雪峰虫草提取物、包含该提取物的组合物和用途

摘要

本发明提供一种雪峰虫草、包含该提取物的组合物和用途，所述雪峰虫草提取物为雪峰虫草的乙酸乙酯部位，本发明提供的雪峰虫草提取物通过乙醇对雪峰虫草进行回流提取，将所得的提取液进行过滤，得到滤液和滤渣，然后对滤渣进行再次回流提取和过滤，将两次过滤所得到的滤液混合进行萃取，将所得到的的乙酸乙酯萃取液浓缩和干燥，获得乙酸乙酯部位，即雪峰虫草提取物。该提取物对动物肿瘤具有较好的抑制作用。

说明书

技术领域

本发明涉及药物化学技术领域，尤其涉及一种雪峰虫草提取物、包含该提取物的组合物和用途。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类生命的重大疾病，已经成为人类死亡的主要因素。据世界卫生组织资料显示，2020年，全球有1000万人死于恶性肿瘤，1/5的人在其一生中都会罹患恶性肿瘤。随着恶性肿瘤的发病率呈不断上升的趋势，寻找有效的抗肿瘤药物和治疗方法，是世界医学领域面临的重大挑战。中医药治疗肿瘤具有其独特的优势，在治疗恶性肿瘤中具有疗效好、多靶点、低毒性、药用资源广泛等优势。

雪峰虫草是线虫草菌科真菌雪峰虫草菌(Ophiocordyceps xuefengensisT.C.Wen,R.C.Zhu,J.C.Kang&K.D.Hyde)寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体，主要分布在湖南省武陵山片区。该品种因产于雪峰山脉，故命名为“雪峰虫草”。真菌分类学与分子生物学研究表明，雪峰虫草是目前同属真菌中与冬虫夏草亲缘关系最近的一个种。雪峰虫草具有补肺益肾、止咳化痰的功效，主治肾虚精亏、阳痿遗精、腰膝酸痛、久咳虚喘等症，民间用于增强免疫力、强身健体、防癌治癌，疗效显著。

然而，目前鲜有研究报道雪峰虫草中提取物以及将从雪峰虫草提取物与其它组分组合形成组合物，因而也没有研究报道其在制备抗肿瘤药物中的用途。

发明内容

鉴于上述问题，本发明的目的就是提供一种雪峰虫草提取物、包含该提取物的组合物和用途。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

第一个方面，本发明提供了一种雪峰虫草提取物，所述雪峰虫草提取物为雪峰虫草的乙酸乙酯部位，所述雪峰虫草的乙酸乙酯部位通过如下方法制备得到：

1)对雪峰虫草药材进行粉碎，经筛选后，得到雪峰虫草粉末；

2)用于95％的乙醇对所述雪峰虫草粉末进行回流提取，将所获得的提取液过滤，得到滤液和滤渣；

3)用95％的乙醇对滤渣进行回流提取，并过滤，将所得到的滤液与步骤2)中的滤液进行混合，得到混合滤液；

4)对所述混合滤液进行浓缩和干燥，得到浸膏；

5)将所述浸膏溶解于水中，并依次用乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，得到乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液和萃余液；

6)对所述乙酸乙酯萃取液进行浓缩和干燥，得到所述雪峰虫草的乙酸乙酯部位。

在本发明的一些实施方案中，在步骤2)中，所述乙醇的用量与所述雪峰虫草粉末的质量比为8：1。

在本发明的一些实施方案中，在步骤2)中，提取时间为。

在本发明的一些实施方案中，在步骤3)中，所述乙醇的用量与所述滤渣的质量比为6：1。

第二方面，本发明进一步提供如上述任一实施方案中所述的雪峰虫草提取物在制备抗肿瘤药物中的用途。

在本发明的一些实施方案中，所述肿瘤为肺癌。

第三个方面，本发明还进一步提供了一种组合物，包含上述任一实施方案中所述的雪峰虫草提取物或其药学上可接受的盐，任选的，还包含一种多种药用载体或赋形剂。

第四个方面，本发明还进一步提供了一种在PC9皮下肿瘤模型中进行药效学评价的方法，所述方法包括如下步骤：

1)对每只BALB/C nu/nu小鼠的皮下接种1×10

2)根据上述小鼠内瘤体大小和体重随机分为4组，即对照组、给药组1、给药组2和给药组3，其中，对照组的给药为0.5％羧甲基纤维素钠和生理盐水；给药组1的给药为0.5％羧甲基纤维素钠和4.0mg/kg顺铂；给药组2的给药为0.88g/kg雪峰虫草提取物和4.0mg/kg顺铂；给药组3的给药为雪峰虫草提取物和生理盐水，按20mL/kg经口灌胃的方式给药，每天1次，连续14天，顺铂用生理盐水配制后按10mL/kg经腹腔给药，每天1次，连续14天；

3)根据各个指标对给药前和给药后的小鼠作出药效评价，其中，所述各个指标包括：

a)小鼠给药前及给药后的反应，所述反应包括进食、大小便性状及精神状态；

b)小鼠的体重；

c)给药前以及给药后每3-4天测量肿瘤的体积；

d)瘤体的相对生长率，即瘤体的相对生长率＝(T/C)*100％，其中，T表示对照组瘤体的平均体积，C表示给药组的瘤体平均体积；

e)胸腺和脾脏指数，即胸腺或脾脏指数＝(胸腺的湿重或脾脏湿重)/体重*100％；

f)肿瘤细胞增殖指数的Ki67阳性率。

本发明提供的实施方案，至少具有如下有益效果：

1)本发明提供的雪峰虫草提取物，通过乙醇对雪峰虫草进行回流提取，将所得的提取液进行过滤，得到滤液和滤渣，然后对滤渣进行再次回流提取和过滤，将两次过滤所得到的滤液混合进行萃取，将所得到的的乙酸乙酯萃取液浓缩和干燥，获得乙酸乙酯部位，即雪峰虫草提取物。该提取物对动物肿瘤具有较好的抑制作用。

2)本发明提供的组合物，由于含有上述雪峰虫草提取物，因此，该组合物用于抗肿瘤的药物中，对动物肿瘤具有较好的抑制作用。

3)本发明提供的在PC9皮下肿瘤模型中进行药效学评价的方法，通过该药效评价方法，可以客观的指导肿瘤的用药量，以使提高药效。

除了上面所描述的本发明解决的技术问题、构成技术方案的技术特征以及由这些技术方案的技术特征所带来的有益效果外，本发明提供的雪峰虫草提取物、包含该提取物的组合物和用途所能解决的其他技术问题、技术方案中包含的其他技术特征以及这些技术特征带来的有益效果，将在具体实施方式中作出进一步详细的说明。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实验组各组中肿瘤体积随时间变化的直观图；

图2为示出图1中肿瘤体积随时间变化的曲线图；

图3为本发明实验组各组中肿瘤相对生长率随时间变化的曲线图；

图4为本发明实验组各组中小鼠的脾脏和胸腺指数的柱状图；

图5为本发明实验组各组中动物肿瘤细胞核的染色图；

图6示出了图5中Ki67+阳性细胞百分比的柱状图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特别说明，以下实施例和对比例中所用化学材料及仪器，均为常规化学材料及常规仪器，均可商购获得。

化学试剂

DMEM培养基(Gibco公司，批号：8120375)；

胎牛血清(FBS，Biological Industries，批号：1922693)；

100×青霉素-链霉素溶液(BIOSHARP公司，批号：70080300)；

0.25％胰酶(Procell公司，批号：WH01112008XP)；

PBS(Procell公司，批号：WH01112008SP)；

氯化钠注射液(湖南科伦制药有限公司，批号：D1912230)；

羧甲基纤维素钠(CMC-Na国药集团化学试剂有限公司，批号：20191203)；

多聚甲醛(Biosharp公司，批号：BL539A)；

Ki67(Servicebio公司，批号：GB111141)；

HRP标记羊抗兔二抗(Servicebio公司，批号：GB23203)；

组化试剂盒DAB显色剂(Servicebio公司，批号：G1211)；

BALB/C nu/nu小鼠，32只，雌性，6-8周龄(体重18-20g)，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2019-0004；实验动物质量合格证号：No.43004700058859，饲养于湖南省中医药研究院动物室SPF级屏障环境，光照为12小时明暗交替，实验室温度范围：20.0～26.0℃，相对湿度范围40％～70％，实验动物使用许可证号：SYXK(湘)2020-0008；鼠饲料购自湖南嘉泰实验动物有限公司，饲料生产许可证号：SCXK(湘)2015-0010；饮水由纯水仪制备，符合《生活饮用水水质处理器卫生安全与功能评价规范——反渗透处理装置》的要求；所有动物均适应性喂养3-5天，经检疫合格后开始试验。动物群笼饲养，每笼5只，自由摄食饮水；

PC9细胞：人非小细胞肺癌细胞株，来源中国科学院上海细胞库，本实验室自行传代、冻存、保种；

顺铂(冻干型)：(齐鲁制药有限公司，批号：8C0214B02)，购自中南大学湘雅三医院。

化学仪器

二氧化碳培养箱(Thermo Fisher Scientific)；

PL3002型电子天平(METTLER TOLEDO)

AB204型电子天平(METTLER TOLEDO)

游标卡尺(ProsKit)，脱水仪(徕卡仪器有限公司)

石蜡包埋仪(武汉俊杰电子有限公司)

半自动切片机(徕卡仪器有限公司)

组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)

染色脱色(武汉俊杰电子有限公司)

Eclipse Ci-L正置荧/白光拍照显微镜(Nikon公司)

全景切片扫描仪(3D HISTECH公司)。

实施例1

本实施例1提供了一种雪峰虫草的提取方法，包括如下步骤：

1)对雪峰虫草药材进行粉碎，经80目筛选后，得到雪峰虫草粉末；

2)用95％的乙醇对560g雪峰虫草粉末进行回流提取2小时，其中，乙醇与雪峰虫草的质量比为8：1，所获得的提取液过滤，得到滤液和滤渣；

3)再用95％的乙醇对滤渣进行回流提取，其中，乙醇与滤渣的质量比为6：1，经过过滤，将所得到的滤液与步骤2)中的滤液进行混合，得到混合滤液；

4)对上述混合滤液进行减压浓缩和冷冻干燥，得到浸膏；

5)将上述浸膏溶解于水中，并依次用乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，得到乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液和萃余液；

6)对乙酸乙酯萃取液进行减压浓缩和冷冻干燥，得到雪峰虫草的乙酸乙酯部位。

实验例2：PC9皮下肿瘤模型中进行药效学评价

1、细胞培养

PC9细胞培养于含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素溶液的DMEM培养基中，在细胞贴壁生长至80％-90％时，用0.25％胰酶进行消化传代，按照稀释比例转移至新培养瓶中，继续于37℃、5％CO2条件下继续培养。

2、构建裸鼠皮下移植瘤模型

PC9细胞传代培养扩增，待传代培养至足够数量后，用0.25％胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，将细胞悬液离心后去除上清液，加用无血清的DMEM培养基制成1×10

3、动物分组与剂量设计

上述动物接瘤后一周，所有动物均成瘤，根据动物瘤体大小和体重随机分为4组，即对照组、给药组1(雪峰虫草提取物)、给药组2(顺铂)、给药组3(雪峰虫草提取物+顺铂)，每组8只，按剂量设计要求给予相应受试物：

1)对照组：0.5％CMC-Na+生理盐水；

2)给药组1：雪峰虫草提取物0.88g/kg+生理盐水；

3)给药组2：0.5％CMC-Na+4.0mg/kg；(

4)给药组3：雪峰虫草提取物0.88g/kg+顺铂4.0mg/kg，雪峰虫草提取物用0.5％CMC-Na配制后，按照20mL/kg经口灌胃给药，每天一次，连续14天；顺铂用生理盐水配制后按10mL/kg腹腔注射给药，每隔天一次，连续14天。

4指标观测

1)每天观察裸鼠反应情况，包括进食、大小便性状、精神状态等；给药前及处死前分别称量并记录动物体重；

2)肿瘤体积

给药前以及给药后每3天或4天用游标卡尺测量肿瘤最长径(a)和最短径(b)，根据球体计算公式：V(mm

3)瘤体相对生长率

根据各组动物瘤体体积大小，计算肿瘤相对生长率＝T/C×100％。

其中，T表示对照组瘤体的平均体积，C表示给药组的瘤体平均体积，图3为实验组各组中肿瘤相对生长率随时间变化的曲线图，图3中的Vehicle代表对照组，XFCC表示雪峰虫草提取物，即代表给药组1，DDP表示顺铂，即代表给药组2，XFCC+DDP表示雪峰虫草提取物+顺铂，即代表给药组3。

3)胸腺指数及脾脏指数

末次给药后处死裸鼠，剪取脾脏、胸腺，揩干血迹后称重，计算胸腺及脾脏指数，即胸腺或脾脏指数＝(胸腺的湿重或脾脏湿重)/体重*100％，图4为实验组各组中小鼠的脾脏和胸腺指数的柱状图，其中，图4中纵坐标上的Thymus index表示胸腺指数，Spleen index表示脾脏指数；图4中的横坐标上的Vehicle代表对照组，XFCC表示雪峰虫草提取物，即代表给药组1，DDP表示顺铂，即代表给药组2，XFCC+DDP表示雪峰虫草提取物+顺铂，即代表给药组3。

4)肿瘤细胞的增殖指数

瘤体剥离：末次给药后处死裸鼠，剥离并摘除裸鼠移植瘤，拍照后固定于4％多聚甲醛溶液中备用，图5为实验组各组中动物肿瘤细胞核的染色图，图6示出了图5中Ki67阳性细胞百分比的柱状图，其中，图5中的雪峰虫草组代表给药组1，顺铂组代表给药组2，雪峰虫草+顺铂组代表给药组3；图6中的Vehicle代表对照组，XFCC表示雪峰虫草提取物，即代表给药组1，DDP表示顺铂，即代表给药组2，XFCC+DDP表示雪峰虫草提取物+顺铂，即代表给药组3。

具体实验方法如下：

1)固定后的肿瘤样本，经常规石蜡包埋，蜡块以4μm连续切片，分别进行免疫组织化学和HE染色；

2)石蜡切片置入65℃烘箱烘烤30min或过夜，脱蜡至水：石蜡切片烤干后置入全自动封片染色一体机脱蜡至水；

3)免疫组化笔圈定标本，内源性酶消除：将切片置于片架放入充满3％H

4)滴加一抗1滴或50-100μL(Ki67)，37℃恒温水浴箱孵育45min；PBS冲洗3min×3-5次；滴加二抗1-2滴或50-100μL，4℃孵育2h；PBS冲洗3min×3-5次；

5)每个标本滴加100μL或两滴新鲜配制的DAB显色剂，注意同一抗体控制同一反应时间，见组织显色后立刻流水漂洗，漂洗注意避免流水直冲，以免脱片；苏木素复染3min，流水漂洗；0.5％盐酸酒精分化3-4s，流水漂洗；烤片，树胶封片。用已知的阳性切片作为阳性对照，用PBS液代替一抗作为阴性对照。

结果判定：Ki67阳性细胞的细胞核呈棕褐色颗粒，用显微镜计数阳性细胞，只计数细胞核着色的细胞。每张切片随机选取5个高倍视野(×400)，每个视野计数Ki67阳性细胞及总细胞数，最后计数阳性细胞百分比＝Ki67指数阳性细胞/细胞总数×100％。

实验结果

1)裸鼠的反应情况

成瘤期间，BALB/C nu/nu小鼠的精神状态、行为活动、摄食摄水、粪便、尿液及各腔道分泌物等均未见明显异常；给药后期，给药组2及给药组3的小鼠逐渐消瘦，其中给药组2的小鼠体重较对照组明显减轻，具有统计学差异(P＜0.05)，其余各给药组动物体重未见统计学差异(见表1)。

表1受试药物对裸鼠体重的影响(

注：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

2)瘤体体积

如表2和图1、2所示，与对照组比较，给予受试药物后，各给药组动物瘤体体积均不同程度减少，给药第10天、14天给药组2、给药组3的小鼠瘤体体积明显或显著减少，具有统计学差异(P＜0.05或P＜0.01)。

表2受试药物对裸鼠瘤体体积的影响(

注：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

3)瘤体相对生长率

结果如表3和图3所示，与对照组比较，给予受试药物后，各给药组的小鼠肿瘤相对生长率均不同程度降低，给药第7天、10天、14天给药组2、给药组3的小鼠肿瘤相对生长率均明显降低，具有统计学差异(P＜0.05)。

表3受试药物对裸鼠瘤体相对生长率的影响(

注：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

4)胸腺指数及脾脏指数

结果如表4和图4所示，与对照组比较，给予受试药物后，各给药组小鼠脾脏指数和胸腺指数均未见统计学差异。

表4受试药物对裸鼠脾脏/胸腺指数的影响(

5)肿瘤细胞的增殖指数(Ki67+)

结果如表5和图5、6所示，与对照组比较，给予受试药物后，各给药组小鼠肿瘤细胞增殖指数(Ki67+)均不同程度降低，给药组2、给药组3的小鼠肿瘤细胞增殖指数明显降低，具有统计学差异(P＜0.05)。

表5受试药物对裸鼠肿瘤细胞增殖指数的影响(

综上所述，雪峰虫草提取物对人非小细胞肺癌PC9裸鼠皮下移植瘤具有一定的抑制作用。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。