农产品真菌毒素DNA诱导组装与多色免疫快速检测方法研究

摘要

真菌毒素是一类由真菌产生的有毒次生代谢产物，可致癌、致畸、致突变。真菌毒素可污染“农田到餐桌”的任一环节，防控难度大。由于我国农业环境气候差异大，真菌毒素混合污染的情况频繁发生，且多毒素联合毒性强，严重威胁人民群众生命健康。现场快速检测技术是农产品真菌毒素全程监管的重要技术手段，现有真菌毒素快速检测ELISA法、试纸条法等需要复杂的分离、洗涤等步骤，且多仅能用于单一毒素的检测，难以满足真菌毒素简便前处理以及混合污染现场同步检测的需求。因此，亟需建立真菌毒素快速简便检测技术。 针对以上问题，研究建立了三种快速简便的免疫分析方法。主要研究内容和创新点如下: 1.研究建立了黄曲霉毒素B1荧光共振能量转移免疫分析方法，无需任何分离步骤，简便、易操作，满足黄曲霉毒素B1快速简便的检测需求。 基于荧光共振能量转移、胶体金的荧光猝灭特性以及竞争免疫反应，根据荧光值变化实现黄曲霉毒素B1定量检测。将胶体金作为荧光猝灭基团及抗体标记的支架，根据抗原抗体特异性反应，猝灭抗原上的羧基荧光素。该方法线性范围为10.0-60.0nmol/L，检测限为8.6nmol/L。该方法为均质检测，整个检测过程可以在同一个试管中完成，无需任何洗涤、分离，简化了操作步骤，可以广泛应用于黄曲霉毒素B1的现场检测。 2.研究建立了黄曲霉毒素B1DNA诱导组装荧光检测技术，显著降低了荧光背景值，首次实现真菌毒素等小分子DNA诱导组装荧光检测。 结合DNA诱导组装技术、胶体金荧光猝灭特性和竞争免疫反应，建立DNA诱导组装荧光检测技术。该研究通过设计识别元件和信号元件，实现了DNA诱导组装技术在真菌毒素等小分子检测中的应用。该方法检测限为2.3nmol/L，线性范围为5.0-50.0nmol/L。将该方法应用于大米实际样品中黄曲霉毒素B1的检测，加标回收率为86.2％-101.6％。对荧光基团和猝灭基团之间的距离进行理论估算，结果表明与传统免疫荧光检测相比，该方法大大缩短了两者之间的距离，降低了约38％的荧光背景，提高了灵敏度。 3.研究建立了真菌毒素混合污染多色免疫层析同步检测技术，实现三种真菌毒素混合污染的同步检测。 研制出能够同时检测三种真菌毒素的多色同步免疫层析试纸条。利用不同颜色的微球标记不同的单克隆抗体，在三条检测线上分别固定黄曲霉毒素B1、T-2和玉米赤霉烯酮抗原，利用竞争免疫反应实现三种毒素的同步检测，其可视检测限分别为1.6、64.2、6.3nmol/L。三种毒素之间无交叉反应，试纸条特异性好。该方法在玉米和饲料样品中的检测结果与HPLC-MS/MS分析结果具有良好的一致性。该方法仅通过辨别检测线颜色即可实现三种真菌毒素的半定量检测，操作简便、成本低。