农产品中真菌毒素荧光免疫定量POCT检测方法

摘要

本发明属于农产品检测技术领域，具体涉及一种农产品中真菌毒素荧光免疫定量POCT检测方法。现有检测农产品中真菌毒素的方法要么检测流程复杂，要么检测成本高，不易推广的问题，本发明提供了一种农产品中真菌毒素荧光免疫定量POCT检测方法，包括以下步骤：a、取一定量的样品，加入10倍量的提取液，提取5‑10min，制备成待测溶液；b、采用荧光免疫定量POCT分析仪检测，吸取100μl步骤a得到的待测溶液，加到试纸条的加样孔中，盖上盖子孵育8min；8min后将试纸条插入荧光免疫定量POCT分析仪的试纸条插槽中，进行读数；c、检测结果的判定。本发明的检测方法适用范围广，检测灵敏度高，适宜推广使用。

说明书

技术领域

本发明属于农产品检测技术领域，具体涉及一种农产品中真菌毒素荧光免疫定量POCT检测方法。

背景技术

农产品在储存过程中，容易受到各种霉菌的感染，可能会在农产品中残留一些真菌毒素，这样的农产品上市，会严重危害消费者的健康。

真菌毒素是一类由真菌产生的小分子次级代谢产物，农作物在生长，收获，贮存和运输等环节均易受到真菌毒素污染，现已发现400多种真菌毒素，大部分具有致癌，致畸和致突变作用，且混合污染时毒性会显著增强。真菌毒素可通过污染谷物和饲料或经动物源性食品进入食物链，对人类和动物健康造成严重伤害，近年来已成为食品安全领域的研究重点。一般农产品中主要的真菌毒素有黄曲霉毒素B1(Alfatoxin B1,AFB1)、赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)、伏马毒素B1(Fumonisin B1,FB1)和玉米赤霉烯酮(Zeralenone,ZEN)等。

目前，检测真菌毒素的方法主要包括生物鉴定法，化学分析法，仪器分析法和免疫分析法等。生物鉴定法专一性不强；化学分析法精确度低；免疫分析方法快速，灵敏度高，特异性好，并且成本较低，但其检测灵敏度仍有待增强。仪器分析灵敏度高，可准确定量，但样本前处理复杂并且检测仪器昂贵。这些方法检测农产品中的真菌毒素要么使用的范围局限，无法用在农产品上，要么检测成本高，检测流程复杂。因此，急需开展一些检测流程短、操作简单、检测成本低的农产品中真菌毒素的检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题为：现有检测农产品中真菌毒素的方法要么检测流程复杂，要么检测成本高，不易推广的问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供了一种农产品中真菌毒素荧光免疫定量POCT检测方法。该方法包括以下步骤：

a、样品前处理

取农产品样品，粉碎后过100目筛，取一定量的样品，加入10-20倍量的提取液，漩涡振荡提取或摇床提取10min；提取结束后，在5000rpm离心1min，取100μl上清，加入500μl样品稀释液中，混匀，制备成待测溶液；

b、样品上机检测

取出荧光免疫定量POCT检测试纸条，采用荧光免疫定量POCT分析仪检测，待恒温孵育器温度升至37℃稳定后开始检测，取出荧光免疫定量POCT检测试纸条，水平放置于恒温孵育器加热板上，吸取100μl步骤a得到的待测溶液，加到试纸条的加样孔中，盖上盖子孵育8min；8min后将试纸条插入荧光免疫定量POCT分析仪的试纸条插槽中，进行读数；

c、检测结果的判定

若检测结果＜cutoff值，判断结果为阴性，表明真菌毒素量合格；若检测结果≥cutoff值，判断结果为阳性，表明真菌毒素量不合格。

其中，上述农产品中真菌毒素荧光免疫定量POCT检测方法中，步骤a所述的农产品包括玉米、小麦、大麦、谷物或高粱中的至少一种。

其中，上述农产品中真菌毒素荧光免疫定量POCT检测方法中，步骤a所述的样品为5ml，所述的提取液为70ml。

其中，上述农产品中真菌毒素荧光免疫定量POCT检测方法中，步骤a所述的提取液为甲醇、乙醇、丙二醇或异丁醇中的至少一种。

其中，上述农产品中真菌毒素荧光免疫定量POCT检测方法中，步骤b检测的真菌毒素包括黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、伏马毒素B1或玉米赤霉烯酮中的至少一种。

其中，上述农产品中真菌毒素荧光免疫定量POCT检测方法中，步骤b检测的环境条件为室温25±3℃、湿度40％-60％。

其中，上述农产品中真菌毒素荧光免疫定量POCT检测方法中，步骤c读数需要在2min内进行。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种采用荧光免疫定量POCT仪检测农产品中真菌毒素的方法，拓宽了荧光免疫定量POCT仪的使用范围，能够使其应用于农产品真菌毒素的检测上，同时采用该方法检测真菌毒素，检测结果准确，检测灵敏度提高了2-3个数量级，能够准确定量。并且检测流程很短，仅需前处理10min，检测8min即可完成样品的检测，极大的提高了检测效率。此外，本发明还提高了检测结果的线性范围，降低了黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮的检限，其中，黄曲霉毒素B1的线性范围可达1-300ug/kg，赭曲霉毒素A的线性范围可达10-5000ug/kg，伏马毒素B1的线性范围可达100-65000ug/kg，玉米赤霉烯酮的线性范围可达20-2000ug/kg，具有很好的实用价值。

具体实施方式

本发明提供了一种农产品中真菌毒素荧光免疫定量POCT检测方法，包括以下步骤：

a、样品前处理

取农产品样品，粉碎后过100目筛，取一定量的样品，加入10-20倍量的提取液，漩涡振荡提取或摇床提取10min；提取结束后，在5000rpm离心1min，取100μl上清，加入500μl样品稀释液中，混匀，制备成待测溶液；

b、样品上机检测

取出荧光免疫定量POCT检测试纸条，采用荧光免疫定量POCT分析仪检测，待恒温孵育器温度升至37℃稳定后开始检测，取出荧光免疫定量POCT检测试纸条，水平放置于恒温孵育器加热板上，吸取100μl步骤a得到的待测溶液，加到试纸条的加样孔中，盖上盖子孵育8min；8min后将试纸条插入荧光免疫定量POCT分析仪的试纸条插槽中，进行读数；

c、检测结果的判定

若检测结果＜cutoff值，判断结果为阴性，表明真菌毒素量合格；若检测结果≥cutoff值，判断结果为阳性，表明真菌毒素量不合格。

本发明方法适用于检测的农产品样品主要包括玉米、小麦、大麦、谷物或高粱中的至少一种，但本发明的检测方法的适用范围并不限于此，还可以检测其余农产品，如土豆、番薯等，只是在检测这些水分含量相对较高的样品时，加入的提取液比例需要相应的调整。

优选的，上述农产品中真菌毒素荧光免疫定量POCT检测方法中，步骤a所述的样品为5ml，所述的提取液为70ml。发明人经过大量的试验发现，当取5ml样品，采用70ml提取液进行提取时，效果最好，这可能是由于样品中的真菌毒素需要聚集到一定量才有利于检出。

其中，上述农产品中真菌毒素荧光免疫定量POCT检测方法中，步骤a所述的提取液为甲醇、乙醇、丙二醇或异丁醇中的至少一种。优选采用乙醇或丙二醇。更优选的，提取液采用乙醇与丙二醇按体积比5:8进行混合。当采用乙醇和丙二醇的混合液提取时，能最大限度的将农产品的有效成分和真菌毒素都提取到提取液中，使检测结果更为准确。

其中，上述农产品中真菌毒素荧光免疫定量POCT检测方法中，步骤b检测的真菌毒素包括黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、伏马毒素B1或玉米赤霉烯酮中的至少一种。

其中，上述农产品中真菌毒素荧光免疫定量POCT检测方法中，步骤b检测的环境条件为室温25±3℃、湿度40％-60％。发明人经过大量的试验发现，检测时的环境温度和湿度也对检测结果有一定的影响，在室温25±3℃、湿度40％-60％时，检测结果更灵敏。

其中，上述农产品中真菌毒素荧光免疫定量POCT检测方法中，步骤c读数需要在2min内进行，时间过长将导致结果不准确。

在检测结果的判定时，所述的cutoff值可以根据需要进行设置，一般设置为真菌毒素的标准限定值。当低于该值时，表明样品中真菌毒素合格，高于或等于该值时，真菌毒素超标。本发明能快速的进行结果判定，判定方法简单有效。

本发明采用荧光免疫定量POCT检测方法来测定农产品中的真菌毒素，尚属首例。因农产品中一般都含有较高的淀粉，在检测真菌毒素的时候，会干扰检测结果，使得测定结果不准确。而采用液相色谱检测农产品真菌毒素的时候，样品的前处理过程也极为复杂，否则不仅无法得到准确的结果，还会影响仪器的使用，造成仪器的使用寿命降低。本发明采用荧光免疫定量POCT仪，样品的前处理方式简单，仅需10min左右的提取，即可上机检测，极大的提升了检验效率，并且取得了很好的检测效果，适合快速检测多样品时使用。

下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。

实施例中使用的荧光免疫定量POCT仪和试剂均为普通市售产品。

实施例使用本发明方法检测小麦中的黄曲霉毒素B1

具体的操作步骤为：

a、样品前处理

取小麦样品，粉碎后过100目筛，取一定量的样品，加入10倍量的乙醇，漩涡振荡提取5min，提取结束后，在5000rpm离心1min，取100μl上清，加入500μl样品稀释液中，混匀，制备成待测溶液；

b、样品上机检测

取出荧光免疫定量POCT检测试纸条，采用荧光免疫定量POCT分析仪检测，待恒温孵育器温度升至37℃稳定后开始检测，取出荧光免疫定量POCT检测试纸条，水平放置于恒温孵育器加热板上，吸取100μl步骤a得到的待测溶液，加到试纸条的加样孔中，盖上盖子孵育8min；8min后将试纸条插入荧光免疫定量POCT分析仪的试纸条插槽中，进行读数；

c、检测结果的判定

若检测结果＜cutoff值，判断结果为阴性，表明真菌毒素量合格；若检测结果≥cutoff值，判断结果为阳性，表明真菌毒素量不合格。

实施例共检测5个小麦样品，每个小麦样品重复3次，测定结果如下表1所示。

表1不同玉米样品中的黄曲霉毒素B1结果

由实施例可看出，本发明的检测方法重复性好，检测灵敏度高，适合推广使用。