合导致大豆染色体Chr07插入位点12 bp缺失.对于引入的T-DNA,发现左边界(left border,LB)的80 bp序列和右边界(right border,RB)的22 bp序列被截短.在导入的LB端和大豆基因组DNA的整合位点上发现了两个碱基对的微同源性,而RB未发现同源性.本研究设计新的整合位点特异性引物,并验证这种转化事件,为促进分子辅助选择在育种计划中的应用提供了资料基础.

摘要： 水稻OsRhoGAP2基因是前期从幼穗cDNA文库中筛选获得的功能未知基因,采用DNA重组技术构建OsRhoGAP2基因RNA干扰载体,并转化水稻.对转基因水稻的表型分析显示,OsRhoGAP2基因RNA干扰水稻株高显著高于对照水稻.采用高效热不对称交错PCR法(HiTAIL-PCR)对RNAi-OsRhoGAP2转基因水稻T-DNA插入位点的侧翼序列进行分析,利用特异性嵌套引物扩增,结合序列对比分析,发现在4个不同的转基因水稻株系中,T-DNA均插入到水稻OsRhoGAP2基因的第5个外显子内,本研究将为后续对该基因的功能鉴定提供重要依据.

摘要： [目的]从大丽轮枝菌T-DNA突变体库中筛选鉴定致病缺陷型突变体并分析致病相关基因.[方法]将落叶型大丽轮枝菌菌株Vd991的294个T-DNA插入突变体在寄主棉花上进行致病力测定.利用Southern杂交和hiTAIL-PCR(High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR)技术分别对筛选获得的9个致病力显著降低的突变体进行拷贝数和侧翼序列分析.[结果]与接种野生型Vd991的棉花相比,接种突变体的棉花的病情指数极显著降低.Southern杂交表明其中1个突变体中T-DNA为双拷贝插入,其余8个突变体均为单拷贝插入.生物学特性分析发现T-DNA的插入导致这些突变体在生长速率和产孢量等方面与野生型Vd991相比均有不同程度的降低.Blast比对分析明确了这些突变体中T-DNA的插入位置和在基因组上的分布,并从野生型菌株Vd991中成功克隆得到了这些可能影响大丽轮枝菌致病力的相关基因.[结论]筛选和鉴定T-DNA插入突变是在全基因组范围内快速获得致病相关基因信息的1种有效方法,极大的促进了大丽轮枝菌的致病分子机制等研究,为进一步培育抗病棉花品种奠定了基础.%[Objective] Our research aimed to identify pathogenicity defective mutants from a T-DNA insertion mutant library of Verticillium dahliae strain Vd991 and to analyze pathogenicity-related genes.[Method] In total,294 T-DNA insertion mutants of V.dahliae were tested for their virulence using a cotton infection assay.Southern blot assays were performed to identify the T-DNA insertion copy number of each pathogenicity defective mutant.DNA sequences flanking the T-DNA insertional sites of each mutant were analyzed by high-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR.[Result] Based on the virulence assay,the disease indices of cotton plants inoculated with each mutant decreased very significantly in comparison with the index of those inoculated with Vd991.The Southern blot assay revealed that only one mutant contained two T-DNA insertions,while the remaining eight mutants harbored a single T-DNA insert.An analysis of biological characteristics found that the growth and conidial production of these mutants were impaired by the T-DNA insertions compared with the wild type Vd991.The T-DNAs' insertion position and distribution in each mutant were identified by comparison with genome sequences of strain VdLs.17.Furthermore,the pathogenicity-related genes were cloned from strain Vd991.[Conclusion] The screening and identification of T-DNA insertion mutants is an effective method to identify the pathogenicity-related genes of V.dahliae on a genome-wide scale.This laid a foundation for the further breeding of disease-resistant cotton varieties and will promote the study of the pathogenic molecular mechanisms of V.dahliae.

摘要： At2g23470是拟南芥功能未知结构域DUF647蛋白家族的一个成员.为了研究At2g23470基因的功能,需要获得At2g23470功能缺失的突变体材料.根据拟南芥信息资源网站(The Arabidopsis Information Resource,TAIR)上公布的At2g23470基因可利用的T-DNA标签品系,从美国拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center,ABRC)购买了2套独立的At2g23470基因的T-DNA插入GABI-Kat株系种子,运用PCR法对这些T-DNA插入突变体进行了基因型分析和鉴定,结果获得了3个纯合的T-DNA插入位于RUS4启动子上的株系和1个T-DNA插入位于第2外显子的株系.RT-PCR分析表明,T-DNA插入位于第2外显子的株系中,At2g23470基因的表达完全缺失.该突变材料的获得为深入研究At2g23470基因的功能奠定了良好的基础.%At2g23470 is a member of the Domain of Unknown Function 647 protein family that is conserved in diverse eukaryotic organisms.To identify Arabidopsis T-DNA insertion mutants at the At2g23470 locus,we screened the ABRC collections.Two independent T-DNA lines carrying a T-DNA insertion either at the promoter or in the second exon,respectively,were genotyped using PCR-based analysis of genomic DNA.RT-PCR of homozygous T-DNA insertion mutants,using At2g23470-specifc primers,exhibited increased At2g23470 transcript levels in homozygous mutants with insertion at the promoter;whilst At2g23470 transcripts could not be detected in the homozygous mutant with T-DNA insertion at the exon,indicating that it contains a null mutation in the At2g23470 gene.These homozygous mutants have laid a foundation for investigating the function of At2g23470 gene in Arabidopsis growth and development.

摘要： 通过接种CO39近等基因系水稻品种,筛选本实验室稻瘟病菌菌株FJ95054B T-DNA插入突变体库,获得3个致病性变异稳定的突变体2t-2 T940024501、T940084501、T940086504,运用TAIL-PCR方法获得了2个突变体的T-DNA侧翼序列,结合表型和相关生物信息学分析初步了解T-DNA插入区域的基因功能。

摘要： 通过接种CO39近等基因系水稻品种,筛选本实验室稻瘟病菌菌株FJ95054B T-DNA插入突变体库,获得3个致病性变异稳定的突变体2t-2 T940024501、T940084501、T940086504,运用TAIL-PCR方法获得了2个突变体的T-DNA侧翼序列,结合表型和相关生物信息学分析初步了解T-DNA插入区域的基因功能。

摘要： 通过接种CO39近等基因系水稻品种,筛选本实验室稻瘟病菌菌株FJ95054B T-DNA插入突变体库,获得3个致病性变异稳定的突变体2t-2 T940024501、T940084501、T940086504,运用TAIL-PCR方法获得了2个突变体的T-DNA侧翼序列,结合表型和相关生物信息学分析初步了解T-DNA插入区域的基因功能。

摘要： 通过接种CO39近等基因系水稻品种,筛选本实验室稻瘟病菌菌株FJ95054B T-DNA插入突变体库,获得3个致病性变异稳定的突变体2t-2 T940024501、T940084501、T940086504,运用TAIL-PCR方法获得了2个突变体的T-DNA侧翼序列,结合表型和相关生物信息学分析初步了解T-DNA插入区域的基因功能。

摘要： 通过接种CO39近等基因系水稻品种,筛选本实验室稻瘟病菌菌株FJ95054B T-DNA插入突变体库,获得3个致病性变异稳定的突变体2t-2 T940024501、T940084501、T940086504,运用TAIL-PCR方法获得了2个突变体的T-DNA侧翼序列,结合表型和相关生物信息学分析初步了解T-DNA插入区域的基因功能。

摘要： 采用GUS组织化学染色和PCR方法对T-DNA插入突变群体进行筛选,并对基因捕捉效率和T-DNA整合的时空特性进行了分析.结果表明:直接分化再生系统和愈伤组织分化再生系统的转化效率分别为64％和37.5％,前者比已报道的采用基因枪法转化同种材料的转化效率(34.5％)高出近2倍.植株总的基因捕捉频率为12.2％.其中根、短缩茎、叶、外植体、愈伤组织的基因捕捉频率分别为13.2％、34.3％、4.3％、0.9％、40％.在GUS检测呈阳性的植株中,有很多为特异性表达的,其中短缩茎、根、叶的特异性表达率分别为50％、8.6％、30％.从特异性表达的根、茎、叶的横切面组织切片可以看出,GUS活性主要在根、茎、叶的表皮、皮层薄壁细胞以及叶的表皮、皮层薄壁细胞和海绵组织薄壁细胞中表达.在侵染后的第26天,根本检测不到蓝色斑点,然而到了第35天就可以检测到微弱的蓝色斑点,此后逐渐增强.推测T-DNA整合到百合基因组的时间是在侵染后35天之前,T-DNA在百合基因组中开始表达的时间可能是在侵染后27～35天.

摘要： 采用GUS组织化学染色和PCR方法对T-DNA插入突变群体进行筛选,并对基因捕捉效率和T-DNA整合的时空特性进行了分析.结果表明:直接分化再生系统和愈伤组织分化再生系统的转化效率分别为64％和37.5％,前者比已报道的采用基因枪法转化同种材料的转化效率(34.5％)高出近2倍.植株总的基因捕捉频率为12.2％.其中根、短缩茎、叶、外植体、愈伤组织的基因捕捉频率分别为13.2％、34.3％、4.3％、0.9％、40％.在GUS检测呈阳性的植株中,有很多为特异性表达的,其中短缩茎、根、叶的特异性表达率分别为50％、8.6％、30％.从特异性表达的根、茎、叶的横切面组织切片可以看出,GUS活性主要在根、茎、叶的表皮、皮层薄壁细胞以及叶的表皮、皮层薄壁细胞和海绵组织薄壁细胞中表达.在侵染后的第26天,根本检测不到蓝色斑点,然而到了第35天就可以检测到微弱的蓝色斑点,此后逐渐增强.推测T-DNA整合到百合基因组的时间是在侵染后35天之前,T-DNA在百合基因组中开始表达的时间可能是在侵染后27～35天.

摘要： 采用GUS组织化学染色和PCR方法对T-DNA插入突变群体进行筛选,并对基因捕捉效率和T-DNA整合的时空特性进行了分析.结果表明:直接分化再生系统和愈伤组织分化再生系统的转化效率分别为64％和37.5％,前者比已报道的采用基因枪法转化同种材料的转化效率(34.5％)高出近2倍.植株总的基因捕捉频率为12.2％.其中根、短缩茎、叶、外植体、愈伤组织的基因捕捉频率分别为13.2％、34.3％、4.3％、0.9％、40％.在GUS检测呈阳性的植株中,有很多为特异性表达的,其中短缩茎、根、叶的特异性表达率分别为50％、8.6％、30％.从特异性表达的根、茎、叶的横切面组织切片可以看出,GUS活性主要在根、茎、叶的表皮、皮层薄壁细胞以及叶的表皮、皮层薄壁细胞和海绵组织薄壁细胞中表达.在侵染后的第26天,根本检测不到蓝色斑点,然而到了第35天就可以检测到微弱的蓝色斑点,此后逐渐增强.推测T-DNA整合到百合基因组的时间是在侵染后35天之前,T-DNA在百合基因组中开始表达的时间可能是在侵染后27～35天.

摘要： 采用农杆菌介导的T-DNA插入突变技术,从2400块左右的次级外植体中,通过直接分化再生系统和愈伤组织分化再生系统分别得到了4500和500株左右的NPTII抗性植株,抗性植株比率分别为187％和21％.并研究了侵染方式、侵染时间、共培养时间、转化温度以及每皿材料数对转化效率的影响.结果表明:次级外植体切块预培养3天,以不断搅动的方式在20～25 °C下侵染20分钟,再在适宜培养基中共培养2天,然后转入含选择压的适宜培养基中,以每皿200块左右的材料放置培养效果最好.

摘要： 采用农杆菌介导的T-DNA插入突变技术,从2400块左右的次级外植体中,通过直接分化再生系统和愈伤组织分化再生系统分别得到了4500和500株左右的NPTII抗性植株,抗性植株比率分别为187％和21％.并研究了侵染方式、侵染时间、共培养时间、转化温度以及每皿材料数对转化效率的影响.结果表明:次级外植体切块预培养3天,以不断搅动的方式在20～25 °C下侵染20分钟,再在适宜培养基中共培养2天,然后转入含选择压的适宜培养基中,以每皿200块左右的材料放置培养效果最好.

摘要： 本发明属于转基因技术领域，具体公开了一种获得已知TDNA侧翼序列插入基因组位点的方法。本发明通过农杆菌转化法得到转基因植株，插入植物基因组的部分为转基因载体上LB到RB区间的部分，通过已知的TDNA侧翼序列中的LB—RB区间得到插入位置附近植物基因组序列信息，从而得到转基因插入基因组的位置信息；另外，本发明不需要繁琐的实验过程以及大量的测序分析，就可得到基因组序列信息，通过一次PCR程序即可完成特异性片段的富集，在一代测序的少量数据中即可分析得到插入位置的信息，简单高效，具有一定的应用前景。

摘要： 本发明公开了一种tDNA‑FITC+CD@CaL+AF660比率荧光探针及其制备方法，和在检测pH和/或Ca