抗敏止痒植物组合提取物制备工艺、功效及作用途径研究

摘要

本课题组前期对具有抗敏止痒功效的植物进行过大量的筛选工作，在此基础上本论文从抗敏、止痒、修复途径出发，通过多种功效评价方法，从10种植物提取物中筛选出功效最佳的仙人掌、苦参和麦冬提取物，并进行组合提取，得到三种植物组合提取物。运用分析化学、药理学和细胞生物学等手段阐明了组合提取物的抗敏活性物质基础、抗敏功效、安全性及其作用途径。旨在开发出可应用于护肤品中的天然抗敏植物原料，也为其应用提供理论依据和数据支撑。主要研究内容如下:
　　将前期筛选的10种具有一定抗敏止痒功效的植物分别进行提取，得到10种提取物冻干粉。通过透明质酸酶体外抑制试验快速判定10种植物提取物抗敏效果;通过磷酸组胺致豚鼠皮肤瘙痒试验判定10种植物提取物的止痒效果;通过皮肤刺激修复试验判定10种植物提取物对皮肤的修复效果。从中筛选出透明质酸酶活性抑制率最高的米邦塔仙人掌提取物，对磷酸组胺所致豚鼠皮肤瘙痒的抑制作用最强的苦参提取物，对皮肤刺激修复作用最佳的麦冬提取物。
　　从抗敏、止痒、修复三个途径入手解决皮肤过敏问题，将三种提取物组合提取，通过均匀设计试验，优选出最佳配比，即仙人掌∶苦参∶麦冬为7∶1∶3，为使工艺相对简单和操作方便，利于实现工业化生产，采用活性炭脱色法和树脂吸附离子的方法进行工艺优化研究，制备工艺如下:苦参和麦冬分别粗粉碎，过20目筛，取5g苦参和15g麦冬溶解于1100mL去离子水中，加热至90℃搅拌提取1h，降温至50℃，再加入35g仙人掌粉，保温搅拌提取1h，冷却至室温。将提取液100目滤网粗滤后，5000 r·min-1离心10min，取上清液，上清液过0.8μm孔径纸板精滤，得到澄清透亮精滤液。精滤液经过活性炭脱色后（活性炭添加量为1.0％、脱色温度为80℃、脱色时间为0.5h），过活化好的离子交换树脂（阳离子001×7，阴离子树脂D309），将去离子后的料液收集，浓缩，制备成冻干粉。测定冻干粉中的活性成分含量，其中多糖含量为634.6mg·g-1，蛋白含量为38.4mg·g-1，多酚含量为56.8mg·g-1，氧化苦参碱含量为4.98mg·g-1，苦参碱含量为3.12mg·g-1，多糖为组合提取物的主要成分。
　　通过透明质酸酶活性抑制试验，验证了同浓度下的组合提取物比单一的各组分提取物抗敏效果更佳。采用豚鼠磷酸组胺致痒反应试验、低分子右旋糖酐诱发小鼠皮肤瘙痒试验和小鼠腹腔毛细血管通透性试验，综合评价了组合提取物的抗敏功效。组合提取物高剂量与氟轻松组比较差异无统计学意义(p＞0.05)，这表明组合提取物能减轻磷酸组胺对皮肤造成的瘙痒症状，具有一定的止痒功效;组合提取物3个剂量组都能减少低分子右旋糖酐致小鼠瘙痒发作次数、延长潜伏时间，高剂量组与模型组相比，差异有统计学意义（**p＜0.01）;小鼠腹腔毛细血管通透性的影响实验同样表明，与模型组相比较，氟轻松软膏、组合提取物高剂量组对降低毛细血管的通透性有显著作用（*P＜0.05），能大大降低皮肤红肿症状的表现程度，具有一定的抗敏功效。
　　采用红细胞溶血试验、BCOP试验和人体斑贴试验对组合提取物进行安全性评价。红细胞溶血试验结果表明，组合提取物在一般化妆品配方中添加的浓度范围(1％)下，溶血率均小于5％，说明组合提取物温和无刺激，安全性高，低浓度和高浓度下都可在护肤品中安全添加;BCOP试验和人体斑贴试验可以看出，组合提取物对牛角膜和人体皮肤无任何刺激性，涂抹含有组合提取物的乳液后，还能减弱刺激源对皮肤所造成的损伤，在一定程度上保护表皮细胞膜结构完整性及屏障功能，提高皮肤的耐受性，真正具有修复受损肌肤减轻过敏症状的功效。同时也对组合提取物化妆品配方剂型的应用进行了研究，得到了不同剂型的护肤品的配方及制备工艺。
　　在具有抗敏止痒功效及安全性保障前提之下，对组合提取物的抗敏途径及作用机理进行了探究。通过DPPH自由基清除试验，发现组合提取物能够清除自由基，减弱自由基对人体嗜碱细胞和肥大细胞细胞膜的破坏，从而间接降低组胺的释放量，起到抗敏止痒的功效。TEWL试验结果表明，组合提取物能提升皮肤屏障功能，降低皮肤中水分的散失量，从而在一定程度上能提升皮肤的自我保护能力，降低敏感程度。经成分分析，组合提取物中多糖成分主要起到减少水分散失，增强屏障功能的效果。
　　建立了PMA和A23187联合诱导KU812细胞组胺释放模型，用来评价提取物对组胺释放的影响，结果表明，经PMA和A23187联合诱导后，模型对照组组胺含量明显升高，与空白对照组比较有显著性差异（**p＜0.01）。KU812细胞经组合提取物处理后，组胺含量明显降低，高、中、低剂量组抑制率分别为45.23％、39.91％和33.45％，这表明组合提取物能通过抑制组胺的释放量，从而减轻过敏症状，起到抗敏的功效。
　　采用PMA联合钙离子载体诱导方法建立KU812细胞脱颗粒体外模型，结果显示，经PMA和A23187诱导后，KU812细胞释放TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8促炎细胞因子，使用组合提取物干预后，高、中、低剂量的组合提取物均可显著下调TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的表达水平，且呈剂量依赖性。说明组合提取物可以通过抑制组胺和一系列促炎因子的释放，从而减轻过敏反应中出现的皮肤病理损伤等症状。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 皮肤过敏及瘙痒的产生机制和类型

1．1．1 皮肤过敏产生机制

1．1．2 皮肤过敏及其致敏原的特点

1．1．3 皮肤瘙痒发生机制

1．1．4 皮肤瘙痒研究进展

1．1．5 化妆品中常见致敏原

1．1．6 皮肤过敏研究现状

1．2 抗敏止痒途径

1．2．1 隔离致敏原

1．2．2 提高皮肤保护功能

1．2．3 抑制炎症介质的释放

1．2．4 提高皮肤自身修复功能

1．3 抗敏止痒评价方法

1．3．1 透明质酸酶活性抑制实验

1．3．2 细胞试验

1．3．3 动物试验

1．3．4 人体试验

1．4 植物原料安全性评价方法

1．4．1 RBC溶血试验

1．4．2 BCOP试验

1．4．3 斑贴试验

1．5 抗敏止痒植物及其活性成分

1．5．1 牡丹皮

1．5．2 紫苏

1．5．3 黄芩

1．5．4 仙人掌

1．5．5 马齿苋

1．5．6 苦参

1．6 本课题的研究内容与创新点

1．6．1 主要研究内容

1．6．2 本课题创新点

1．7 技术路线

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 材料

2．1．2 试剂

2．1．3 仪器

2．2 试验方法

2．2．1 植物提取物制备

2．2．2 组合提取物工艺优化筛选

2．2．3 组合提取物成分分析

2．2．4 提取物抗敏功效评价方法

2．2．5 抑制皮肤瘙痒评价方法

2．2．6 皮肤刺激修复试验

2．2．7 组合提取物安全性评价

2．2．8 配方工艺研究

2．2．9 组合提取物抗敏止痒作用途径的研究

3 结果与分析

3．1 十种提取物抗敏功效筛选

3．1．1 透明质酸酶体外抑制试验

3．1．2 对磷酸组胺所致豚鼠皮肤瘙痒的影响

3．1．3 皮肤刺激修复效果

3．2 组合提取物制备工艺

3．2．1 均匀设计法优选组合比例

3．2．2 组合提取液脱色

3．2．3 组合提取液脱盐

3．2．4 组合提取物优化后工艺

3．3 组合提取物主要化学成分

3．4 组合提取物抗敏止痒功效

3．4．1 透明质酸酶体外抑制试验

3．4．2 对磷酸组胺致豚鼠皮肤瘙痒的影响

3．4．3 对低分子右旋糖酐诱发小鼠皮肤瘙痒的影响

3．4．4 对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

3．5 组合提取物安全性评价结果

3．5．1 RBC溶血试验

3．5．2 牛角膜浑浊和渗透性试验(BCOP试验)

3．5．3 人体斑贴试验

3．6 组合提取物配方工艺研究

3．6．1 爽肤水配方工艺

3．6．2 乳液配方工艺

3．6．3 膏霜配方工艺

3．6．4 面膜配方工艺

3．7 组合提取物作用途径研究

3．7．1 清除DPPH自由基试验

3．7．2 水分经皮散失(TEWL)测定

3．7．3 对KU812细胞组胺释放的影响

3．7．4 对KU812细胞促炎性细胞因子表达的影响

4 讨论

4．1 筛选出具有抗敏止痒的植物

4．2 组合提取物实现工业化制备

4．3 组合提取物成分及功效

4．4 组合提取物作用途径研究

4．5 下一步工作展望

5 结论

致谢

参考文献

攻读博士学位期间发表的学术论文