一种基于新型引物设计策略的丙型肝炎病毒逆转录荧光定量PCR检测方法的研究

摘要

病毒感染在世界范围内危害着人类的健康，可以导致各种急性慢性疾病，甚至死亡。感染人类的病毒主要是DNA或RNA病毒，如EB病毒、人乳头瘤病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒等。目前普遍的治疗方法是抗病毒治疗，而抗病毒治疗的决策、用药的剂量、疾病的预后等的重要依据是病毒载量检测。病毒载量检测的金标准是病毒核酸的定量检测(quantitative nucleic acid testing，NAT)，目前常用的是荧光定量PCR检测方法。然而，标本中的病毒核酸在不恰当的采集、运送、保存和处理的情况下具有不稳定性，若用目前现有的商品化试剂盒的核酸定量检测方法检测，病毒核酸的不稳定性将导致其检测效率降低，甚至出现假阴性结果。我们的目标是建立一种方法，做到即使在病毒核酸不稳定时，仍能尽可能地检出患者体内原始的病毒载量，以此来克服核酸不稳定性对病毒载量检测和抗病毒治疗造成的影响。由于HCV RNA是典型的具有不稳定性的病毒核酸，本文以此作为研究对象。
　　本文基于HCV RNA的降解机制，发展了一种新的引物设计策略，即除了秉承经典的引物设计原则中引物设计在保守区外，还提出了引物设计要避开酶切位点，使目的片段的长度尽可能短的策略，从而降低模板被酶切降解的几率。基于该引物设计策略，我们建立了一种新的HCV RNA逆转录荧光定量PCR(reversetranscription quantitative real-time PCR，RT-qPCR)方法。本方法包括了HCV RNA的引物探针设计、核酸提取和核酸扩增三大步骤。RNA的引物探针根据本文的引物设计策略进行设计;RNA提取采用的是QIAGEN的RNA提取方法，但不同的是所用的提取柱是MiRcute，该提取柱能吸附甚至＜100nt的RNA片段;RNA的扩增用的是自建的优化后体系和反应条件，对RNA进行一步法的逆转录和扩增。为验证新的提取方法（MiRcute提取柱）的优势，我们将其与QIAGEN的RNA提取方法进行比较，同时提取降解的HCV RNA样本后扩增，比较检测的病毒载量。为验证新的RT-qPCR方法的性能，对RT-qPCR进行了方法学性能评价，包括线性、最低检出限(limit of detection，LOD)、灵敏度、特异性以及和商品化试剂盒检测的一致性。为验证其临床实用性，我们对RT-qPCR方法进行了临床标本检测，并与CAP/CTM(@)和KeHua(@)对相同临床标本的检测结果进行了统计学比较。为验证引物设计策略的正确性，我们另外设计了3对引物，扩增依次延长的目的片段，并将这3对引物与本方法中根据设计原则设计的引物进行统计学比较。
　　结果显示，第一，新的提取方法（MiRcute提取柱）比QIAGEN的RNA提取方法更有优势，具有统计学差异(p＜0.037)。说明新的提取方法能够吸附更多的降解的HCV RNA小片段，从而提高了扩增效率。第二，新的RT-qPCR方法具有很好的方法学检测性能:线性R2=0.99;最低检出限LOD为46.06 IU/mL(40.65-54.07IU/mL，95％置信区间);灵敏度的批内变异系数(coefficient of variation，CV)为0.93％-1.34％，批间变异系数CV为1.06％-3.34％;具有100％的特异性;与商品化试剂盒CAP/CTM(@)检测的样本具有高度相关性(R=0.957)。第三，新的RT-qPCR方法具有良好的临床实用性。在病毒核酸稳定时，本文方法与商品化试剂盒CAP/CTM(@)和KeHua(@)对临床样本的检测没有统计学差异(p＞0.05);而当病毒核酸不稳定时，本文方法与商品化试剂盒CAP/CTM(@)和KeHua(@)对临床样本的检测相比，有统计学差异(p＜0.05)，此时CAP/CTM(@)和KeHua(@)对不稳定病毒核酸的检测值都比稳定时有所下降（其中以KeHua(@)下降的更多），而本文新的RT-qPCR方法在降解后的检测值与降解前比没有统计学差异，仍然能最大限度地反映降解前患者血清中的病毒载量。第四，实验证明了新引物设计策略的正确性。在RNA降解样本中，随着目的片段的延长，RNA的扩增效率下降，即扩增效率62-bp＞157-bp＞222-bp＞304-bp，目的片段越短、避开酶切位点，被酶切降解的几率越小。
　　我们创新性地将二级结构和酶切位点考虑到引物设计原则中，建立了新的引物设计策略。并且利用此策略成功地建立了一种新的RT-qPCR方法。该方法克服了由于标本采集、运输、保存、处理不当导致的商品化试剂盒检测效率降低的弊端，即使在病毒核酸不稳定的情况下，依然能最大限度地反映出其原始病毒载量，从而为临床对HCV的诊断、治疗、预后提供准确依据。同时，由于病毒核酸中都有二级结构和酶切位点，新的引物设计策略也可以应用于其他RNA或DNA病毒的检测中，为开发其他病毒的新型检测方法奠定了基础。

目录

声明

英文缩略词

摘要

前言

1．材料和方法

1．1．实验材料和试剂配制

1．2．方法

1．2．1．HCV RNA新的引物设计策略的制定

1．2．2．HCV RNA新的检测体系的建立

1．2．3．HCV RNA检测体系的优化

1．2．4．HCV RNA检测体系的方法学性能评价

1．2．5．HCV RNA新的引物设计策略的正确性验证

1．2．6．HCV RNA新的检测方法的临床实用性验证

1．3．统计学分析

2．结果

2．1．HCV RNA新的检测体系的建立

2．1．1．未优化体系经验条件下初测

2．2．HCV RNA检测体系的优化

2．2．1．最佳核酸提取柱的确定

2．2．2．最佳核酸扩增体系和循环参数的确定

2．3．HCV RNA检测体系的方法学性能评价

2．3．1．最低检出限

2．3．2．重复性

2．3．3．特异性

2．3．4．线性

2．3．5．一致性

2．4．HCV RNA新的引物设计策略的正确性验证

2．4．1．多对扩增引物的长度比较和位置分布

2．4．2．RNA稳定时引物设计长度和位置的影响

2．4．3．RNA不稳定时引物设计长度和位置的影响

2．5．HCV RNA新的检测方法的临床实用性验证

2．5．1．RNA稳定时与商品化试剂盒比较

2．5．2．RNA不稳定时与商品化试剂盒比较

3．讨论

参考文献

论文综述 RNA降解机制和意义的研

附录

致谢

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