同源克隆

摘要： 落叶松-杨栅锈菌引起的杨树叶锈病是杨树的一种重要病害。通过系统发育分析和序列相似性比对确定落叶松-杨栅锈菌标准菌株基因ID 45128为酿酒酵母NHA1直系同源基因以及基因ID 116278为NHA1相关基因,分别命名为MlpNHA1和MlpNHA1-like。以夏孢子cDNA为模板,运用RT-PCR技术,同源克隆获得中国菌株MlpNHA1-like基因的ORF片段,即MlpNHA1-like(wh03),长度为1545 bp,编码514个氨基酸。结果表明,生物信息学预测分析显示MlpNHA1-like(wh03)蛋白具有与酿酒酵母NHA1蛋白相同的保守结构域c_cpa1,且同样具有系列疏水跨膜结构,亚细胞定位预测结果表明目的蛋白分布在质膜区域。通过克隆落叶松-杨栅锈菌中国菌株MlpNHA1-like基因并开展序列分析,为解析该锈菌MlpHOG1蛋白介导通路在病原菌侵染致病及响应外界胁迫中的作用提供帮助。

摘要： 以“HM1-1”“MS-5”甜瓜品种为试材,采用同源克隆的方法得到甜瓜FT同源基因,命名为CmFT,通过进化树分析、实时荧光定量方法以及分子标记辅助选择育种等方法初步验证了CmFT在甜瓜花发育过程中的作用.结果 表明:该基因全长3 843 bp,CDS区为534 bp,编码178个氨基酸.在24个甜瓜品种中开展分子标记辅助筛选准确率达87.5％.该标记与甜瓜开花性状相关,可用于甜瓜早花育种的辅助选择,研究结果对甜瓜分子育种与开花基因调控提供了参考依据.

摘要： 以虎奶菇菌丝为材料,提取、鉴定了虎奶菇锰超氧化物歧化酶,克隆虎奶菇锰超氧化物歧化酶基因.用液氮研磨、超声、硫酸铵沉淀和透析等方法提取虎奶菇Mn-SOD;WST-8法测定虎奶菇Mn-SOD酶活力;H2O2鉴定虎奶菇SOD的类型;用同源克隆、cDNA末端快速扩增技术和融合引物与巢式PCR等方法从虎奶菇中克隆锰超氧化物歧化酶基因.结果 表明,虎奶菇Mn-SOD酶活力为1.66个酶活力单位.酶经过H2O2处理后仍然有活性,与未处理无明显差异,表明虎奶菇中SOD主要是Mn-SOD.克隆获得了虎奶菇锰超氧化物歧化酶基因PtMn-SOD,其DNA序列全长1025 bp,开放阅读框全长为663 bp,编码220个氨基酸.序列分析与系统进化树表明,PtMn-SOD与属于侧耳属的糙皮侧耳(登录号:MH645359.1)关系较近.预测该蛋白质分子量为24.54 kDa,蛋白等电点为7.86.PtMn-SOD蛋白定位于线粒体,在线粒体中发挥功效.

摘要： 利用同源克隆技术从蒲公英中克隆到铜锌超氧化物歧化酶基因(Cu/ZnSOD)、抗坏血酸过氧化物酶基因(APX)和过氧化氢酶基因(CAT)3个抗氧化酶基因,采用生物信息学方法分析基因编码的氨基酸序列,利用实时荧光定量PCR方法对盐胁迫下的基因表达进行检测,以了解盐胁迫下抗氧化酶系统变化机理.结果 显示:蒲公英Cu/ZnSOD、APX和CAT的编码区序列长度分别为474、852和1 479 bp,分别编码157、283和492个氨基酸残基的抗氧化酶.多序列比对和物种进化关系表明,蒲公英3个抗氧化酶基因与莴苣和向日葵中相关基因的氨基酸序列同源性最高;与0h相比,盐胁迫处理3h和6h时,3个抗氧化酶基因的表达量迅速增加,12 h时又有所降低;海水复合盐胁迫对Cu/ZnSOD的影响相较于NaCl单盐胁迫有所提高.综上所述,盐胁迫快速诱导了蒲公英抗氧化酶基因的表达,以抵抗逆境胁迫,但经过一段时间的高盐胁迫后,过量的活性氧在植株内大量积累,对其细胞造成严重的损害,酶活性降低,植株正常生长受到抑制,细胞内基因的表达亦受到影响.

摘要： 低温冷害是小麦生长发育过程中面临的重要非生物逆境因素。为了挖掘小麦耐冷功能基因,本研究采用同源克隆的方法从普通小麦品种小偃22中分离到一个耐冷相关基因TaCTR,该基因序列全长2192 bp,含有12个外显子、11个内含子,编码区全长为1407 bp,编码468个氨基酸,分子量约为53.43 kDa;系统进化树分析表明,该基因在进化关系上与山羊草最近;亚细胞定位结果显示,该基因编码的蛋白为膜蛋白;实时荧光定量PCR(RT-PCR)结果表明,TaCTR在不同品种、不同组织和不同发育阶段低温特异表达;在干旱、高盐及GA处理下,TaCTR的表达量显著上升,说明该基因可能参与调控小麦的抗逆反应。

摘要： [目的]DELLA蛋白属于GRAS家族,是赤霉素信号转导途径中重要的转录因子,负向调节GA转导途径.克隆获得紫花苜蓿GAI,分析其基因生物信息学特征并预测蛋白结构域.明确紫花苜蓿GAI组织表达特征及不同处理下的表达模式,构建该基因超表达载体并转入紫花苜蓿,以探究DELLA蛋白基因在紫花苜蓿赤霉素(GA)信号转导途径及胁迫条件下的作用机理.[方法]利用同源克隆的方法,从紫花苜蓿中克隆得到MsGAI.利用生物信息学方法分析该基因的序列特征,使用MEGA7.0对MsGAI蛋白序列及同源序列进行多序列比对,构建同源物种间的系统发育树.利用实时荧光定量PCR检测紫花苜蓿各组织GAI表达量以及在PEG、NaCl、GA、ABA和黑暗处理下,GAI的表达变化.同时对转基因GAI株系表达水平进行分析,选择表达量高、中、低株系(L5、L8、L11)分别进行PEG和NaC1处理,分析GAI的表达变化.以pBI121为基础载体,采用双酶切-连接的方法构建植物超表达载体35S:MsGAI-gus.将重组载体转入农杆菌GV3101菌株中,以紫花苜蓿叶片为外植体,采用农杆菌介导的愈伤组织转化法转化紫花苜蓿,经PCR检测和GUS组织化学染色,得到转基因阳性苗.[结果]该基因序列包含有一个1 818 bp的开放阅读框,编码605个氨基酸.生物信息学分析结果显示,MsGAI蛋白具有GRAS家族的典型结构域和保守区,其中包含N端保守结构域DELLA和TVHYNP,C端保守结构域SAW.多序列比对及系统进化树分析表明,该序列与其他物种的DELLA蛋白序列相似度均高达80％以上,将其命名为MsGAI.该基因与蒺藜苜蓿CAI亲缘关系最近,其次与鹰嘴豆、红三叶等双子叶豆科植物亲缘关系较近,与大麦等单子叶植物较远.实时荧光定量PCR分析表明,MsGAI在紫花苜蓿各组织中均有表达,根中的表达量最高.经PEG、NaCl、GA以及ABA处理后,均有明显响应;黑暗处理显著抑制MsGAI的表达.转基因株系经PEG、NaC1处理后,GAI表达量均上调.对构建完善的35S:MsGAI-gus植物超表达载体进行双酶切检测,琼脂糖凝胶电泳显示,条带大小与预期一致.对转基因植株进行GUS组织染色验证,结果表明,阳性植株呈现蓝色,对照组为白色.对超表达载体携带的MsGAI和GUS序列进行PCR检测均呈阳性.[结论]紫花苜蓿DELLA蛋白基因的克隆和超表达载体构建成功,MsGAI对逆境胁迫有响应.

摘要： β-1,3-葡聚糖酶是植物重要的防卫蛋白之一.采用同源克隆法,从16个紫花苜蓿品种的集群DNA中分离到3个苜蓿β-1,3-葡聚糖酶基因的部分基因组编码序列,分别对应于蒺藜苜蓿3个不同的β-1,3-葡聚糖酶基因,并命名为β-1,3-葡聚糖酶基因1、 β-1,3-葡聚糖酶基因2和β-1,3-葡聚糖酶基因3.其中,β-1,3-葡聚糖酶基因2和苜蓿β-1,3-葡聚糖酶基因3及其蒺藜苜蓿对应基因与包括β-1,3-葡聚糖酶基因1在内的其他豆科同类基因遗传距离较大.序列变异分析显示,β-1,3-葡聚糖酶基因2的SNP位点间平均距离为255bp,DNA和氨基酸序列均非常保守,表明其在进化中受到了强烈的选择压力.β-1,3-葡聚糖酶基因1的SNP位点间平均距离虽然较小(31bp),但其全部21个SNP位点均为同义SNP,同时,测序片段仅发现了10个单倍型,远远小于其理论单倍型数目(221).这表明β-1,3-葡聚糖酶基因1的氨基酸序列高度保守,在功能上非常重要,少量单倍型的存在是为了调节其表达,以使苜蓿适应多种内、 外部环境条件.

摘要： WOX基因家族是一类植物特有的转录因子基因家族,在植物的生长发育过程发挥重要作用。本研究通过同源克隆的方法,得到乌拉尔图小麦(Triticum urartu)WOX基因家族的6个成员: TuWOX1、 TuWOX2、 TuWOX3、 TuWOX4、 TuWOX5和 TuWOX3a。生物信息学分析表明, TuWOX2、 TuWOX3和 TuWOX3a属于WUS支/进化支, TuWOX4属于古老支, TuWOX5属于中间支。除这三个分支外, TuWOX1自成一支,说明在乌拉尔图小麦中可能出现了不同功能的WOX家族基因。利用qRT-PCR技术对得到的WOX基因在乌拉尔图小麦不同组织的表达模式以及幼苗在不同非生物胁迫处理下的表达情况进行了分析,结果表明,WOX基因在乌拉尔图小麦各组织中均有表达,但在不同组织中的表达量差异较大,说明WOX基因在不同的组织中发挥作用;非生物胁迫条件下WOX基因表达水平发生了变化,表明其可以响应外界的胁迫。

摘要： [目的]编码区序列是基因作用机制、遗传多样性和进化关系等研究的重要资源.[方法]以盐城红茎大麦、青田红大麦、淳安六棱胭脂大麦和北青7号为材料,采用同源克隆技术分离、克隆MLOC-14401基因CDS序列,利用ORFFinder、BLAST和Clustal X等软件分析所克隆的CDS序列. [结果]MLOC-14401基因CDS序列全长1 248 bp、包含3个外显子、GC含量为62.82％,位于大麦3H染色体的609 892 778～609895 303 bp区间,起始密码(ATG)和终止密码序列(TAA)分别位于119 bp和1 366 bp位点.所编码多肽链包含415个氨基酸、2个MYB结构域,与普通小麦等9个物种的MYB基因编码多肽链具有不同程度的氨基酸序列相似性,保守序列位于105氨基酸与237氨基酸之间.[结论]MLOC-14401基因属大麦转录调控基因R2R3-MYB,所克隆的CDS序列对于大麦MYB基因作用机制等研究具有一定指导作用.

摘要： Brassica napus is an allotetraploid with complex genomic structure,but Brassica genome has a collinearity with that of rice. In this study, the homologous genes BnGS3 and BnGhd7 of Brassica napus were obtained by homologous cloning of the yield related genes GS3 and Ghd7 of rice.BnGS3 has six exons with a 666 bp of ORF and encodes 222 amino acids.BnGS3 pro-tein has VWF structure,one of the four conserved domains of rice GS3,and belongs to type A.BnGhd7 contains one exon having ORF with a full-length of 1014 bp and encoding 337 amino acids. BnGhd7 protein has two important domains, the N-terminal B-Box and the C-terminal CCT. BnGS3 and BnGhd7 were located in linkage groups A2 and A10, respectively. Polymorphism markers brgs-16 of BnGS3 and polymorphism markers brghd-3 and ghd7-7 of BnGhd7 were obtained by comparative sequencing, among which brghd-3 with thousand kernel weight (P < 0.05) and ghd7-7 with plant height (P <0.01) were positively correlated, and ghd7-7 was negatively correlated with flowering stage (P < 0.05). The results indicate that it is feasible to clone the homolo-gous genes of Brassica napus using rice functional gene sequence information,which provides an effective way in Brassica napus functional gene research.%甘蓝型油菜为异源四倍体, 基因组结构复杂, 而水稻基因组与油菜基因组具有一定的共线性.本研究利用水稻产量相关基因GS3和Ghd7序列信息, 通过同源克隆方法, 获得了甘蓝型油菜的同源基因BnGS3和BnGhd7.BnGS3有6个外显子, ORF全长666 bp, 编码222个氨基酸.BnGS3蛋白具有水稻GS3四个保守结构域中的VWF结构, 属于A型.BnGhd7含有1个外显子,ORF全长1014 bp,编码337个氨基酸.BnGhd7蛋白具有N端的B-Box和C端的CCT两个重要的结构域.BnGS3和BnGhd7分别位于A2和A10连锁群,比较测序得到BnGS3的多态性标记brgs-16及BnGhd7的多态性标记brghd-3和ghd7-7, 其中brghd-3与千粒重(P < 0.05)、ghd7-7与株高(P < 0.01)正相关, ghd7-7与开花期负相关(P < 0.05).上述结果表明, 利用水稻功能基因序列信息克隆甘蓝型油菜的同源基因是可行的, 为油菜功能基因研究提供了一种有效途径.

摘要： LATERAL SUPPRESSOR(Ls)是GRAS家族参与植物分生组织发育的转录因子,是控制植物分枝的关键基因.本研究基于青天葵(Nervilia fordii)转录组数据库,应用RACE-PCR技术克隆青天葵分枝发育相关基因Ls,命名为NfLs(登录号:KJ584362).该序列包含了1191bp的开放阅读框,共编码396个氨基酸.广布芋兰(Nervilia aragoana Gaud.)为青天葵的同属植物,形态、生长习性与广布芋兰均极为相似.以青天葵、广布芋兰(Nervili aragoana Gaud.)基因组DNA为模板,同源克隆获得青天葵NfLs、广布芋兰NaLs基因组序列,分别与NfLs编码序列一致性达100％和99％,两基因翻译成氨基酸序列完全一致,Ls基因在该物种内高度保守.通过与其他物种比对,发现LS基因在这些物种间碱基一致性为63％-75％,氨基酸序列一致性为37％-54％,保守性一般.

摘要： 为了研究B-function基因在山茶重瓣花形成中的作用,通过同源克隆的方法从红山茶(Camellia japonica)的花中发现了不同与目前已报道的B-function基因家族成员片段.通过RACE (rapid-amplification of cDNA ends)技术得到该基因编码区片段序列长度为321bp,编码107个氨基酸残基,该基因片段与已知的B-function家族成员CjHDEF、 CjDEF具有96.30％的核苷酸序列、87.16％的氨基酸序列一致性及典型的MADS-box蛋白结构域,并与B-function家族的DEF亚家族成员优先聚在一起,将其命名为CjHDEF-like,分属AP3基因亚家族.生物信息学分析发现,分离基因的编码区序列片段从第306个核苷酸开始,出现了类似polyA结构;同源比对结果显示,分离的CjHDEF-like基因的cDNA片段已经包含完整的Ⅰ-domian区域及不完整的MADS-domain和K-domain区域,尚未扩增得到C-terminal domain区域,表明尽管分离的CjHDEF-like基因cDNA序列K-domain末尾出现了polyA结构,但并非终止信号;氨基酸比对结果显示,CjHDEF-like与CjHDEF、CjDEF氨基酸序列一致性达到87.16％,其中在MADS-domain至少有3个氨基酸残基不同,Ⅰ-domian区域有2个氨基酸残基不同,K-domain氨基酸残基差异最为显著,存在至少38个氨基酸残基差异,并且这些差异距离AP3-motif基序较近的位置,表明CjHDEF-like可能参与了蛋白质复合体的形成和转录激活;Real-time PCR发现CjHDEF-like在不同花芽发育时期、完全重瓣'红十八学士'山茶花器官不同部位中表现出与CjHDEF一致的规律,即在山茶中随着花芽发育成熟表达量逐渐下降,而在重瓣'红十八学士'的初期和开花期DEF-like基因表达量大致相当,只有在中期表达量稍低;但在单瓣山茶花器官中表现出与CjHDEF、 CjOEF不同的表达特点,表现为CjHDEF-like基因在单瓣山茶花融合处(fus)表达量最高,其次是中部花下部(MP low),而在瓣化萼片(pet sep)和雌雄蕊(gyn)部几乎不表达;而CjHDEF基因在山茶花器官各部均有表达,其中在中间花下部表达量最高,其次分别是融合处、外部花的下部(OP low)和雌雄蕊,特别是在具有花瓣属性的瓣化萼片中表达量明显比萼片(sep)中表达量要高.因此我们推测:(1) CjHDEF-like基因在单瓣、完全重瓣两种花型的山茶花中表现出明显的B-function基因家族成员的典型结构域特征和基因表达规律,即在花的第二轮(花瓣)和第三轮(雄蕊)结构中高表达,CjHDEF-like可能是红山茶B-function基因家族存在第五个成员;(2)基因CjHDEF-like在雄蕊融合成花瓣中起到重要作用,可能促进了过渡型花瓣的形成,而与CjHDEF基因推动萼片瓣化成花瓣不同,我们认为它可能在山茶单瓣花向重瓣花转变中扮演重要角色,但前者可能属于雌雄蕊起源的重瓣花,而后者可能属于苞片起源的重瓣花来源.

摘要： 乙烯在植物果实成熟过程中起着重要的作用,ACO是植物乙烯生物合成的限速酶之一.本文采用同源克隆技术,获得了6个甜樱桃品种ACO基因的部分片段约1065～1069bp,其中包含甜樱桃ACO基因的3个内含子和4个外显子,其中3’端的1个外显子为部分片段.将甜樱桃6个品种的ACO基因序列进行比对,结果表明:甜樱桃品种间在ACO基因的第一个内含子和第三个内含子上有AT重复数量的差异,但并未发现与果实成熟期相关.

摘要： 通过同源克隆及cDNA未端快速扩增(RACE)的方法，从菠萝(Ananascomosus0.cv.shenwan)基因组DNA中克隆到1210bp AcSERKIDNA片段，从胚性愈伤组织cDNA中克隆到1263bpAcSERK13'端片段。经同源分析表明，它们与水稻、玉米、大麦等植物SERK同源性高达80～85％。

摘要： 植物在生长发育过程中常会受到多种生物与非生物逆境的胁迫，而转录因子在植物对胁迫应答、防御反应中发挥着重要的调控作用。在我国，小麦纹枯病、赤霉病等土传病害与非生物逆境的抗性遗传基础薄弱，常规育种徘徊不前。本文以转录因子为切入点，通过同源克隆策略，并利用RT-PCR和RACE技术，从小麦赤霉菌诱导的小麦抗病品种苏麦3号的cDNA中，分离到1个MYB转录因子编码基因TaPIMP1的全长序列，并对所创制的转TaPIMP1基因烟草进行了分子检测和功能分析。为后续的小麦抗病育种奠定一定的理论和材料基础。

摘要： 本发明涉及应用同源重组定向克隆和亚克隆的方法和组合物。具体地，本发明涉及应用细菌重组酶介导的同源重组技术进行DNA亚克隆的方法和组合物。本发明涉及克隆的方法，含有用作克隆载体的多核苷酸的组合物，含有所述多核苷酸组合物的细胞，以及由细菌重组酶介导的克隆试剂盒，所述重组酶如RecE/T和Redα/β。

摘要： 本发明涉及应用细菌重组酶介导的同源重组技术进行DNA亚克隆的方法和组合物。本发明涉及克隆的方法，含有用作克隆载体的多核苷酸的组合物，含有所述多核苷酸组合物的细胞，以及由细菌重组酶介导的克隆试剂盒，所述重组酶如RecE/T和Redα/β。

摘要： 本发明涉及一种新的分子克隆方法，具体而言，涉及通过组合利用CRISPR/Cas9系统和酿酒酵母细胞内源的同源重组系统对初始载体进行改造，以获得重组载体的方法，所述方法仅通过一次转化筛选操作，即可同时完成将一个或多个目的DNA片段插入初始载体、从初始载体上删除一个或多个DNA片段和/或将载体上的一个或多个DNA片段替换为一个或多个目的DNA片段。本发明还涉及用于方便有效地实施本发明所述方法的试剂盒。

摘要： 本发明涉及一种重组酶复合物，该重组酶复合物来源于大肠杆菌Rec同源重组酶，包括RecE、RecT和Gamma蛋白。本发明还提供了一种体外同源重组无缝克隆的方法，只需将两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合，在该重组酶复合物的催化下，高效率地将目标DNA定向克隆到任意载体的任意位点，克隆阳性率可高达95％以上。本发明的方法尤其适用于DNA大片段的克隆。本发明弥补了传统克隆方法操作繁琐、费时、失败率较高等缺陷，可以为DNA体外重组提供一种快速便捷高效的克隆方法，在细胞学基础研究和工农业生产、医药保健等方面奠定重要的基础。

摘要： 本发明涉及应用同源重组定向克隆和亚克隆的方法和组合物。具体地，本发明涉及应用细菌重组酶介导的同源重组技术进行DNA亚克隆的方法和组合物。本发明涉及克隆的方法，含有用作克隆载体的多核苷酸的组合物，含有所述多核苷酸组合物的细胞，以及由细菌重组酶介导的克隆试剂盒，所述重组酶如RecE/T和Redα/β。

摘要： 本发明涉及应用细菌重组酶介导的同源重组技术进行DNA亚克隆的方法和组合物。本发明涉及克隆的方法,含有用作克隆载体的多核苷酸的组合物,含有所述多核苷酸组合物的细胞,以及由细菌重组酶介导的克隆试剂盒,所述重组酶如RecE/T和Redα/β。

摘要： 本申请提供了一种结合基因合成和酿酒酵母内源同源重组系统的分子克隆方法，不受限于序列改变的类型(删除、突变或者插入)和复杂度，仅涉及简单的体外分子克隆操作，利用两端带有同源臂的合成序列与酵母同源重组实现原载体的无缝修改，可实现4‑150kbp穿梭质粒上多个不连续DNA区段的同步改造和多种版本的批量构建，操作简单，构建效率较高，构建成功率较高，使得本发明适用于多版本、高通量的无缝克隆操作。

摘要： 本发明公开了一种对代码克隆进行同源检测的方法，本发明是通过建立专门的源代码的特征提取后的知识库，然后基于该知识库对预设代码进行代码克隆检测，得到代码克隆检测结果，然后对代码克隆检测结果进行定性和定量分析，以确定预设代码所对应的源文件，由于本发明是根据源代码特征提取后的知识库来对预设代码进行代码克隆检测，所以本发明可以提高代码克隆的检测速度和准确率，从而有效解决了现有基于文本检测代码克隆的检测速度慢且漏报率高的问题。

摘要： 两株基因组高度同源猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株感染性克隆构建、拯救与应用，属于生物工程技术领域。本发明所构建的两个感染性克隆病毒是基于HP‑PRRSV基因组高度同源但毒力有显著差异的XJ17‑5强毒株和JSTZ1712‑12天然弱毒株。所构建感染性克隆的方法简单便捷，直接进行DNA转染，不需要体外转录成病毒RNA再转染，克服了RNA体外不稳定和易降解等缺点。所获得HP‑PRRSV感染性克隆平台可应用于体外病毒复制机制与致病机理研究。所构建HP‑PRRSV天然弱毒株感染性克隆病毒可用于研制更安全高效的新型PRRSV基因工程疫苗，有利于我国PRRSV的防控。

摘要： 本发明提供一种在酵母菌中实现高准确率基因同源克隆的方法，采用聚合酶链式反应或全基因合成的方法获得目标克隆基因上下游序列后，将上下游序列连接并插入到载体质粒上构建环状克隆载体，对环状克隆载体进行线性化处理得到线型双链DNA，将线型双链DNA经由5’→3’核酸外切酶处理，形成线型3’突出长粘端双链DNA后转化酵母菌细胞。本发明借助特殊的外源DNA结构类型，在酵母菌中实现高准确率基因同源克隆。同源基因克隆准确率可达到50～95％，能够大幅减少酵母菌同源基因克隆工作量，在酵母菌功能基因研究及基因工程菌株构建等方面具有较大应用潜力。