一种检测异源cfDNA的多重PCR引物设计、引物组及检测方法及其用途

摘要

本发明公开一种检测异源cfDNA的多重PCR引物设计、引物组及检测方法及其用途包括：基于筛选的SNP位点设计多重PCR引物：使用primer3 NGS‑PrimerPlex设计时考虑成对引物间引物二聚体及发夹结构的因素，自动优化筛选获得最多可用引物对数；文库构建：通过3轮PCR扩增获得测序文库，其中，第1、2轮为特异性引物扩增，并加入接头通用序列和单分子标签(UMI)，第3轮扩增加入测序通用引物；由于接头上标记有单分子标签(UMI)和随机序列index，对于始末位点相同的测序reads，就很容易判断它们来自同一还是多个原始细胞释放出来的cfDNA，从而降低测序duplication，从而保证了对cfDNA中超低频突变的检测能力。本发明的有益效果是：本技术方案耗时短，成本低，准确率高，检测灵敏度高。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域应用，尤其涉及一种检测异源cfDNA的多重PCR 引物设计、引物组及检测方法及其用途。

背景技术

肾移植是临床治疗终末期肾病的优选手段，而影响肾移植术后患者生存率 的最重要原因为排斥反应的发生。移植排斥分为超急性、急性、边缘型急性、 亚临床急性或慢性,急性排斥反应(acute rejection,AR)是目前肾移植术后的主 要危险并发症，也是导致慢性排斥反应和移植肾失功的最重要的危险因素。早 期诊断及时治疗AR可以有效减少移植器官的病理损害程度，延长移植器官的存 活时间。

通常诊断发生急性排斥反应的指标有：患者临床表现、各项生化指标(丙氨 酸氨基转移酶、总胆红素、碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转移酶、肌酐或心肌酶谱) 和组织活检。前两项检测的灵敏度和特异性低，且检测结果依赖于临床医生的 临床经验易产生偏差。

穿刺活检一直是肾移植排异反应检测的金标准，但组织活检花费大，属创 伤性检查常伴随并发症，包括：疼痛、血尿、肾血肿、移植物血栓症、败血症、 休克和移植物衰竭等。近年来诊断肾移植急性排斥反应的发生，一直朝向寻找 非侵入性无创检测的方向努力。血清中肌酐水平的增高通常是诊断肾移植后排 斥反应的一个有效指标，但肌酐检测具有非特异性，除了肾排斥反应，肾移植 患者排异药物中毒引起的急性肾衰竭也会导致肌酐升高，因此，肌酐水平的监 测不宜单独作为判断肾移植排斥反应的依据。目前，肾移植患者面临的主要临 床问题之一就是缺少用于早期诊断和连续监控移植物排斥风险的高灵敏度、高 特异性且非侵入性的检测。

游离DNA(cell free DNA,cfDNA)，是指游离于细胞外的部分降解了的机 体内源DNA，主要来自于细胞的凋亡或坏死。异源或自体的体细胞突变DNA 都可以在本体的血液中检测到，例如孕妇、肿瘤患者和器官移植患者。由于 cfDNA的半衰期很短(16min)，cfDNA作为生物标志物的潜力巨大。Dennis Lo 最早在女性肝、肾移植患者的血浆中检测到来自男性供体组织的游离DNA，被 认为是供体器官在患者体内凋亡或坏死，细胞裂解释放出的cfDNA，游离DNA 可以作为器官移植排异的标志物(参见Presence of donor-specific DNAin plasma of kidney and liver-transplant recipients.Lancet.1998 May 2；351(9112):1329-30.)。 正常状态下受体血液中供体来源的cfDNA几乎没有或者含量是极低的，通过检 测器官移植受体中供体来源的cfDNA的比例，可用于判断器官移植后是否发生排斥反应。

在中国专利文献CN106544407A中公开了一种确定受体cfDNA样本中供体来源cfDNA的比例的方法，通过获取器官移植的受体样本的基因组DNA，对基因组 DNA目标区域捕获测序，用于基因分型；同时对移植后受体的血浆cfDNA样本 进行目标区域的捕获和测序，用以分析供体cfDNA占总cfDNA的比例。然而上 述文献中的技术方案在应用于检测肾移植受体中的供体cfDNA比例时还存在如 下缺陷：一、文献中的SNP位点的选择仅以次等位基因频率(MAF)为筛选条 件，缺少对临床肾移植患者易突变基因，特别是相关药用基因组学检测，因此 缺少对肾移植排斥反应的针对性检测，无法为免疫排斥反应的个体提供临床个体化用药依据；二、肾移植排斥反应的病人中，供体来源的cfDNA含量低于肺 移植和肝移植等器官移植排斥反应病人的外周血中cfDNA,使得将异源cfDNA 信号从测序错误和PCR扩增错误信号中区分出来的难度加大，文献中提供的 cfDNA建库方法无法实现对cfDNA的单分子特异性标记，在对测序数据分析时 会引入偏差和错误。我司已授权的专利ZL201710334862.1中公开了一种确定受 体cfDNA样本中供体来源cfDNA的比例的方法与CN106544407A相比增加了 单分子特异性标记，克服了测序数据分析时会引入偏差和错误的问题，但以上 方法均是基于目标区域杂交捕获方法，存在耗时长，成本高的缺陷

本发明主要解决的技术问题是提供一种检测异源cfDNA的多重PCR引物设 计、引物组及检测方法及其用途，解决上述现有技术问题中的一个或者多个。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：一种检测SNP分子 标记的多重引物设计方法，其创新点在于：包括如下步骤：

S1：中国人群全基因组common SNP筛选

首先，选取dbSNP数据库中高频SNP位点，进行变异位点频率过滤，要求 VAF小于0.6且大于0.4；

进而选取二态SNP位点，过滤掉含有高频(VAF>0.1)(>＝3allele)SNP的位 点；

再过滤掉基因组比对非唯一Blacklist区：根据数据库提供的区域，删除处 于该区域的SNP位点；

选取GC分布均匀位点，通过统计SNP位点附件100bp的碱基序列GC含 量来判断附近位点GC分布情况；选取标准为0.4

过滤已知致病位点：根据已知疾病数据库收录位点信息来过滤掉上述筛选 得到的SNP位点中已知致病位点；

S2：中国人群高频SNP位置筛选

将上一步过滤得到的SNP位点在中国人群数据库cmdb中注释，得到相应 变异频率信息；选取数据库中高频SNP位点，进行变异位点频率过滤，要求VAF 小于0.6且大于0.4；

进一步过滤GC分布不均一位点：以SNP附近60bp提取基因组序列得到的 一段DNA片段，对其分别截取前,中,后40bp分别统计各段GC含量，过滤掉任 意一段不符合0.4

过滤附近的60bp范围内碱基唯一性较差的区域位点：以SNP附近60bp提 取基因组序列得到的一段DNA片段，对其分别截取30bp k-mers分别统计k-mers 出现频率，筛选掉含有非唯一k-mers的片段对应SNP位点；并将DNA片段与 基因组序列比对，查找可能的除自身位置外比对位点，过滤掉出现的非唯一比 对位点；

过滤附近60bp(ACTG)n位点：以SNP附近60bp提取基因组序列得到的一 段DNA片段，对其分别统计每条序列所含AAAA,TTTT,CCCC,GGGG出现次 数，过滤掉含出现2次及以上次数的DNA片段对应SNP位点；

选取SNP在基因组上分布均匀位点:对SNP在基因组上分布的相对距过滤， 选取位点间距离不小于5kb的SNPs用做下面引物设计；

S3：Multiplex PCR引物筛选主要包括以下主要步骤：

首先运用Primer 3Based Software---NGS-PrimerPlex软件对选取的每100 个SNP位点设计多重引物，设计参数为：【-regions${regionsBED}-ref ${hg38}-th${THREADS}-run${running_name}-minampllen80-maxampllen120-opt ampllen100-minprimerlen17-maxprimerlen25-optprimerlen22-minprimermelt60-maxprimermelt68-optprimermelt64-minprimergc40-maxprimergc60-optprimergc50-minprimerendgc0-maxprimerendgc5-optprimerendgc2-maxprimerpolyn8-maxprimercomplendth25-maxprimercomplanyth35-maxprimerhairpinth40-maxprimernonspec10000-maxoverlap50-primernum150-tries10000-returnvariantsnum10-minprimershift5-optextampllen150-maxextampllen150-subst2-maxnonspeclen200-freq0.05-nucs6-minmultdimerdg1-6-minmultdimerdg2-10-maxneighborinter5-mv50-dv3-dntp0.8-primerconc250--dbsnp-vcf${dbSNPvcf}-autoadjust-embedded-snps-skip】；

引物设计时考虑的一些因素：NGS-PrimerPlex使用primer3设计时考虑成 对引物间引物二聚体及发夹结构，会自动优化；引物设计时Primer 3使用参 数:PRIMER_OPT_SIZE:22(optimal length of primers)；PRIMER_OPT_TM:64 (optimal meltingtemperature of primers,degrees Celsius)； PRIMER_OPT_GC_PERCENT:50(optimalacceptable GC-content for primers)…；

由于在有限时间内和实际使用测试得出只能每次设计100左右个SNP位点 的多重引物，后续平行设计出来的引物对需要进一步primer dimer形成评估才能 有效使用；因此，将得到的所有引物集合合并，做下面筛选；

根据NGS-PrimerPlex软件中检查引物对之间primer dimer形成和互作方法， 对得到的引物两两做互作检查，减少最后primer dimmer形成机会；这一步使用 了评估引物对互作数，过滤高频互作引物对，多轮删除筛选方法，保证最终得 到的引物对间最少primer dimmer形成次数和得到最多可用引物对数；

接着，我们对SNP附近断裂位点查找(由自主积累数据库提供数据)，通过 查找可能的游离DNA偏向性断裂位点，过滤潜在SNP附近断裂位点引物对做 删除筛选；

进而，我们利用分析工具PrimerROC anlysis对得到的引物对进行了primerdimers检测，进一步做了筛选过滤。

一种检测异源cfDNA的多重PCR引物组，其创新点在于：所述引物组基于 特异性引物添加测序通用序列构成；正向引物组序列包括5’-US1+UMI+SP1-3’； 其中，US1为适配于illumina测序平台的通用序列5’ -ACACGACGCTCTTCCGATCT-3’(SEQ ID NO.1),UMI为随机碱基组成的单 分子标签，长度在4到12bp之间,SP1为根据选择的SNP位点两端序列设计的特异性引物中正向引物序列。反向引物组序列包括5’-US2+SP2-3’；其中，US2 为适配于illumina测序平台的通用序列5’-TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-3’(SEQ ID NO.2)，SP2为根据选择的SNP 位点两端序列设计的特异性引物中反向引物序列。

一种检测异源cfDNA的多重PCR检测方法，其创新点在于：通过对cfDNA 样本进行多重PCR扩增获得目标区域，测序得到异源cfDNA含量；第一轮扩增 通过正向引物组序列进行扩增，扩增循环数为1个循环，扩增使用的DNA聚合 酶以适用于多重PCR反应的为佳，第一轮扩增产物去除残留引物，所述去除残 留引物方法包括采用核酸外切酶(EXOI)进行酶切，采用核酸纯化磁珠筛选， 采用柱式法去除；

第二轮扩增通过反向引物组和通用引物进行扩增，扩增循环数为1到5个 循环，所述的通用引物序列为5’-ACACGACGCTCTTCCGATCT-3’(SEQ ID NO.3)；第三轮扩增使用接头引物P5/P7，以得到完成的文库，扩增循环数在15 到25个循环；其中，P5引物序列为5’ -AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTT CCGATC-3’(SEQ ID NO.4)，P7引物序列为5’- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGT GTGCTCTTCCGATC-3’(SEQ ID NO.5)，具体地，P7引物序列中包括6个碱 基长度的Barcode序列，用以区分样本；对该流程中所述纯化步骤，按照0.8-1.5 ×比例加入纯化磁珠，用80％乙醇洗涤两遍，最后用相应体积的去离子水进行 洗脱获得用于测序的文库；

将上述多重PCR扩增的目标区域文库进行高通量测序检测cfDNA在有效 SNP位点处的异源SNP信号；计算异源SNP信号占cfDNA在有效SNP位点处 总测序信号的比例，即得到异源cfDNA的定量结果。

本发明的有益效果是：本技术方案耗时短，成本低，准确率高，检测灵敏 度高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所 需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明 的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下， 还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1为本发明实施例2添加单分子标签的多重PCR方法构建文库流程图。

图2为本发明实施例2得到的文库电泳图。

图3为本发明实施例4中检测健康人和两例肾移植排斥患者的结果图

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描 述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中 的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其 它实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1和图2所示，本发明实施例包括：

多重PCR引物设计：

本发明提供了一种检测所述SNP分子标记的多重引物设计方法，所述引物 是基于所述SNP位点设计而成的；所述SNP位点如表1所示，所述引物包括 上游引物和下游引物，所述上游引物的序列是以所述SNP位点为坐标起点，向 5’方向延伸60bp的碱基序列为序列信息设计的；所述下游引物的序列是以所 述SNP位点为坐标起点，向3’方向延伸60bp碱基序列为序列信息设计的。

本设计共包含以下主要步骤：

中国人群全基因组common SNP筛选

首先，选取dbSNP数据库中高频SNP位点，进行变异位点频率过滤，要求 VAF小于0.6且大于0.4；进而选取二态SNP位点，过滤掉含有高频(VAF>0.1) (>＝3allele)SNP的位点；再过滤掉基因组比对非唯一Blacklist区域：根据数据库 (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgFileUi？db＝hg19&g＝wgEncodeMapability)提 供的区域，删除处于该区域的SNP位点；选取GC分布均匀位点，通过统计SNP 位点附件100bp的碱基序列GC含量来判断附近位点GC分布情况；选取标准为 0.4

表1目标SNP位点

Multiplex PCR引物筛选主要包括以下主要步骤：

运用Primer 3 Based Software---NGS-PrimerPlex软件对选取的每100个SNP位点设计多重引物，设计参数为：【-regions${regionsBED}-ref${hg38} -th${THREADS}-run${running_name}-minampllen 80-maxampllen 120-optampllen 100-minprimerlen 17-maxprimerlen 25-optprimerlen 22-minprimermelt 60-maxprimermelt 68-optprimermelt 64 -minprimergc 40-maxprimergc 60-optprimergc 50-minprimerendgc0 -maxprimerendgc 5-optprimerendgc 2-maxprimerpolyn 8 -maxprimercomplendth25-maxprimercomplanyth 35-maxprimerhairpinth 40 -maxprimernonspec 10000-maxoverlap 50-primernum1 50-tries 10000 -returnvariantsnum 10-minprimershift5-optextampllen 150 -maxextampllen 150-subst 2-maxnonspeclen 200-freq 0.05-nucs 6 -minmultdimerdg1-6-minmultdimerdg2-10-maxneighborinter 5-mv 50-dv 3-dntp 0.8-primerconc 250--dbsnp-vcf${dbSNPvcf} -autoadjust-embedded-snps-skip】

引物设计时考虑的一些因素：NGS-PrimerPlex使用primer3设计时考虑成 对引物间引物二聚体及发夹结构，会自动优化；引物设计时Primer 3使用参 数:PRIMER_OPT_SIZE:22(optimal length of primers)；PRIMER_OPT_TM:64 (optimal meltingtemperature of primers,degrees Celsius)； PRIMER_OPT_GC_PERCENT:50(optimalacceptable GC-content for primers)…

由于在有限时间内和实际使用测试得出只能每次设计100左右个SNP位点 的多重引物，后续平行设计出来的引物对需要进一步primer dimer形成评估才能 有效使用；因此，将得到的所有引物集合合并，做下面筛选；根据NGS-PrimerPlex 软件中检查引物对之间primer dimer形成和互作方法，对得到的引物两两做互作 检查，减少最后primerdimmer形成机会；这一步使用了评估引物对互作数，过 滤高频互作引物对，多轮删除筛选方法，保证最终得到的引物对间最少primer dimmer形成次数和得到最多可用引物对数；接着，我们对SNP附近断裂位点 查找(由自主积累数据库提供数据)，通过查找可能的游离DNA偏向性断裂位 点，过滤潜在SNP附近断裂位点引物对做删除筛选；进而，我们利用分析工具PrimerROC anlysis对得到的引物对进行了primer dimers检测，进一步做了筛选 过滤。

本发明提供了一种检测异源cfDNA的多重PCR引物组，所述引物组基于的 特异性引物添加测序通用序列构成。正向引物组序列包括5’-US1+UMI+SP1-3’； 其中，US1为适配于illumina测序平台的通用序列5’ -ACACGACGCTCTTCCGATCT-3’(SEQ ID NO.1),UMI为随机碱基组成的单 分子标签，长度在4到12bp之间,SP1为根据选择的SNP位点两端序列设计的 特异性引物中正向引物序列。反向引物组序列包括5’-US2+SP2-3’；其中， US2为适配于illumina测序平台的通用序列5’ -TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-3’(SEQ ID NO.2)，SP2为根据选择的SNP 位点两端序列设计的特异性引物中反向引物序列。

本发明提供了一种检测异源cfDNA的多重PCR检测方法；通过所述多重 PCR引物组，对cfDNA样本进行多重PCR扩增获得目标区域，测序得到异源 cfDNA含量；第一轮扩增通过正向引物组序列进行扩增，扩增循环数为1个循 环，扩增使用的DNA聚合酶以适用于多重PCR反应的为佳，如Phusion U Green Multiplex PCR Master Mix(Thermo Scientific)等；第一轮扩增产物去除残留引 物，所述去除残留引物方法包括采用核酸外切酶(EXOI)进行酶切，如Thermo Scientific Exonuclease I(EN0581)、Sangon Biotech(C610019)等；采用核酸纯 化磁珠筛选，如Agencourt AMPure XP；采用柱式法去除，如GeneRead SizeSelection Kit等；第二轮扩增通过反向引物组和通用引物进行扩增，扩增循环数 为1到5个循环，所述的通用引物序列为5’-ACACGACGCTCTTCCGATCT-3’ (SEQ ID NO.3)；第三轮扩增使用接头引物P5/P7，以得到完成的文库，扩增循 环数在15到25个循环。其中，P5引物序列为5’ -AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTT CCGATC-3’(SEQ IDNO.4)，P7引物序列为5’- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-3’(SEQ ID NO.5)，具体地，P7引物序列中包括6个碱 基长度的Barcode序列，用以区分样本；对该流程中所述纯化步骤，按照0.8-1.5 ×比例加入纯化磁珠，用80％乙醇洗涤两遍，最后用相应体积的去离子水进行 洗脱获得用于测序的文库。

将上述多重PCR扩增的目标区域文库进行高通量测序检测cfDNA在有效 SNP位点处的异源SNP信号；计算异源SNP信号占cfDNA在有效SNP位点处 总测序信号的比例，即得到异源cfDNA的定量结果。

实施例1.cfDNA提取

1、样本采集和血浆分离

(1)样本采集：抽取供体血液8ml左右，用抗凝血管保存运输；

(2)血浆分离：获得新鲜全血样本，1600g，4℃离心10min，分离上清液 至新的离心管，将上清液继续16000g，4℃离心10min，离心后的上清液转移至 新的离心管，得到分离后的血浆，血浆可在-20℃下保存；

(3)血细胞分离：全血样本离心后的下层沉淀即为血细胞。

2、取1.8mL血浆采用Circulating Nucleic Acid kit(Qiagen,Cat.No55114)进行游离DNA提取，得到cfDNA，Qubit 3.0定量。

实施例2.多重PCR文库构建

取10ng游离DNA作模板，进行第一轮扩增，反应体系包括Phusion U GreenMultiplex PCR Master Mix(2X)12.5uL，正向引物1uL，DNA模板10ng，用水 补足25uL。反应条件为预变性98℃/30s、变性98℃/10s、退火60℃/1min、延伸 72℃/30s、总延伸72℃/5min。反应结束，加入2uL核酸外切酶(EXOI，EN0581)， 酶切条件为37℃/15min、85℃/15min。将得到的酶切产物用核酸纯化磁珠进行 纯化。所述的退火温度依据引物设计的Tm值，包括55℃到65℃之间。

将通用引物和反向引物加入到上述纯化产物中进行第二轮PCR扩增，反应 体系包括Phusion U Green Multiplex PCR Master Mix(2X)12.5uL，正反向引物 各1uL，纯化产物11.5uL。反应条件为预变性98℃/30s、变性98℃/10s、退火 60℃/1min、延伸72℃/30s、5个循环、总延伸72℃/5min。所述循环数包括1到 5个循环。将得到的扩增产物用核酸纯化磁珠再次进行纯化。

将接头引物(P5/P7)加入到上述纯化产物中进行第三轮PCR扩增。反应体系 包括Phusion U Green Multiplex PCR Master Mix(2X)12.5uL，正反向引物各1uL， 纯化产物11.5uL。反应条件为预变性98℃/30s、变性98℃/10s、退火60℃/1min、 延伸72℃/30s、15个循环、总延伸72℃/5min。所述循环数包括15到25个循环。 将得到的扩增产物用核酸纯化磁珠进行纯化，得到最终文库，采用Qubit定量。 最终文库电泳结果可见图2，条带大小在200-240bp的范围内。

送测：样本数据量为10M Reads，插入片段选择178(测序平台为illumine X-Ten，或其他高通量测序平台)。

实施例3异源cfDNA定量分析

1、对基因组DNA文库和cfDNA文库高通量测序后数据call SNP(samtool)， 提取5764个SNP位点信息；

2、对基因组DNA文库中的5764个SNP位点进行分析，进行基因分型， 测序深度为50X时，即可获得基因分型；筛选受体患者基因组上为纯合型的SNP 位点作为有效SNP位点；

3、根据步骤2中的有效SNP位点对cfDNA文库进行分析，检测cfDNA测 序结果的有效位点处异源SNP信号占cfDNA在有效位点处总测序信号的比例；

4、计算方式如下所示：假设受体患者基因组上有一个有效SNP位点，基因 组上纯合型的位点基因型为AA，检测到异源SNP信号为a，则可以得到供体在 此位点的基因型为Aa或aa,基因分型如表2所示，根据异源SNP信号的两种基 因型，统计异源cfDNA信号，计算出异源cfDNA浓度，如下：

表2基因分型

当供体基因型为aa，异源信号比例＝a型reads数/A型reads数；

当供体基因型为Aa，异源信号比例＝2*a型reads数/A型reads数。

实施例4肾移植排斥患者检测

选择两例活检后确认有排斥反应的肾移植病人，以健康人作为阴性对照， 检测肾移植病人血浆中的cfDNA异源信号，在健康的对照样本中，未检出异源 cfDNA信号，图3中仅显示健康样本的测序噪音；在两例肾移植排斥病人中可 以检出明显的cfDNA信号，说明异源cfDNA的定量方法检测灵敏度和准确度高。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利 用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其 它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。