一种自然共生的混合培养物发酵粗饲料生产内切葡聚糖酶的方法

摘要

本发明涉及生物技术可再生能源领域，具体涉及一种自然共生的混合培养物YakQH5发酵粗饲料底物生产内切葡聚糖酶的方法，所述的混合培养物YakQH5由厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacter gottschalkii)组成，能够降解不同的粗饲料，并产生高酶活的内切葡聚糖酶，其中降解小麦壳产生的内切葡聚糖酶活性可达到1170mU，获得了显著的效果；在发酵过程中添加复合抗生素，还可以防止混合培养物YakQH5在发酵过程中不受细菌污染，进一步提高厌氧发酵效率。本发明中采用的混合培养物可以保藏在体外存活传代，便于推广，为生产提供了方便。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术可再生能源领域，具体为一种自然共生的混合培养物发酵粗饲料生产内切葡聚糖酶的方法。

背景技术

近年来在全球范围随着人口数量增加，生活质量的提高导致对能源的需求急剧上升。传统能源物质面临枯竭的危险，且这些传统能源物质在使用时产生了大量温室气体，污染环境。缓解当今人类而临的“粮食、能源、环境”三大危机是实现农业可持续发展战略的重要途径之一。秸秆、干草和秕壳等粗饲料作为可再生能源物质受到越来越多的关注。粗饲料是指天然水分含量在60％以下，干物质中粗纤维含量等于或高于18％，并以风干物形式饲喂的饲料，如牧草、农作物秸秆、树叶、酒糟和秕壳等。粗饲料的主要成分是木质纤维素，纤维含量高，蛋白质、矿物质含低，适口性差，因此畜禽消化率低，从而限制了它的应用，因此在饲喂动物时必须进行预处理，提高它的营养价值和适口性。小麦是我国的主要粮食作物，播种面积广泛，小麦成熟后，需要把麦粒从麦壳里脱出，麦粒从壳里脱落后剩下小麦壳，为小麦生产加工副产物，每年伴随产生的小麦秸秆和小麦壳数量是非常巨大的。粗饲料的预处理包括物理、化学、生物学方法。目前，对木质纤维素的降解利用主要采用生物学手段，即采用能分泌有效酶类的微生物来降解木质纤维素。

近40年的研究表明：厌氧真菌在木质纤维素的降解中起到了重要作用。厌氧真菌中的大多数种属都能够通过其假根分泌高活性酶，包括纤维素酶、半纤维素酶(主要是木聚糖酶)和酯酶等，这些酶类协同作用分解利用结构复杂的，晶体状的纤维素、半纤维素、果胶和木质素等物质。纤维素酶主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶。纤维素酶中最主要的成分是内切葡聚糖酶。内切葡聚糖酶作用于纤维素分子内部非结晶区，通过水解β-1,4-糖苷键将长链纤维素大分子截短，产生带还原性末端的小分子纤维素。外切-β-葡聚糖酶作用于纤维素线状分子末端，每次从纤维素分子两端切下纤维二糖分子。β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖和纤维三糖等多种纤维寡糖成葡萄糖。以上3种酶协同作用将纤维素降解为葡萄糖。细菌、真菌和动植物都能够产内切葡聚糖酶，但内切葡聚糖酶主要来源是土壤中的细菌和各类好氧真菌，内切葡聚糖酶对自然界的碳循环具有十分重要的作用。内切葡聚糖酶应用广泛，在能源、纺织、饲料、食品和造纸等行业发挥了重要的作用。细菌的内切葡聚糖酶产量较低，大多在细胞内，分离提取困难，在工业上较少应用。真菌产内切葡聚糖酶大多分泌到胞外，目前里氏木霉等好氧真菌是工业用内切葡聚糖酶的重要生产菌株。一些甲烷菌可以利用厌氧真菌的代谢产物，如氢气、甲烷、甲酸等，与厌氧真菌形成稳定的共培养物，即：厌氧真菌和甲烷菌共培养物，这个过程促进了厌氧真菌和甲烷菌的生长，同时显著提高了厌氧真菌降解木质纤维素所产生的各种木质纤维素降解酶活性和对木质纤维素的降解能力。

牦牛适应高寒生态条件，耐粗饲、耐严寒、耐低氧的恶劣自然环境。牦牛瘤胃内栖息着独特的，复杂多样，大量的微生物群落协同高效降解野牧草为牦牛提供生存能量和营养物质。漫长的自然选择和进化使牦牛瘤胃成为一个高效降解木质纤维素的天然厌氧发酵罐。放牧牦牛瘤胃内存在着自然的厌氧真菌和甲烷菌共培养物，它们能够分泌高活性的木质纤维素降解酶(包括多糖水解酶和酯酶等)降解野生牧草和冷季干枯牧草为牦牛提供生长的营养，因此从牦牛瘤胃分离厌氧真菌和甲烷菌共培养物应用于降解廉价木质纤维素底物生产高活性木质纤维素降解酶在工业应用方面具有重要意义。采用牦牛瘤胃厌氧真菌和甲烷菌共培养物降解秸秆生产高活性内切葡聚糖酶，是一个首创的，有效的手段。发明人在攻读博士期间首次研究了放牧牦牛瘤胃厌氧真菌和甲烷菌共培养物分别以小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆为底物进行厌氧发酵(魏亚琴.牦牛瘤胃厌氧真菌与甲烷菌共培养物的多样性及其纤维降解特性研究[D].2016.)，通过检测产气量、多糖水解酶活性、各种酯酶活性、干物质降解率、酚酸释放量、甲烷和乙酸产量来评估厌氧真菌和甲烷菌共培养物降解秸秆功效，其中高效降解以上三大秸秆的厌氧真菌和甲烷菌共培养物N.frontalis Yak16+M.ruminantium，Piromyces Yak18+M.ruminantium和O.joyonii Yak7+M.ruminantium分别降解三大秸秆所产生的内切葡聚糖酶活性都低于200mU，不能达到产生高酶活内切葡聚糖酶的效果。

在上述研究的基础上，发明人继续致力于高活性的共培养筛选及发酵秸秆产生高酶活的酶、产气量等，发明人意外的从青藏高原青海省海南州藏族自治区星海县的放牧牦牛瘤胃中分离出的厌氧真菌(Neocallimastix.frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacter.gottschalkii)的混合培养物YakQH5，所述的混合培养物分别以小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆、燕麦秸秆、黄豆秸秆、胡麻秸秆、麸皮、番茄渣、花生壳、小麦壳为底物厌氧发酵生产内切葡聚糖酶，取得了意想不到的效果。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的第一目的是提供一种自然共生的混合培养物YakQH5发酵生产内切葡聚糖酶的方法，所述的混合培养物YakQH5由厌氧真菌(Neocallimastixfrontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacter gottschalkii)组成，所述的方法包括如下步骤：

(1)混合培养物YakQH5菌剂的制备：以10％v/v接种量向以小麦秸秆为底物的厌氧培养基中接入混合培养物YakQH5，加入复合抗生素厌氧培养即得到高活力的菌剂；

(2)生产内切葡聚糖酶：吸取步骤(1)所得菌剂，以10％v/v接种量接入含有1％w/v底物的厌氧培养基中，加入1％v/v复合抗生素厌氧培养。

优选地，所述的混合培养物YakQH5于2020年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19299，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，电话：010-64807355。

优选地，所述的步骤(1)中厌氧培养的温度为39℃，时间为72小时；所述的步骤(2)中厌氧培养的温度为39℃，时间为5天。

优选地，所述的复合抗生素为青霉素钠和硫酸链霉素，在厌氧培养基上的浓度分别为1600IU/mL和2000IU/mL。

优选地，厌氧培养基配方为：酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，NaHCO

优选地，所述的盐溶液I配制步骤如下：NaCl 6g，(NH

优选地，所述的盐溶液II配制步骤如下：4g K

优选地，所述的步骤(2)加入粗饲料底物后除氧，充入二氧化碳，高温高压灭菌。

优选地，所述的步骤(2)加入的底物分别为小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆、燕麦秸秆、黄豆秸秆、胡麻秸秆、麸皮、番茄渣、花生壳和小麦壳中的一种或几种。

优选地，所述的步骤(2)加入的底物为小麦壳。

本发明的有益效果是：①本发明中采用的厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacter gottschalkii)的混合培养物YakQH5是从牦牛瘤胃液中分离获得的，牦牛瘤胃中的微生物协同降解低质野草为牦牛提供生存必需的营养物质，使牦牛适应青藏高原的严酷环境而生存。长期的自然选择和进化使牦牛瘤胃成为一个高效木质纤维素降解酶系统，与人工混合的厌氧真菌和甲烷菌共培养物相比，牦牛瘤胃自然存在的厌氧真菌和甲烷菌共培养物具有高效降解木质纤维素的显著优势。②采用混合培养物YakQH5厌氧发酵降解10种底物，包括小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆、燕麦秸秆、黄豆秸秆、胡麻秸秆、麸皮、番茄渣、花生壳和小麦壳，其中降解小麦壳产生的内切葡聚糖酶活性可达到1170mU，获得了显著的效果。③在发酵过程中添加复合抗生素，可防止混合培养物体系不受细菌污染，提高厌氧发酵效率。④本发明中采用的混合培养物可以通过保藏在体外存活传代，便于推广，为生产提供了极大的方便。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的培养基如下：

厌氧培养基配方：酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，NaHCO

盐溶液I配制步骤如下：NaCl 6g，(NH

盐溶液II配制步骤如下：4g K

传代培养基：在厌氧培养基中添加1％w/v的粉碎风干的小麦秸秆。然后除氧后灭菌。

除氧方法：厌氧管或厌氧瓶通过针头接入带有真空泵和高纯CO

厌氧发酵罐又称厌氧发酵瓶，是在一个密闭罐体内完成料液的发酵、沼气产生的过程，主要用来满足微生物的生活条件，使它们在合适的环境中生活，以达到发酵旺盛，产气量高的目的。

实施例一、混合培养物YakQH5菌剂的制备

吸取1mL混合培养物YakQH5接种到亨氏厌氧管中的9mL以风干粉碎的小麦秸秆为底物的厌氧培养基中，同时加入0.1mL复合抗生素(1600IU/mL青霉素和2000IU/mL硫酸链霉素)，39℃厌氧培养72h，即达到生长高峰，此时发酵液为高活力菌剂。

实施例二、混合培养物YakQH5发酵生产内切葡聚糖酶

在100mL体积厌氧发酵瓶中盛45mL液体基本培养基，分别以0.5g干燥粉碎后的小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆、燕麦秸秆、黄豆秸秆、胡麻秸秆、麸皮、番茄渣、花生壳和小麦壳作为底物。除氧，然后高压灭菌。把实施例一得到的混合培养物YakQH5用无菌注射器吸取5mL分别接种到上述加有底物的厌氧培养基中，同时加入0.5mL复合抗生素(1600IU/mL青霉素和2000IU/mL硫酸链霉素)，39℃厌氧培养5天。共设置3个平行实验，隔24h测定厌氧瓶中的内切葡聚糖酶酶活性。

内切葡聚糖酶活力测定：稀释的粗酶液、底物10g/L羧甲基纤维素钠和50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)置39℃预热15min，750μL粗酶液中加入750μL磷酸钠缓冲液和500μL底物，39℃反应15min后，加入3000μL DNS终止反应。沸水浴5min后冷却至室温，取250μL于酶标板中，在酶标仪所设540nm下3检测吸光值。根据标准曲线计算内切葡聚糖酶的活性。一个酶活性单位U定义为:在上述条件下，每毫升每分钟自标准底物羧甲基纤维素钠中释放1.0μmol葡萄糖所需的酶量。

表1 10种底物的木质纤维素成分和酚酸含量表

注：DM：干物质，NDF：中性洗涤纤维素，ADF：中性洗涤纤维素，ADL：酸性洗涤木质素，FA：阿魏酸，PCA：香豆酸酯酶，VA：香草酸，PRA：原儿茶酸。—，表示未检出。

表2自然共生的混合培养物YakQH5发酵不同底物5天培养期的内切葡聚糖酶活性

注：

实验结果显示，自然的混合培养物(N.frontalis+M.gottschalkii)YakQH5在5天培养期内分别降解10种粗饲料产生胞外酶—内切葡聚糖酶的活性达到的最高值分别为：以小麦秸秆为底物450mU，以玉米秸秆为底物501mU，以水稻秸秆为底物929mU，以燕麦秸秆为底物498mU，以黄豆秸秆为底物398mU，以胡麻秸秆为底物409mU，以麸皮为底物385mU，以番茄渣为底物307mU，以花生壳为底物95mU，尤其以小麦壳为底物达到1170mU，具有重要的工业应用价值。