用于酶电催化还原的氧化还原酶电极及其制备方法和其酶电反应器

摘要

本发明涉及用于酶电催化还原的氧化还原酶电极及其制备方法和其酶电反应器。与酶电极检测检测限低、灵敏度高的要求相比，酶电催化要求能耐受高浓度底物、酶稳定性好，催化效率高。本发明的辅酶与酶共固定化在电极上，可实现辅酶原位再生，提高反应效率，可实现手性化合物的酶电催化高效制备，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物催化技术领域，尤其涉及一种高效酶生物电催化反应器及其还原制备手性化合物的方法和应用。

背景技术

生物电催化合成无副产物、选择性高，以其高效和绿色环保等优势受到关注。酶通过与外界环境进行双向电子传递和能量代谢，可以实现多种电催化过程。目前生物电催化主要集中于微生物电合成系统，酶电催化还原较少且集中于多酶耦联电催化体系催化固定化CO

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了氧化还原酶电反应器及其制备方法和应用。本发明构建得到一种新型的氧化还原酶电反应器，为生物分子的电化学反应提供了一个良好的微环境，酶电催化还原效率高、稳定性好，可用于生物电催化制备手性药物中间体。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：

一种用于酶电催化还原的氧化还原酶电极，包括基底电极、电子传导体、电子中介体、酶和辅酶；所述电子传导体包括氧化石墨烯(GO)、还原氧化石墨烯(rGO)、碳纳米管(MWNT)、聚多巴胺(PDA)、纳米金、MOF、聚乙烯亚胺(PEI)或仿生矿化TiO

其中，所述的酶为依赖NADH或依赖NADPH的脱氢酶，优选包括氨基酸脱氢酶、胺脱氢酶、醇脱氢酶或酮还原酶中的至少一种。

其中，所述基底电极包括碳纸电极(CP)、玻碳电极(GCE)、或石墨电极等，优选比表面积较大的基底电极，如碳纸电极和热解石墨电极。

其中，所述电子中介体包括5-甲基吩嗪硫酸甲酯、甲苯胺蓝、麦尔多拉蓝或亚甲基蓝中的至少一种。

其中，所述电子传导体可以是以下组合：所述电子传导体包括GO和MOF；或所述电子传导体包括碳纳米管、PDA和纳米金；或所述电子传导体包括rGO、PDA和纳米金；或所述电子传导体包括rGO、PEI和仿生矿化TiO

本发明的氧化还原酶电极中，辅酶与酶共固定化在电极上可实现辅酶原位再生，提高催化效率。离子液体可作传统玻碳电极的改性剂和粘合剂，添加ILs的石墨烯可解决其在电极表面难以直接修饰的问题，且IL较高的导电性加速了辅酶NAD(P)H与电极之间的电子转移。碳纸等具有大的比表面积的基底电极增加了酶在电极表面的负载量。氧化还原媒介有机小分子在电化学活性蛋白与无机材料电极之间的“分子桥梁”作用，加速了电子穿梭，改进了电极材料的生物相容性。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：

一种氧化还原酶电极的制备方法，将酶与电子传导体的固定化混合物与电子中介体、辅酶复合于所述基底电极表面，得到所述氧化还原酶电极。

具体地，所述酶与电子传导体的固定化混合物的制备方法包括：

所述电子传导体包括GO和MOF时，在氧化石墨烯溶液中加入MOF的金属离子，进而加入0.1～100mg/mL的所述酶，0～50℃下搅拌下加入MOF的配体，进行反应获得金属-有机框架(MOF)并原位固定化酶，得到所述酶与电子传导体的固定化混合物；进一步地，所述原位固定化酶的反应可在基底电极上进行；或，

所述电子传导体包括碳纳米管、PDA和纳米金时，在碳纳米管溶液中加入聚多巴胺，得到碳纳米管-聚多巴胺的溶液；将碳纳米管-聚多巴胺的溶液与纳米金前体反应制得含有纳米金的碳纳米管-聚多巴胺的溶液，另将所述酶与含有纳米金的碳纳米管-聚多巴胺的溶液混合，得到所述酶与电子传导体的固定化混合物；或，

所述电子传导体包括rGO、PDA和纳米金时，在rGO溶液中加入DA和所述酶，与纳米金前体反应并固定化酶，得到所述酶与电子传导体的固定化混合物；或，

所述电子传导体包括rGO、PEI和仿生矿化TiO

进一步地，所述金属-有机框架(MOF)的配体包括均苯三甲酸(H

进一步地，所述离子型辅酶NADH-IL或者高分子修饰的辅酶(PEI-Fc-NADH)辅酶与电子中介体形成凝胶，所述酶与电子传导体的固定化混合物与所述凝胶复合于所述基底电极表面，实现所述脱氢酶、辅酶和电子中介体在电极表面共固定，辅酶原位再生，提高催化效率。

进一步地，所述电子中介体、辅酶(NADH-IL或PEI-Fc-NADH)与离子液体(用于溶解NADH-IL或PEI-Fc-NADH)形成所述凝胶；所述离子液体包括1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑氯盐、或N,N'-(亚甲基)双(1-(3-乙烯基咪唑))溴中的至少一种。

进一步地，所述PEI-Fc-NADH(高分子共价连接的辅酶)的制备方法包括：分别配制0.1～0.7mmol/mL和0.05～0.2mmol/mL的聚乙烯亚胺(PEI)和二茂铁甲醛(Fc)的乙醇溶液，将Fc的乙醇溶液在1～3h内逐滴加到PEI的乙醇溶液中，继续搅拌反应1～3h。加入终浓度为0.1～1.0mmol/mL硼氢化钠，继续反应1～4h。向残留物中加入1～10mL蒸馏水，用蒸馏水透析12h，得到PEI-Fc。将10～100mmol丁二酸酐溶于6～30mL二甲亚砜，将0.0745～0.5g NAD

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：

一种用于酶电催化还原的酶电反应器，所述酶电反应器采用三电极体系，以上述的氧化还原酶电极为工作电极；参比电极选自饱和甘汞电极、氢电极、银|氯化银电极或汞|氧化汞电极；对电极为铂丝电极或碳电极。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之四是：

一种利用酶电反应器进行催化还原反应的方法，以循环伏安法和/或计时电流法的方式进行反应；所述循环伏安法的电位扫描速率为1～500mV/s；在加入1～20mg辅酶NADH的缓冲液中进行，反应前通入N

具体地，基于一次性塑料试管设计1.5～100mL设计生物电催化微反应器；设计反应器三电极体系，固定有酶和凝胶的碳纸(5×5mm～5×5cm)作为工作电极，对电极为铂丝电极，Ag/AgCl为参比电极。在加入NADH-IL(NADH-离子液体)的0.5～100mL磷酸缓冲液(1～500mM、pH 5～13)中进行反应，反应之前通入N

本发明所涉及的设备、试剂、工艺、参数等，除有特别说明外，均为常规设备、试剂、工艺、参数等，不再作实施例。

本发明所列举的所有范围包括该范围内的所有点值。

本发明所述“大约”、“约”或“左右”等指的是所述范围或数值的±20％范围内。

本发明中，除有特别说明或在领域内有通用含义外，％均为质量百分比，比例均为质量比。

本发明中，所述“室温”即常规环境温度，可以为10～30℃。

本发明的有益效果如下：

1.本发明选用碳纸、氧化石墨烯(GO)、还原氧化石墨烯(rGO)、碳纳米管(CNT)等碳纳米材料及导电高分子、离子液体等作为电子传递材料进行酶电极制备，以优越的电子性能、可化学修饰性能和良好的生物相容性等实现酶的稳定固定化以及高效电子传递。利用生物相容性良好的功能性电极材料定向固定化酶，实现辅酶原位再生、增加酶电极的负载量，提高酶的稳定性，具有制作方法简单、成本低廉，稳定性和重复性好的优点。

2.氨基酸脱氢酶(AaDH)、醇脱氢酶和胺脱氢酶等是生物代谢途径中的重要酶类。AaDH利用NH

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1为本发明实施例1中的反应器结构示意图(左)与实际反应器照片(右)。

图2为本发明实施例1中碳纸固定酶的图片。

图3为本发明实施例1中得到的固定化酶CP/Cu

图4为本发明实施例1中的辅酶再生曲线。

图5为本发明实施例3中的酶电催化反应器的照片。

图6为本发明实施例3中的MWNTs-PDA的SEM表征。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做详细说明。

实施例1

(1)氨基酸脱氢酶粗酶制备：根据如SEQ ID No.1所示的氨基酸脱氢酶(AaDH)原始序列，由商业化公司(上海生物工程有限公司)采用PCR法合成氨基酸脱氢酶的基因序列，用于与载体pET28a连接，构建质粒。

PCR产物(氨基酸脱氢酶的基因序列)与载体pET28a的连接：使用NdeI与XhoI将PCR产物及载体pET28a双酶切，经纯化后在T4 DNA Ligase作用下4℃过夜反应，得到转化用质粒。采用Competent Cel Preparation Kit试剂盒完成制备感受态细胞。向感受态细胞中加入10ng的转化用质粒，轻轻混匀后冰上放置30分钟，42℃水浴放置45秒，立即于冰上放置1～2分钟。加入37℃预温的LB培养基，37℃震荡培养1小时，取适量菌液涂带有卡那霉素抗性的LB固体平板，37℃过夜培养后挑去单菌落，即为重组大肠杆菌(E.coli BL21(DE3)/pET28a)。

重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a的培养：以1％的接种量，将菌种接入200mL LB培养基中。LB培养基的组成为10.0g/L胰蛋白胨，5.0g/L酵母粉，10g/L NaCl。培养条件为：起始pH 7.0，装液量体积分数为10％，培养温度37℃，摇床转速200rpm，培养时间6小时。加入诱导剂IPTG，使其终浓度为10mg/mL，继续在30℃、200rpm条件下培养12h。

粗酶液的制备：培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4℃，8000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次获得细胞。利用超声破碎仪对细胞液进行处理，细胞破碎仪探头置于液面下1cm，破碎条件为超声2秒，间隔4秒，超声40次，功率200W。然后4℃、12,000rpm离心15min去除不溶性细胞碎片，上清即为氨基酸脱氢酶粗酶液。

(2)氨基酸脱氢酶纯酶制备：采用GE公司的His Trap镍柱对氨基酸脱氢酶粗酶液进行分离纯化，并用PALL公司的10K的超滤离心管进行超滤除盐。所述的纯化过程采用的纯化柱为能够特异性纯化带有His-tagged标签的蛋白质的HisTrap HP柱，其步骤包括平衡、上样、平衡、洗脱、柱子再生；收集洗脱的部分并利用超滤离心管进行除盐；除盐后获得的液体即为氨基酸脱氢酶纯酶(带有His-tag的AaDH)液。并向其中加入以Tris-HCl(0.05M，pH7.0)缓冲液，制备成含有氨基酸脱氢酶的水溶液，并根据需要调节其中的氨基酸脱氢酶浓度为0.05～50mg/mL备用。

(3)离子型辅酶NADH-IL的合成：设计合成了以烟酰胺辅酶NADH为阴离子、不同咪唑为阳离子的离子液体形式的离子型辅酶。加入N-甲基咪唑(33mL，0.31M)和氯代正丁烷(20mL，0.25M)，其摩尔比大约为1.2：1，氮气保护、磁力搅拌条件下于90℃，回流24h制备氯化1-丁基-3-甲基咪唑，提纯。氯化1-丁基-3-甲基咪唑离子液体溶于水中，缓慢通过装有717型阴离子交换树脂的柱子(717型阴离子交换树脂使用前阴离子为Cl

(4)碳布固定化酶：采用日本东丽公司燃料电池专用碳纸TGP-H-060作为载体。Hummer法制备氧化石墨烯，超声分散3h后得到分散均匀的GO溶液。分别配制50mM,15mM的Cu(NO

(5)生物电催化反应器设计与性能表征：基于一次性塑料试管设计50mL设计生物电催化微反应器。设计反应器三电极体系，步骤(4)制得的固定有酶和凝胶的碳纸(5×5cm)作为工作电极(WE)，对电极(CE)为铂丝电极，Ag/AgCl为参比电极(RE)，如图1。在加入NADH-IL的10mL磷酸缓冲液(0.02mM、pH 7.4)中进行反应，反应之前通入N

实施例2

(1)～(2)如实施例1。

(3)高分子共价连接的辅酶(PEI-Fc-NADH)的制备：分别配制0.7mmol/mL和0.2mmol/mL的聚乙烯亚胺(PEI)和二茂铁甲醛(Fc)的乙醇溶液，将Fc的乙醇溶液在3h内逐滴加到PEI的乙醇溶液中，继续搅拌反应3h。加入终浓度为1.0mmol/mL硼氢化钠，继续反应4h。固液分离，向残留物中加入10mL蒸馏水，用蒸馏水透析12h，得到PEI-Fc。将100mmol丁二酸酐溶于30mL二甲亚砜，将0.5g NAD

(4)碳布固定化酶：采用日本东丽公司燃料电池专用碳纸TGP-H-060作为载体。Hummer法制备氧化石墨烯，超声分散3h后得到分散均匀的GO溶液。分别配制50mM,15mM的Cu(NO

(5)生物电催化反应器设计与性能表征：基于一次性塑料试管设计50mL设计生物电催化微反应器。设计反应器三电极体系，步骤(4)制得的固定有酶和PEI-Fc-NADH的碳纸(5×5cm)作为工作电极，对电极为铂丝电极，Ag/AgCl为参比电极。在加入NADH-IL的10mL磷酸缓冲液(0.02mM、pH 7.4)中进行反应，反应之前通入N

实施例3

(1)胺脱氢酶粗酶制备：根据胺脱氢酶原始序列，由商业化公司(上海生物工程有限公司)采用PCR法合成如SEQ ID NO.2所示的胺脱氢酶的基因序列，用于与载体pET28a连接，构建质粒。

PCR产物(胺脱氢酶的基因序列)与载体pET28a的连接：使用NdeI与XhoI将PCR产物及载体pET28a双酶切，经纯化后在T4 DNA ligase作用下4℃过夜反应，得到转化用质粒。采用Competent Cell Preparation Kit试剂盒完成制备感受态细胞。向感受态细胞中加入10ng的转化用质粒，轻轻混匀后冰上放置30分钟，42℃水浴放置45秒，立即于冰上放置1～2分钟。加入37℃预温的LB培养基，37℃震荡培养1小时，取适量菌液涂带有卡那霉素抗性的LB固体平板，37℃过夜培养后挑去单菌落，即为重组大肠杆菌(E.coli BL21(DE3)/pET28a)。

重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a的培养：以1％的接种量，将菌种接入200mL LB培养基中。LB培养基的组成为10.0g/L胰蛋白胨，5.0g/L酵母粉，10g/L NaCl。培养条件为：起始pH 7.0，装液量体积分数为10％，培养温度37℃，摇床转速200rpm，培养时间6小时。加入诱导剂IPTG，使其终浓度为10mg/mL，继续在30℃、200rpm条件下培养2小时。

粗酶液的制备：培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4℃，8000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次获得细胞。利用超声破碎仪对细胞液进行处理，细胞破碎仪探头置于液面下1cm，破碎条件为超声2秒，间隔4秒，超声40次，功率200W。然后4℃、12,000rpm离心15min去除不溶性细胞碎片，上清即为胺脱氢酶粗酶液。

(2)胺脱氢酶纯酶制备：采用GE公司的His Trap镍柱对胺脱氢酶粗酶液进行分离纯化，并用PALL公司的10K的超滤离心管进行超滤除盐。所述的纯化过程采用的纯化柱为能够特异性纯化带有His-tagged标签的蛋白质的HisTrap HP柱，其步骤包括平衡、上样、平衡、洗脱、柱子再生；收集洗脱的部分并利用超滤离心管进行除盐；除盐后获得的液体即为胺脱氢酶纯酶液体。并向其中加入以Tris-HCl(0.05M，pH 7.0)缓冲液，制备成含有胺脱氢酶的胺脱氢酶溶液，并根据需要调节其中的胺脱氢酶浓度为0.05～50mg/mL备用。

(3)固定化酶材料的制备：将20mg多壁碳纳米管(MWNTs)(南京吉仓纳米科技有限公司，多壁碳纳米管JCMT-95-11-10)加入20mL水超声分散3h后得到分散均匀的1mg/mLMWNTs溶液，在搅拌下，加入40mg PDA，室温下搅拌12h经过离心、重悬，制备成1mg/mL的MWNTs-PDA溶液，MWNTs-PDA的SEM图如图6。MWNTs-PDA溶液与NaAuCl

(4)MWNTs-PDA-AuNPs-AmDH制备：将步骤(2)中得到的酶浓度为5mg/mL的胺脱氢酶溶液在4℃下以2:1:1的比例与含有AuNPs的MWNTs-PDA溶液混合，8000rpm离心弃上清液，沉淀为胺脱氢酶固定化混合物MWNTs-PDA-AuNPs-AmDH；然后将混合物以8000rpm下离心15分钟，冲洗，重悬于0.05M的pH 9.0的氯化铵-氨水缓冲液中，制备含1mg/mL氨基酸脱氢酶的MWNTs-PDA-AuNPs-AmDH分散液。

(5)取步骤(4)中获得的10μL MWNTs-PDA-AuNPs-AmDH分散液和包含亚甲基绿、NADH-IL和[BMIM]Cl的凝胶滴在碳纸表面，4℃下晾干，得到工作电极，记作MWNTs-PDA-AuNPs-AmDH-CP。酶的负载量为每1g复合材料负载10mg酶。

(6)生物电催化反应器设计与性能表征：步骤(5)得到的胺脱氢酶电极MWNTs-PDA-AuNPs-AmDH-CP为工作电极，铂电极为对电极，甘汞电极为参比电极，室温下进行电化学实验。修饰电极MWNTs-PDA-AuNPs-AmDH-CP的测试均在加入电子中介体甲苯胺蓝、20mg辅酶NADH的10mL磷酸缓冲液(0.02M、pH 7.0)中进行，测试之前通入N

实施例4

(1)芳香醇脱氢酶制备：根据如SEQ ID NO.3所示的芳香醇脱氢酶原始序列，由商业化公司(上海生物工程有限公司)采用PCR法合成芳香醇脱氢酶的基因序列，用于与载体pET28a连接，构建质粒。PCR产物与载体pET28a的连接：使用NdeI与XhoI将PCR产物及载体pET28a双酶切，经纯化后在T4 DNA Ligase作用下4℃过夜反应，得到转化用质粒。采用Competent Cel Preparation Kit试剂盒完成制备感受态细胞。向感受态细胞中加入10ng的转化用质粒，轻轻混匀后冰上放置30分钟，42℃水浴放置45秒，立即于冰上放置1～2分钟。加入37℃预温的LB培养基，37℃震荡培养1小时，取适量菌液涂带有卡那霉素抗性的LB固体平板，37℃过夜培养后挑去单菌落，即为重组大肠杆菌(E.coli BL21(DE3)/pET28a)。

重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a的培养：以1％的接种量，将菌种接入200mL LB培养基中。LB培养基的组成为10.0g/L胰蛋白胨，5.0g/L酵母粉，10g/L NaCl。培养条件为：起始pH 7.0，装液量体积分数为10％，培养温度37℃，摇床转速200rpm，培养时间6小时。加入诱导剂IPTG，使其终浓度为10mg/mL，继续在30℃、200rpm条件下培养12h。

粗酶液的制备：培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4℃，8000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次获得细胞。利用超声破碎仪对细胞液进行处理，细胞破碎仪探头置于液面下1cm，破碎条件为超声2秒，间隔4秒，超声40次，功率200W。然后4℃、12,000rpm离心15min去除不溶性细胞碎片，上清即为芳香醇脱氢酶粗酶液。

(2)芳香醇脱氢酶纯酶制备：采用GE公司的His Trap镍柱对芳香醇脱氢酶进行分离纯化，并用PALL公司的10K的超滤离心管进行超滤除盐。所述的纯化过程采用的纯化柱为能够特异性纯化带有His-tagged标签的蛋白质的HisTrap HP柱，其步骤包括平衡、上样、平衡、洗脱、柱子再生；收集洗脱的部分并利用超滤离心管进行除盐；除盐后获得的液体即为芳香醇脱氢酶纯(带有His-tag的ArylDH)酶液。并向其中加入以Tris-HCl(0.05M，pH 7.0)缓冲液，制备成含有芳香醇脱氢酶的水溶液，并根据需要调节其中的芳香醇脱氢酶浓度为0.05～50mg/mL备用。

(3)离子型辅酶NADH-IL的合成：如实施例1的步骤(3)。

(4)碳布固定化酶：采用日本东丽公司燃料电池专用碳纸碳布TGP-H-060作为载体。Hummer法制备氧化石墨烯，超声分散3h后得到分散均匀的GO溶液。分别配制50mM,15mM的Zn(NO

(5)生物电催化反应：基于一次性塑料试管设计容量为100mL的生物电催化微反应器。设计反应器三电极体系，步骤(4)制得的固定有酶和凝胶的碳纸(3×3cm)做为工作电极，对电极为石墨电极，Ag/AgCl为参比电极。在加入NADH-IL的10mL磷酸缓冲液(0.02mM、pH7.4)中进行反应，反应之前通入N

实施例5

(1)苹果酸脱氢酶粗酶制备：根据如SEQ ID NO.4的苹果酸脱氢酶原始序列，由商业化公司(上海生物工程有限公司)采用PCR法合成苹果酸脱氢酶的基因序列，用于与载体pET28a连接，构建质粒。

PCR产物(苹果酸脱氢酶的基因序列)与载体pET28a的连接：使用NdeI与XhoI将PCR产物及载体pET28a双酶切，经纯化后在T4 DNA ligase作用下4℃过夜反应，得到转化用质粒。采用Competent Cell Preparation Kit试剂盒完成制备感受态细胞。向感受态细胞中加入10ng的转化用质粒，轻轻混匀后冰上放置30分钟，42℃水浴放置45秒，立即于冰上放置1～2分钟。加入37℃预温的LB培养基，37℃震荡培养1小时，取适量菌液涂带有卡那霉素抗性的LB固体平板，37℃过夜培养后挑去单菌落，即为重组大肠杆菌(E.coli BL21(DE3)/pET28a)。

重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a的培养：以1％的接种量，将菌种接入200mL LB培养基中。LB培养基的组成为10.0g/L胰蛋白胨，5.0g/L酵母粉，10g/L NaCl。培养条件为：起始pH 7.0，装液量体积分数为10％，培养温度37℃，摇床转速200rpm，培养时间6小时。加入诱导剂IPTG，使其终浓度为10mg/mL，继续在30℃、200rpm条件下培养2小时。

粗酶液的制备：培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4℃，8000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次获得细胞。利用超声破碎仪对细胞液进行处理，细胞破碎仪探头置于液面下1cm，破碎条件为超声2秒，间隔4秒，超声40次，功率200W。然后4℃、12,000rpm离心15min去除不溶性细胞碎片，上清即为苹果酸脱氢酶粗酶液。

(2)苹果酸脱氢酶纯酶制备：采用GE公司的His Trap镍柱对苹果酸脱氢酶粗酶液进行分离纯化，并用PALL公司的10K的超滤离心管进行超滤除盐。所述的纯化过程采用的纯化柱为能够特异性纯化带有His-tagged标签的蛋白质的HisTrap HP柱，其步骤包括平衡、上样、平衡、洗脱、柱子再生；收集洗脱的部分并利用超滤离心管进行除盐；除盐后获得的液体即为苹果酸脱氢酶纯酶液体。并向其中加入以Tris-HCl(0.05M，pH 7.0)缓冲液，制备成含有苹果酸脱氢酶的苹果酸脱氢酶溶液，并根据需要调节其中的苹果酸脱氢酶浓度为0.05～50mg/mL备用。

(3)酶电极修饰材料碳纳米管MWNTs-PDA的制备：30mg多壁碳纳米管(MWNTs)(南京吉仓纳米科技有限公司，多壁碳纳米管JCMT-95-11-10)加入30mL水超声分散3h后得到分散均匀的1mg/mL MWNTs溶液，在搅拌下，加入40mg PDA，室温下搅拌12h经过离心、重悬，制备成1mg/mL的MWNTs-PDA溶液，MWNTs-PDA的SEM图参照图6。MWNTs-PDA溶液与NaAuCl

(4)MWNTs-PDA-AuNPs-MDH制备：将步骤(2)中得到的酶浓度为5mg/mL的苹果酸脱氢酶溶液在4℃下以2:1:1的比例与含有AuNPs的MWNTs-PDA溶液混合，8000rpm离心弃上清液，沉淀为苹果酸脱氢酶固定化混合物MWNTs-PDA-AuNPs-MDH；然后将混合物以8000rpm下离心15分钟，冲洗，重悬于0.08M的pH 9.0的氨水-氯化铵缓冲液中，制备含1mg/mL苹果酸脱氢酶的MWNTs-PDA-AuNPs-MDH分散液。

(5)取步骤(4)中获得的10μL MWNTs-PDA-AuNPs-MDH分散液和包含亚甲基绿、NADH-IL和[BMIM]Cl的凝胶滴在玻碳电极(GCE)表面，4℃下晾干，得到修饰电极，记作MWNTs-PDA-AuNPs-MDH-GCE。作为对照，用滴涂法制备MWNTs修饰电极，记作MWNTs-GCE。

(6)生物电催化反应：基于玻璃生物电催化微反应器，设计反应器三电极体系，步骤(5)得到的固定有酶的GCE作为工作电极，对电极为石墨电极，Ag/AgCl为参比电极。在加入NADH-IL的10mL磷酸缓冲液(0.02mM、pH 7.4)中进行反应，反应之前通入N

实施例6

(1)～(2)如实施例5。

(3)固定化酶CP-rGO-PDA-AuNPs-MDH的制备：Hummer法制备氧化石墨烯，超声分散3h后得到分散均匀的GO溶液。在1mg/mL GO加入抗坏血酸0.5g还原12h，12000rpm离心，除去上清液，加入10mL超纯水洗涤一次，再离心，再加10mL的0.1M柠檬酸缓冲溶液(pH 7.0)制备成1mg/mL的rGO溶液。在含10mL 1mg/mL的rGO溶液中加入20mg多巴胺(DA)和5mL 2mg/mLMDH，室温下缓慢搅拌下加入3.0mM NaAuCl

(4)取步骤(3)中获得的10μL rGO-PDA-AuNPs-MDH分散液和包含亚甲基绿、NADH-IL和[BMIM]Cl的凝胶滴在碳纸表面，4℃下晾干，得到修饰电极，记作CP-rGO-PDA-AuNPs-MDH。

(5)酶电反应器催化反应：基于玻璃生物电催化微反应器，设计反应器三电极体系，步骤(4)得到的固定有酶和多功能凝胶的碳纸CP-rGO-PDA-AuNPs-MDH(2×2cm)作为工作电极，对电极为石墨电极，Ag/AgCl为参比电极。在加入NADH-IL的10mL磷酸缓冲液(0.02mM、pH 7.4)中进行反应，反应之前通入N

实施例7

(1)香叶醇脱氢酶粗酶制备：根据如SEQ ID NO.5所示的香叶醇脱氢酶原始序列，由商业化公司(上海生物工程有限公司)采用PCR法合成香叶醇脱氢酶的基因序列，用于与载体pET28a连接，构建质粒。

PCR产物(香叶醇脱氢酶的基因序列)与载体pET28a的连接：使用NdeI与XhoI将PCR产物及载体pET28a双酶切，经纯化后在T4 DNA ligase作用下4℃过夜反应，得到转化用质粒。采用Competent Cell Preparation Kit试剂盒完成制备感受态细胞。向感受态细胞中加入10ng的转化用质粒，轻轻混匀后冰上放置30分钟，42℃水浴放置45秒，立即于冰上放置1～2分钟。加入37℃预温的LB培养基，37℃震荡培养1小时，取适量菌液涂带有卡那霉素抗性的LB固体平板，37℃过夜培养后挑去单菌落，即为重组大肠杆菌(E.coli BL21(DE3)/pET28a)。

重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a的培养：以1％的接种量，将菌种接入200mL LB培养基中。LB培养基的组成为10.0g/L胰蛋白胨，5.0g/L酵母粉，10g/L NaCl。培养条件为：起始pH 7.0，装液量体积分数为10％，培养温度37℃，摇床转速200rpm，培养时间6小时。加入诱导剂IPTG，使其终浓度为10mg/mL，继续在30℃、200rpm条件下培养2小时。

粗酶液的制备：培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4℃，8000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次获得细胞。利用超声破碎仪对细胞液进行处理，细胞破碎仪探头置于液面下1cm，破碎条件为超声2秒，间隔4秒，超声40次，功率200W。然后4℃、12,000rpm离心15min去除不溶性细胞碎片，上清即为香叶醇脱氢酶粗酶液。

(2)香叶醇脱氢酶纯酶制备：采用GE公司的His Trap镍柱对香叶醇脱氢酶粗酶液进行分离纯化，并用PALL公司的10K的超滤离心管进行超滤除盐。所述的纯化过程采用的纯化柱为能够特异性纯化带有His-tagged标签的蛋白质的HisTrap HP柱，其步骤包括平衡、上样、平衡、洗脱、柱子再生；收集洗脱的部分并利用超滤离心管进行除盐；除盐后获得的液体即为香叶醇脱氢酶纯酶液体。并向其中加入以Tris-HCl(0.1M，pH 6.5)缓冲液，制备成含有香叶醇脱氢酶的香叶醇脱氢酶溶液，并根据需要调节其中的香叶醇脱氢酶浓度为0.05～50mg/mL备用。

(3)碳布固定化酶：采用日本东丽公司燃料电池专用碳纸TGP-H-060作为载体。Hummer法制备氧化石墨烯，超声分散3h后得到分散均匀的GO溶液。分别配制50mM,15mM的NiCl

(4)电生物催化反应：

基于一次性塑料试管设计容量为100mL的生物电催化微反应器。设计反应器三电极体系，步骤(3)得到的固定有酶和凝胶的碳纸(3×3cm)作为工作电极，对电极为石墨电极，Ag/AgCl为参比电极。在加入NADH-IL的10mL磷酸缓冲液(0.02mM、pH 7.4)中进行反应，反应之前通入N

实施例8

(1)高苯丙氨酸脱氢酶粗酶液制备：根据如SEQ ID No.6所示的高苯丙氨酸脱氢酶序列，由商业化公司(上海生物工程有限公司)采用PCR法全基因合成基因序列；扩增基因序列，并将其连接至pET28a载体，之后将该质粒导入至大肠杆菌E.coliBL21 DE3；重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a的培养：以1％的接种量，将菌种接入200mL LB培养基中。LB培养基的组成为10.0g/L胰蛋白胨，5.0g/L酵母浸膏，10g/L NaCl。培养条件为：起始pH 7.0，装液量体积分数为10％，培养温度37℃，摇床转速200rpm，培养时间6小时。加入诱导剂IPTG，使其终浓度为10mg/mL，继续在25℃、200rpm条件下培养12小时。培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4℃，8000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用磷酸缓冲液(pH＝7～7.4)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次，用磷酸缓冲液(pH 7～7.4)配制成浓度为50～150g/L的细胞悬液。将制备的细胞悬液置于冰浴中，利用超声破碎仪对细胞液进行处理，细胞破碎仪探头置于液面下1cm，破碎条件为超声3秒，间隔6秒，超声60次，功率200W。然后4℃、12,000rpm离心15min去除不溶性细胞碎片，上清即为含有带His-tag标签的高苯丙氨酸脱氢酶的粗酶液。

(2)高苯丙氨酸脱氢酶纯酶制备：采用GE公司的His Trap镍柱(Histrap

(3)酶活力检测：催化反应体系包含40mM NADH、0.2mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液(pH 9.5)，助溶剂为20％的异丙醇，40mM的2-氧代-4-苯基丁酸乙酯和20mg/mL酶，37℃下反应，340nm波长下测定酶活。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μmolNAD

(4)酶活力检测：催化反应体系包含200mM NADH、0.5mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液(pH 11)，助溶剂为10％的乙腈，80mM的L-2-羰基-5-苯基戊酮酸和60mg/mL酶，40℃下反应，340nm波长下测定酶活。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μmolNAD

(5)多孔复合碳材料原位矿化固定化酶

在多孔碳纸上固定化酶和凝胶，仿生矿化构建电极/电子中介体/辅酶/酶一体复合体系。首先配制100mg/mL 500kDa支链聚乙烯亚胺溶液，制备氧化石墨烯-聚乙烯亚胺(GO-PEI)复合材料，水热法还原获得rGO-PEI。其次，高苯丙氨酸脱氢酶加入Mn

(6)电催化反应：酶活力检测：催化反应体系包含100mM NADH、0.6mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液(pH 11)，助溶剂为30％的丙醇，40mM的L-2-羰基-3-苯基丁酮酸和80mg/ml酶，35℃下反应，340nm波长下测定酶活。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μmol NAD

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

序列表

<110> 厦门大学

<120> 用于酶电催化还原的氧化还原酶电极及其制备方法和其酶电反应器

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 354

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Ile Leu Glu Thr Met Lys Ala Ser Asp Tyr Glu Gln Leu Val

1 5 10 15

Phe Cys Gln Asp Glu Lys Thr Gly Leu Lys Gly Ile Ile Ala Ile His

20 25 30

Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Thr Arg Met Trp Thr Tyr

35 40 45

Asp Asn Glu Glu Glu Ala Ile Glu Asp Val Leu Arg Leu Ala Arg Gly

50 55 60

Met Thr Tyr Lys Ser Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys

65 70 75 80

Gly Val Ile Ile Gly Asp Pro Lys Lys Asp Lys Ser Glu Glu Met Trp

85 90 95

Arg Ala Phe Gly Arg Phe Val Gln Ser Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr

100 105 110

Ala Glu Asp Val Gly Val Arg Glu Thr Asp Leu Glu Ile Val Asn Thr

115 120 125

Glu Thr Asp Phe Ala Val Gly Leu Pro Gly Lys Ser Gly Asn Pro Ser

130 135 140

Pro Ala Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Ser Gly Ile Lys Ala Val Ala Asp

145 150 155 160

Glu Ile Trp Gly Ser Ala Asp Leu Asn Gly Lys Thr Ile Ala Ile Gln

165 170 175

Gly Ala Gly Ser Val Gly Tyr Tyr Leu Ser Glu Leu Leu His Lys Asp

180 185 190

Gly Ala Lys Leu Ile Val Thr Asp Ile Asp Lys Glu Ala Val Asp Lys

195 200 205

Leu Val Ser Asp Phe Gly Ala Thr Ala Val Glu Thr Asp Glu Ile Tyr

210 215 220

Glu Gln Glu Ala Asp Ile Phe Ala Pro Cys Ala Leu Gly Ala Ile Leu

225 230 235 240

Asn Asp Glu Thr Ile Pro Lys Leu Lys Val Lys Ala Val Ala Gly Ala

245 250 255

Ala Asn Asn Gln Leu Glu Asp Glu Lys Arg His Ala Glu Glu Leu Lys

260 265 270

Lys Arg Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile Asn Ala Gly Gly

275 280 285

Val Ile Asn Val Ser Phe Glu Leu Thr Gly Tyr Asp Glu Glu Arg Ala

290 295 300

Tyr Arg Lys Ile Ser Thr Ile Tyr Asp Asn Ile Lys Lys Ile Phe Asn

305 310 315 320

Ile Ala Asn Arg Asp Asp Ile Thr Ser His Glu Ala Ala Asn Arg Met

325 330 335

Ala Glu Glu Arg Ile Glu Ala Ile Lys His Val Lys Thr Ser Tyr Ile

340 345 350

Asn Lys

<210> 2

<211> 1152

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catatgagct tagtagaaaa aacatccatc ataaaagatt tcactctttt tgaaaaaatg 60

tctgaacatg aacaagttgt tttttgcaac gatccggcga caggactaag ggccattatc 120

gctattcatg acaccacact cggacctgcg ctcggcggct gccgcatgca gccttataac 180

agtgtggaag aagcattgga agatgctctt cgcctttcca aaggaatgac ttactcttgc 240

gcggcgtccg atgtcgactt tggcggcgga aaagcagtca ttatcggtga tccgcagaaa 300

gataaatctc cagaactgtt ccgcgcgttt ggccaatttg ttgattcgct tggcggccgt 360

ttctatacag gtactgatat gggaacgaat atggaagatt tcattcacgc catgaaagaa 420

acaaactgca ttgttggggt gccggaagct tacggcggcg gcggagattc ctctattcca 480

actgccatgg gtgtcctgta cggcattaaa gcaaccaaca aaatgttgtt tggcaaggac 540

gatcttggcg gcgtcactta tgccattcaa ggacttggca aagtaggcta caaagtagcg 600

gaagggctgc tcgaagaagg tgctcattta tttgtaacgg atattaacga gcaaacgttg 660

gaggctatcc aggaaaaagc aaaaacaaca tccggttctg tcacggtagt agcgagcgat 720

gaaatttatt cccaggaagc cgatgtgttc gttccgtgtg catttggcgg cgttgttaat 780

gatgaaacga tgaagcagtt caaggtgaaa gcaatcgccg gttcagccct gaatcagctg 840

cttacggagg atcacggcag acaccttgca gacaaaggca ttctgtatgc tccggattat 900

attgttaact ctggcggtct gatccaagta gccgacgaat tgtatgaggt gaacaaagaa 960

cgcgtgcttg cgaagacgaa gcatatttac gacgcaattc ttgaagtgta ccagcaagcg 1020

gaattagatc aaatcaccac aatggaagca gccaacagaa tgtgtgagca aagaatggcg 1080

gcaagaggcc gacgcaacag cttctttact tcttctgtta agccaaaatg ggatattcgc 1140

aactaactcg ag 1152

<210> 3

<211> 366

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Glu Ile Lys Ala Ala Ile Val Arg Gln Lys Asn Gly Pro Phe Leu

1 5 10 15

Leu Glu His Val Ala Leu Asn Glu Pro Ala Glu Asp Gln Val Leu Val

20 25 30

Arg Leu Val Ala Thr Gly Leu Cys His Thr Asp Leu Val Cys Arg Asp

35 40 45

Gln His Tyr Pro Val Pro Leu Pro Met Val Phe Gly His Glu Gly Ala

50 55 60

Gly Val Val Glu Arg Val Gly Ser Ala Val Lys Lys Val Gln Pro Gly

65 70 75 80

Asp His Val Val Leu Thr Phe Tyr Thr Cys Gly Ser Cys Asp Ala Cys

85 90 95

Leu Ser Gly Asp Pro Thr Ser Cys Ala Asn Ser Phe Gly Pro Asn Phe

100 105 110

Met Gly Arg Ser Val Thr Gly Glu Cys Thr Ile His Asp His Gln Gly

115 120 125

Ala Glu Val Gly Ala Ser Phe Phe Gly Gln Ser Ser Phe Ala Thr Tyr

130 135 140

Ala Leu Ser Tyr Glu Arg Asn Thr Val Lys Val Thr Lys Asp Val Pro

145 150 155 160

Leu Glu Leu Leu Gly Pro Leu Gly Cys Gly Ile Gln Thr Gly Ala Gly

165 170 175

Ser Val Leu Asn Ala Leu Asn Pro Pro Ala Gly Ser Ala Ile Ala Ile

180 185 190

Phe Gly Ala Gly Ala Val Gly Leu Ser Ala Val Met Ala Ala Val Val

195 200 205

Ala Gly Cys Thr Thr Ile Ile Ala Val Asp Val Lys Glu Asn Arg Leu

210 215 220

Glu Leu Ala Ser Glu Leu Gly Ala Thr His Ile Ile Asn Pro Ala Ala

225 230 235 240

Asn Asp Pro Ile Glu Ala Ile Lys Glu Ile Phe Ala Asp Gly Val Pro

245 250 255

Tyr Val Leu Glu Thr Ser Gly Leu Pro Ala Val Leu Thr Gln Ala Ile

260 265 270

Leu Ser Ser Ala Ile Gly Gly Glu Ile Gly Ile Val Gly Ala Pro Pro

275 280 285

Met Gly Ala Thr Val Pro Val Asp Ile Asn Phe Leu Leu Phe Asn Arg

290 295 300

Lys Leu Arg Gly Ile Val Glu Gly Gln Ser Ile Ser Asp Ile Phe Ile

305 310 315 320

Pro Arg Leu Val Glu Leu Tyr Arg Gln Gly Lys Phe Pro Phe Asp Lys

325 330 335

Leu Ile Lys Phe Tyr Pro Phe Asp Glu Ile Asn Arg Ala Ala Glu Asp

340 345 350

Ser Glu Lys Gly Val Thr Leu Lys Pro Val Leu Arg Ile Gly

355 360 365

<210> 4

<211> 305

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Thr Lys Val Ser Val Val Gly Ala Ala Gly Thr Val Gly Ala Ala Ala

1 5 10 15

Gly Tyr Asn Ile Ala Leu Arg Asp Ile Ala Asp Glu Val Val Phe Val

20 25 30

Asp Ile Pro Asp Lys Glu Asp Asp Thr Val Gly Gln Ala Ala Asp Thr

35 40 45

Asn His Gly Ile Ala Tyr Asp Ser Asn Thr Arg Val Arg Gln Gly Gly

50 55 60

Tyr Glu Asp Thr Ala Gly Ser Asp Val Val Val Ile Thr Ala Gly Ile

65 70 75 80

Pro Arg Gln Pro Gly Gln Thr Arg Ile Asp Leu Ala Gly Asp Asn Ala

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Pro Ile Met Glu Asp Ile Gln Ser Ser Leu Asp Glu His Asn Asp Asp

100 105 110

Tyr Ile Ser Leu Thr Thr Ser Asn Pro Val Asp Leu Leu Asn Arg His

115 120 125

Leu Tyr Glu Ala Gly Asp Arg Ser Arg Glu Gln Val Ile Gly Phe Gly

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Gly Arg Leu Asp His Asn Arg Ala Lys Ala Gln Leu Ala Lys Lys Thr

145 150 155 160

Gly Thr Gly Val Asp Arg Ile Arg Arg Met Thr Val Ile Leu Gly Glu

165 170 175

His Gly Asp Ala Gln Val Pro Val Phe Ser Lys Val Ser Val Asp Gly

180 185 190

Thr Asp Pro Glu Phe Ser Gly Asp Glu Lys Glu Gln Leu Leu Gly Asp

195 200 205

Leu Gln Glu Ser Ala Met Asp Val Ile Glu Arg Lys Gly Ala Thr Glu

210 215 220

Trp Gly Pro Ala Arg Gly Val Ala His Met Val Glu Ala Ile Leu His

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Asp Thr Gly Glu Val Leu Pro Ala Ser Val Lys Leu Glu Gly Glu Phe

245 250 255

Gly His Glu Asp Thr Ala Phe Gly Val Pro Val Ser Leu Gly Ser Asn

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Gly Val Glu Glu Ile Val Glu Trp Asp Leu Asp Asp Tyr Glu Gln Asp

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Leu Met Ala Asp Ala Ala Glu Lys Leu Ser Asp Gln Tyr Asp Lys Ile

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Ser

305

<210> 5

<211> 373

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Asn Asp Thr Gln Asp Phe Ile Ser Ala Gln Ala Ala Val Leu Arg

1 5 10 15

Gln Val Gly Gly Pro Leu Ala Val Glu Pro Val Arg Ile Ser Met Pro

20 25 30

Lys Gly Asp Glu Val Leu Ile Arg Ile Ala Gly Val Gly Val Cys His

35 40 45

Thr Asp Leu Val Cys Arg Asp Gly Phe Pro Val Pro Leu Pro Ile Val

50 55 60

Leu Gly His Glu Gly Ser Gly Thr Val Glu Ala Val Gly Glu Gln Val

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Arg Thr Leu Lys Pro Gly Asp Arg Val Val Leu Ser Phe Asn Ser Cys

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Met Leu Pro Leu Asn Phe Gly Gly Ala Gln Arg Val Asp Gly Gly Gln

115 120 125

Val Leu Asp Gly Ala Gly His Pro Val Gln Ser Met Phe Phe Gly Gln

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Ser Ser Phe Gly Thr His Ala Val Ala Arg Glu Ile Asn Ala Val Lys

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Val Gly Asp Asp Leu Pro Leu Glu Leu Leu Gly Pro Leu Gly Cys Gly

165 170 175

Ile Gln Thr Gly Ala Gly Ala Ala Ile Asn Ser Leu Gly Ile Gly Pro

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Gly Gln Ser Leu Ala Ile Phe Gly Gly Gly Gly Val Gly Leu Ser Ala

195 200 205

Leu Leu Gly Ala Arg Ala Val Gly Ala Asp Arg Val Val Val Ile Glu

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Pro Asn Ala Ala Arg Arg Ala Leu Ala Leu Glu Leu Gly Ala Ser His

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Ala Leu Asp Pro His Ala Glu Gly Asp Leu Val Ala Ala Ile Lys Ala

245 250 255

Ala Thr Gly Gly Gly Ala Thr His Ser Leu Asp Thr Thr Gly Leu Pro

260 265 270

Pro Val Ile Gly Ser Ala Ile Ala Cys Thr Leu Pro Gly Gly Thr Val

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Gly Met Val Gly Leu Pro Ala Pro Asp Ala Pro Val Pro Ala Thr Leu

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Asp Ala Asp Pro Gln Arg Phe Ile Pro Arg Met Leu Asp Phe His Arg

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355 360 365

Pro Val Leu Val Phe

370

<210> 6

<211> 354

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Phe Glu Lys Ile Ser Gln His Glu Gln Val Val Phe Cys Asn Asp

1 5 10 15

Pro Ser Thr Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His Asn Thr Thr Leu

20 25 30

Gly Pro Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met Arg Pro Tyr Gly Ser Val Asp

35 40 45

Glu Ala Leu Glu Asp Val Leu Arg Leu Ser Lys Gly Met Thr Tyr Lys

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Gly Asp Pro Met Thr Asp Arg Thr Pro Glu Leu Phe Arg Ala Phe Gly

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Gln Phe Val Asp Ser Leu Asn Gly Arg Phe Tyr Thr Gly Thr Asp Met

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Gly Thr Thr Pro Asp Asp Phe Met His Ala Leu Lys Glu Thr Asn Cys

115 120 125

Ile Val Gly Val Pro Glu Glu Tyr Gly Gly Ser Gly Asp Ser Ser Val

130 135 140

Pro Thr Ala Gln Gly Val Ile Tyr Gly Leu Gln Ala Thr Ile Gln Thr

145 150 155 160

Leu Glu Gly Thr Asp Glu Leu Ser Gly Lys Ser Tyr Ser Ile Gln Gly

165 170 175

Leu Gly Lys Val Gly Phe Lys Val Ala Glu Gln Leu Leu Ala Ala Gly

180 185 190

Ala Gln Ile Tyr Val Thr Asp Ile Asn Glu Lys Ala Leu Lys Met Ile

195 200 205

Gln Glu Arg Ala Glu Leu Leu Pro Gly Asn Val Glu Val Val Glu Gly

210 215 220

Ser Asp Ile Tyr Gly Val Asp Ala Asp Ile Phe Ile Pro Cys Ala Leu

225 230 235 240

Gly Gly Ile Ile His Asp Glu Thr Ile Glu Gln Leu Lys Val Lys Ala

245 250 255

Ile Val Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Leu Glu Asp Lys His Gly Leu

260 265 270

Tyr Leu Gln Gln Lys Gly Ile Leu Tyr Gly Pro Asp Tyr Ile Val Asn

275 280 285

Ala Gly Gly Leu Ile Gln Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Pro Asn Lys

290 295 300

Ala Arg Val Leu Thr Lys Thr Arg Ala Ile Tyr Asp Ser Leu Ile Gln

305 310 315 320

Ile Tyr Ser Glu Ser Thr Lys Asn Gln Ile Ser Thr Met Glu Ala Ala

325 330 335

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340 345 350

Phe Phe