基于原位合成天然低共熔溶剂-预处理结合顶空固相微萃取提取植物中挥发性成分的方法

摘要

本发明提供了一种基于原位合成天然低共熔溶剂‑预处理结合顶空固相微萃取提取植物中挥发性成分的方法，本发明将低共熔溶剂制备‑预处理‑萃取过程合为一体，加快萃取反应的进行，从而加快对植物中挥发性成分的提取；本发明克服了传统挥发性提取技术存在装置复杂、成本高、提取时间长、能耗大等缺点，提供了一种高效、绿色环保的新型高效提取植物中挥发性成分的方法，该方法可以获得更多的挥发性成分，尤其是高沸点物质，为植物挥发性成分的提取提供一个新的手段。

说明书

技术领域

本发明涉及提取植物中挥发性成分的方法，具体涉及一种基于原位天然低共熔溶剂合成-预处理-顶空固相微萃取提取植物中挥发性成分的方法。

背景技术

植物挥发性成分是植物的次生代谢产物，主要分布于芳香植物的花、叶、茎、果皮、根等部位，主要存在于芳香植物的腺毛、油室、油管中，通过蒸馏、压榨、萃取和吸附等方式富集提取出来的一类具有挥发性芳香气味物质。芳香植物的药用性能及生理活性是建立在其理化成分的基础上，尤其是挥发性成分的组成及含量，决定了芳香植物的风味呈现、理化功能的输出，也是芳香植物具有诱食、刺激食欲功效的物质基础，因此对其进行研究与开发仍然是学术界的一大热点。

植物挥发性成分的提取多采用水蒸汽蒸馏法(steamdistillation,SD)，固相微萃取法(solid-phasemicroextraction,SPME)及顶空法(headspace,HS)。其中固相微萃取是一种简单、快速、灵敏和方便的样品制备技术，在仪器分析之前将采样和样品制备步骤整合在一起，最大限度地减少了溶剂使用量。此外，顶空固相微萃取(HS-SPME)已广泛用于测定小麦、甜瓜、白麦芽和乌龙茶等植物中的挥发性化合物。

预处理是一种必不可少的步骤来达到克服植物细胞壁的天然顽固性，并促进细胞内化合物的释放的效果。近年来，低共熔溶剂(deep eutectic solvents,DES)作为一种新的流体出现，其由氢键供体(HBD)和受体(HBA)组成，形成一种熔点低于单个组分熔点的新溶剂混合物。同时它们具有微蒸汽压低、不可燃性、低毒性、可生物降解等独特的物理化学性质。此外，DES还被证实是一种良好的预处理溶剂，它具有显著的破坏纤维素、半纤维素和木质素的能力，促进植物细胞开裂，有利于从破碎的细胞中释放挥发性成分。天然低共熔溶剂(Natural deep eutectic solvents，NADES)是由有机酸、氨基酸、糖、胆碱或尿素等天然产物直接组成的，因其由活细胞内的初级代谢产物组成而受到越来越多的关注。NADES的优点是由天然化合物组成，更具可持续性，而且几乎不会对环境造成危害。

现今，加热搅拌法是最常用的用于制备天然低共熔溶剂的方法，其需要较长的合成时间。另一方面，在植物挥发性成分提取中，比较常用的是先进行预处理后再进行萃取的方法，但方法存在所需要的时间较多和能量消耗较高的缺点，在科学界存在一定的争议。与上述两阶段工艺相比，一种新型采用原位合成低共熔溶剂-预处理顶空固相微萃取的方法，将低共熔溶剂制备-预处理-萃取过程合为一体，因为其具有更短的反应时间、更低的能耗等优点，是现今最绿色、最有前途的技术之一。

本发明致力于开发一种基于原位合成天然低共熔溶剂-预处理结合顶空固相微萃取提取植物中挥发性成分的方法，其中萃取过程将天然低共熔溶剂的合成-预处理-萃取合为一体，该方法利用原位合成-预处理省时、节能的特点和新型绿色溶剂的破壁作用，通过原位合成低共熔溶剂-预处理并结合顶空固相微萃取对植物中挥发性成分进行鉴定，旨在开发一种装置简单、操作方便，且能与其它分析仪器联用，对植物挥发性成分能进行有效地分析测定的方法，对植物品种的确定及其品质的分析具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种新型原位合成天然低共熔溶剂-预处理结合顶空固相微萃取提取植物中挥发性成分的方法。本发明方法操作简便，提供一种高效、绿色环保的新型高效提取植物中挥发性成分的新方法，该方法适用范围广。

本发明的基本构思充分利用了原位合成低共熔溶剂同时预处理萃取的手段，其具有耗时低，装置简单、高效节能等优点以及新型绿色溶剂破坏细胞壁的特点：(1)原位合成低共熔溶剂预处理，将低共熔溶剂制备-预处理-萃取过程合为一体，加快萃取反应的进行，从而加快对植物中挥发性成分的提取。(2)天然低共熔溶剂作为一种溶解细胞壁的溶剂，有利于细胞壁中的纤维素的溶解，促进细胞内更多化合物的释放。

本发明方法使用原位合成天然低共熔溶剂-预处理并结合顶空固相微萃取适用于不同植物中挥发性成分的提取，并且更省时节能。

本发明的技术方案如下：

一种基于原位合成天然低共熔溶剂-预处理结合顶空固相微萃取提取植物中挥发性成分的方法，所述方法为：

取植物样品置于顶空瓶中，加入氢键供体、氢键受体和水，升温至30～150℃(优选90℃)搅拌15～75min(优选60min)，同时插入萃取纤维头顶空吸附，完成挥发性成分的提取；

所述植物样品例如可以为下列中的至少一种：姜黄、八角茴香、生姜、紫苏、丁香；

所述植物样品与氢键受体的质量比为1：2；

所述氢键受体、氢键供体的物质的量之比为1：0.5～2；氢键受体、氢键供体与水混合后，混合物中含水量在20％；

所述氢键受体为氯化胆碱；

所述氢键供体为蔗糖、果糖、丙二酸、草酸或尿素；

优选所述氢键受体为氯化胆碱，所述氢键供体为草酸，并且氯化胆碱与草酸的物质的量之比为1：2；

所述萃取纤维头为二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)萃取纤维头(购自美国Supelco公司，规格为50/30μm，2cm)。

本发明提取得到的植物挥发性成分可通过GC-MS分析测定，方法如下：

样品检测：将萃取纤维头插入气相色谱-质谱联用仪进样口脱附5min，用气相色谱-质谱联用仪进行分析，得到样品气相色谱图和质谱图，通过与NIST程序中收录的与估算保留指数或文献报导保留指数作比较进行定性；

气相色谱条件为：色谱柱DB-5MS(长度30m×内径0.25mm×膜厚0.25μm)，初始柱温为20～50℃保持3～5min，然后以4～8℃/min升至80～100℃并且保持1～5min，再以2～8℃/min升至230～260℃并且保持3～6min；载气为高纯度的氦气(≥99.999％)，流速为1mL/min；进样口温度为250℃，不分流模式进样；

质谱条件为：选择离子扫描模式，离子阱温度为180℃，传输线温度为250℃，岐管温度为50℃，电子碰撞能量为70eV。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明首先提出了一种结合低共熔溶剂制备-预处理于一体的方法。

2、采用新型绿色溶剂(天然低共熔溶剂)作为提取剂，克服了传统挥发性成分提取中使用毒性较大的有机试剂为提取溶剂，减少对环境的污染。

3、首次使用原位合成天然低共熔溶剂-预处理与顶空固相萃取技术相结合，克服了传统挥发性提取技术存在装置复杂、成本高、提取时间长、能耗大等缺点。

4、与传统的提取方法相比，原位合成低共熔溶剂-预处理与传统方法具有相同的性质的同时拥有比传统方法具有更快，更节能的特点。

5、与单纯固相微萃取相比，基于原位合成天然低共熔溶剂预处理-顶空固相微萃取的新方法可以获得更多的挥发性成分，尤其是高沸点物质。

6、应用本发明能结合实际，为植物挥发性成分的提取提供一个新的手段。

附图说明

图1为本发明建立的绿色溶剂低共熔溶剂与顶空固相萃取技术相结合的过程示意图；

图2a、2b、2c、2d分别为实施例1中的新型绿色溶剂的类型、萃取时间、萃取温度、纤维种类的优化结果；

图3为实施例1中的三种不同萃取方法总离子流图；A、原位低共熔溶剂合成预处理-顶空固相微萃取；B、加热条件下顶空固相微萃取；C、单纯顶空固相微萃取。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步描述本发明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：植物八角茴香挥发性成分的提取

取植物样品0.5g置于顶空瓶中，加入一定摩尔比的氢键供体和氢键受体和一定量的水(混合物中含水量在20％)，升温至90℃搅拌处理60min，同时插入萃取纤维头顶空吸附，完成挥发性成分的提取，随后进行GC-MS分析。

表1天然低共熔溶剂的组成

表2优化种类后天然低共熔溶剂的组成

样品检测：将纤维头插入气相色谱-质谱联用仪进样口脱附5min，用气相色谱-质谱联用仪进行分析。

气相色谱条件为：色谱柱DB-5MS(长度30m×内径0.25mm×膜厚0.25μm)，初始柱温为45℃保持3min，然后以5℃/min升至90℃并且保持1min，再以3℃/min升至250℃并且保持5min；载气为高纯度的氦气(≥99.999％)，流速为1mL/min；进样口温度为250℃，不分流模式进样；

质谱条件为：选择离子扫描模式，离子阱温度为180℃，传输线温度为250℃，岐管温度为50℃，电子碰撞能量为70eV；

成分定性通过采集所得到的质谱图利用NIST(2011版本)谱库检索完成；同时采用Kovats保留指数定性的方法来辅助质谱检索定性。研究证实，质谱检索与保留指数相结合的二维定性是一种可信度较高的定性方法。在进行保留指数定性时，参考色谱柱选用DB-5MS或DB-5的文献值，而实验值与文献值的差异一般以1％作为检索尺度。研究中所用的正构烷烃标准样品为C8-C20，利用峰面积归一化方法进行相对含量的定量分析。

(3)条件优化

以总峰面积、识别的化合物数目作为主要评价标准，在最优条件下，通过此方法在八角茴香中一共测定化合物34种。

(4)方法评估

使用相对标准偏差评估方法的精确度，在最优条件下，重复测量样品6次。总峰面积的RSD值分别为10.5％。结果表明，该方法对挥发性成分的萃取具有良好的精密度，适用于对挥发性成分的分析。

为了评估方法，与其他方法进行对比，其实验条件如下：

加热状态下的固相微萃取：将0.5g八角茴香样品放入4mL顶空玻璃萃取瓶，升温至90℃，平衡60分钟；同时用DVB/CAR/PDMS(50/30μm，2cm)的SPME萃取杆通过顶空瓶的密封垫片插入萃取瓶中，并将其纤维暴露于样品上方的顶部空间进行萃取；萃取完成后，将SPME萃取杆拔出并直接插入气相色谱-质谱联用仪的进样口。

固相微萃取法：将0.5g八角茴香样品放入4mL顶空玻璃萃取瓶中，室温30℃±2℃下平衡60分钟；同时用DVB/CAR/PDMS(50/30μm，2cm)的SPME萃取杆通过顶空瓶的密封垫片插入萃取瓶中，并将其纤维暴露于样品上方的顶部空间进行萃取；萃取完成后，将SPME萃取杆拔出并直接插入气相色谱-质谱联用仪的进样口。

经过最终的测得化合物的数目评价该方法，通过挥发性成分总离子流图比较，经过加热状态下的固相微萃取；单纯固相微萃取法；原位合成天然低共熔溶剂-预处理固相微萃取三种方法取得化合物分别为23，21，34种。

分析表明，采用原位天然低共熔溶剂合成预处理-顶空固相微萃取测定得到的八角茴香中挥发性成分比采用固相微萃取或加热状态下固相微萃取测定八角茴香样品中的挥发性成分更为复杂。因此，该方法作为一种快速、简单、环保、可靠的分析八角茴香中挥发性成分的新方法，有适用于提取其他植物挥发性成分的潜力。