一种人软骨细胞培养基及其应用

摘要

本发明提供了一种人软骨细胞培养基，属于细胞技术领域，本发明对传统培养基进行优化，在基础培养基中添加外泌体、胎牛血清、青霉素‑链霉素，可以有效促进软骨细胞增殖，防止人软骨细胞脱分化，阻止其向纤维细胞样表型的转变，提高单层培养传代次数。本发明还提供了利用上述培养基对人软骨细胞分离培养的方法，可获取培养至第六代的正常软骨细胞。

说明书

技术领域

本发明属于细胞技术领域，尤其涉及一种人软骨细胞培养基及其应用。

背景技术

软骨细胞是一类软骨组成的重要细胞，软骨的各种组成成分基本上都是由软骨细胞分化或者分泌形成的，包括软骨基质以及软骨纤维等等。软骨细胞可以在体外培养、扩增，因此，在临床上有使用软骨细胞治疗软骨缺损的案例。

外泌体是指包含了蛋白质、脂类和核酸的小膜泡，其特指直径在30～200nm的囊泡。外泌体易于保存，生物化学活性稳定、无潜在毒性。人脐带间充质干细胞由于其细胞年轻化、获得量大、无伦理问题、来源充足、高增殖特性、低免疫源性、无致瘤性等优势，临床应用广泛，疾病治疗效果明显，是获取外泌体的理想细胞来源之一。

自体人关节软骨细胞移植是软骨组织工程应用的首选。自体人关节软骨细胞移植已成为一种公认的细胞疗法，被广泛用作治疗骨关节软骨缺损，组织工程化软骨再生及临床开展自体软骨细胞需要大量的、高质量的软骨细胞，但临床上开展自体软骨细胞植入用于治疗膝关节软骨缺损，经常遇到软骨增殖能力差，传代次数少，脱分化严重等问题。上述问题严重影响软骨细胞扩增数量及质量，降低临床治疗效果，阻碍自体软骨细胞的临床应用。软骨细胞属终末分化细胞，应用传统的培养方式基础培养基加血清、生长因子或一些化学物质在体外不易扩增培养，细胞一般传至3代以上就发生脱分化，软骨细胞标志物表达明显下降，基本不增殖。单层体外扩增导致软骨细胞功能丧失，并向成纤维细胞样表型的转变，因此，软骨细胞的特性限制了其相关的科学研究。

因此，如何得到一种人软骨细胞培养基，提高软骨细胞的增殖能力和传代次数，降低脱分化现象，以获得大量的、高质量的软骨细胞成为本领域迫切需要解决的一个技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种人软骨细胞培养基及其应用，有利于提高软骨细胞的增殖能力和传代次数，降低脱分化现象。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种人软骨细胞培养基，所述培养基在基础培养基的基础上添加胎牛血清、外泌体和青霉素-链霉素溶液。

优选的，所述基础培养基在人软骨细胞培养基中的体积分数为85～92％。

优选的，所述基础培养基为DMEM/F12。

优选的，所述胎牛血清在人软骨细胞培养基中的体积分数为7～14％。

优选的，所述外泌体在人软骨细胞培养基中的浓度为15～25μg/mL。

优选的，所述外泌体来源于人脐带间充质干细胞。

优选的，所述青霉素-链霉素溶液在人软骨细胞培养基中的体积分数为0.8～1.5％。

优选的，所述人软骨细胞包括膝关节软骨细胞。

本发明还提供了一种培养人软骨细胞的方法，包括：将人软骨细胞置于上述的人软骨细胞培养基中进行培养。

优选的，所述培养包括原代培养和6代以内的传代培养。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明向基础培养基中添加人脐带间充质干细胞来源的外泌体，在有效促进软骨细胞增殖的同时，防止其脱分化，阻止其向成纤维细胞样表型的转变，提高了单层培养传代次数。

本发明利用其培养基可将人软骨细胞培养至第六代，并且培养得到的第六代软骨细胞形态正常，呈多角形，仍具有较强增殖活力，且仍可以正常表达软骨细胞的标志物Ⅱ型胶原(COL 2A1)和蛋白聚糖(ACAN)。本发明培养得到的人关节软骨细胞可以满足组织工程化软骨再生及临床开展自体软骨细胞治疗的需要。

附图说明

图1为外泌体培养基培养得到的第六代细胞人软骨细胞倒置相差显微镜采集图像；

图2为常规培养基培养得到的第六代细胞人软骨细胞倒置相差显微镜采集图像；

图3为培养得到的人软骨细胞增殖活力；

图4为人软骨细胞标志物Ⅱ型胶原(COL 2A1)mRNA相对表达水平；

图5为人软骨细胞标志物蛋白聚糖(ACAN)mRNA相对表达水平。

具体实施方式

本发明提供了一种人软骨细胞培养基，所述培养基在基础培养基的基础上添加胎牛血清、外泌体和青霉素-链霉素溶液。

本发明中基础培养基可选择哺乳动物体外细胞分离培养常用的培养基，优选为DMEM/F12。DMEM/F12培养基由DMEM和F12培养基按1:1结合得到的，利用F12含有较丰富的微量元素和DMEM含有各种氨基酸、较高浓度的葡萄糖为优点，适用于血清含量较低条件下哺乳动物细胞培养。本发明对DMEM/F12的具体来源和培养基形态不作限定。

本发明中基础培养基的体积分数为85～92％，进一步优选为89％。

本发明在基础培养基中添加体积分数为7～14％的胎牛血清，其体积分数进一步优选为10％。胎牛血清是细胞培养中天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成分；可以提供维持细胞指数生长的激素；提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，结合或调动它们所结合的物质活力；是细胞贴壁、铺展在培养基质上所需因子来源。本发明对胎牛血清的具体来源不作限定。

本发明在基础培养基中添加外泌体，所述外泌体优选为人脐带间充质干细胞外泌体。人脐带间充质干细胞外泌体包含多种因子，如转化生长因子(TGF)-b、血小板衍生生长因子(PDGF)和生长分化因子(GDF)-5，CD73蛋白等。同时，人脐带间充质干细胞外泌体中还包含多种miRNA，其中许多丰度较高miRNA可以促进软骨细胞的增殖，抑制其脱分化，如：miRNA-21-5p、miRNA-100-5p、miRNA-146a-3p等。本发明发现通过在基础培养基中添加外泌体，可有效促进软骨细胞增殖，防止其脱分化，阻止其向成纤维细胞表型的转变，提高单层培养传代次数。

本发明中添加的外泌体浓度为15～25μg/mL，优选为18～22μg/mL，更进一步优选为20μg/mL。

本发明在培养基中添加体积分数为0.8～1.5％的青霉素-链霉素溶液，其体积分数进一步优选为1％。青霉素-链霉素溶液具有广谱抗菌作用，青霉素抗革兰氏阳性菌，链霉素抗革兰氏阴性菌，两者联合使用具有协同增效的作用。本发明通过在培养基中添加青霉素-链霉素溶液，可有效避免人软骨细胞培养过程中染菌现象的发生。本发明对青霉素-链霉素溶液的具体来源不作限定。

本发明对培养基的具体制备方法不作限定。

作为一种可选的实施方式，当基础培养基为干粉形态时，配置本发明所述培养基的方法可以为：先将干粉形态的基础培养基加入无菌超纯水充分溶解，定容；再用0.2～0.22μm滤膜过滤得到无菌的澄清溶液；然后根据上述培养基的配方依次往基础培养基中添加其他组分，最终采用酸碱调节试剂调节pH值至7.0～7.5即可。本发明对所选择的酸碱调节试剂不做限制。

作为另一种可选的实施方式，当基础培养基为液体形态时，配置本发明所述培养基的方法可以为：取适量液体形态的基础培养基；然后根据上述细胞培养基的配方添加其他组分，再采用酸碱调节试剂调节pH值符合配方要求至7.0～7.5即可。本发明对所选择的酸碱调节试剂不做限制。

本发明还提供了利用上述培养基分离培养人软骨细胞的应用，可以用于培养原代人软骨细胞，也可以用于人软骨细胞传代培养。

本发明所述培养基用于原代人软骨细胞培养。作为一种可选的实施方式，在无菌条件下取(因意外伤害导致下肢截肢)人膝关节软骨，体积最小可为3×3×0.5cm，采用PBS溶液漂洗2～3遍，每次漂洗5～10min；在无菌条件下用手术刀将其剁碎为1～1.5mm

本发明所述培养基可用于细胞传代培养。作为一种可选的实施方式，在人软骨细胞生长融合度达到80～90％时，采用PBS溶液漂洗1～2次，每次漂洗4～5min，加入胰蛋白酶-EDTA(0.25％)盖过细胞，于细胞培养箱内消化2～3min，加入终止培养基。终止培养基优选为：由体积分数90％的DMEM/F12和体积分数10％的胎牛血清组成。将终止培养基及细胞混合液于300～400g离心4～5min，弃掉上清，应用本发明中的人软骨细胞培养基重悬细胞，细胞计数，按照(1～1.2)×10

在本发明具体实施过程中，DMEM/F12购买于Thermo Fisher scientifc(货号：11330032)；胎牛血清购买于Thermo Fisher scientifc(货号：10091148)；青霉素-链霉素溶液购买于Thermo Fisher scientifc(货号：10378016)；PBS溶液购买于Thermo Fisherscientifc(货号：20012027)；Ⅱ型胶原酶购买于Thermo Fisher scientifc(货号：17101015)；DMEM培养基购买于Thermo Fisher scientifc(货号：12430104)；0.25％胰蛋白酶-EDTA购买于Thermo Fisher scientifc(货号：25200056)；Trizol购买于Thermo Fisherscientifc(货号：15596026)；Transcriptase First Strand cDNA Synthesis Kit购买于Roche(货号：04379012001)；FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)购买于Roche(货号：4913914001)。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种人软骨细胞培养基，按各组分体积分数计，由89％DMEM/F12，10％胎牛血清，20μg/mL外泌体和1％青霉素-链霉素溶液组成。

所述培养基的配制方法为：分别取87mL液体DMEM/F12液体培养基、10mL胎牛血清、2mL的1mg/mL外泌体和1mL青霉素-链霉素溶液；依次往DMEM/F12中添加胎牛血清、外泌体和青霉素-链霉素溶液。调节培养基pH至7.0即可。具体配制过程中，根据外泌体的添加量(体积)相应减少DMEM/F12液体培养基的体积。

实施例2

一种人软骨细胞培养基，按各组分体积分数计，由91.8％DMEM/F12，7％胎牛血清，22μg/mL外泌体和1.2％青霉素-链霉素溶液组成。

所述培养基的配制方法为：分别取89.6mL液体DMEM/F12液体培养基、7mL胎牛血清、2.2mL的1mg/mL外泌体和1.2mL青霉素-链霉素溶液；依次往DMEM/F12中添加胎牛血清、外泌体和青霉素-链霉素溶液。调节培养基pH至7.2即可。具体配制过程中，根据外泌体的添加量(体积)相应减少DMEM/F12液体培养基的体积。

实施例3

一种人软骨细胞培养基，按各组分体积分数计，由85％DMEM/F12，14％胎牛血清，18μg/mL外泌体和1％青霉素-链霉素溶液组成。

所述培养基的配制方法为：分别取83.2mL液体DMEM/F12液体培养基、14mL胎牛血清、1.8mL的1mg/mL外泌体和1mL青霉素-链霉素溶液；依次往DMEM/F12中添加胎牛血清、外泌体和青霉素-链霉素溶液。调节培养基pH至7.0即可。具体配制过程中，根据外泌体的添加量(体积)相应减少DMEM/F12液体培养基的体积。

对比例

一种人软骨细胞培养基，按各组分体积分数计，由89％DMEM/F12，10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素溶液组成。

所述培养基的配制方法为：分别取89mL液体DMEM/F12液体培养基、10mL胎牛血清和1mL青霉素-链霉素溶液；依次往DMEM/F12中添加胎牛血清和青霉素-链霉素溶液。调节培养基pH至7.0即可。

实施例4

本实施例以不同培养基为单因素变量，观察培养至第六代的人软骨细胞形态变化。

实验组：采用实施例1的培养基

对照组：采用对比例的培养基

取同一受伤患者膝关节软骨组织分别进行原代培养，培养步骤为：

在无菌条件下取(因意外伤害导致下肢截肢)人膝关节软骨，体积为3×3×0.5cm，采用PBS溶液漂洗3遍，每次漂洗5min；在无菌条件下用手术刀将其剁碎为1mm

将上述实验组得到的人软骨细胞采用实施例1的培养基继续进行传代培养，将上述对照组得到的人软骨细胞采用对比例的培养基继续进行传代培养，培养步骤为：

在人软骨细胞生长融合度达到90％时，采用PBS溶液漂洗1次，漂洗时间为5min，加入胰蛋白酶-EDTA(0.25％)盖过细胞，于细胞培养箱内消化3min，加入终止培养基。终止培养基由体积分数90％的DMEM/F12和体积分数10％的胎牛血清组成。将添加终止培养基的细胞混合液于300离心5min，弃掉上清，分别采用实施例1(实验组)和对比例(对照组)的培养基重悬细胞，细胞计数，按照1×10

重复上述传代培养方法将人软骨细胞培养至第六代，采用倒置相差显微镜分别观察两组软骨细胞形态，实验组见图1，对照组见图2。可见，实验组细胞形态正常，呈多角形；对照组细胞已不具备正常人软骨细胞形态，出现明显的脱分化现象。

实施例5

本实施例对不同培养基得到的第五代细胞增殖活力进行测定。

实验组：采用实施例4中实验组第五代细胞

对照组：采用实施例4的对照组第五代细胞

分别取第五代人软骨细胞对应接种至实验组和对照组的96孔板中，按每孔200μL培养基、2000个细胞接种。将两组培养板放在培养箱中培养(37℃，5％CO

在培养的第3、6、9、12天分别向两组培养板中加入10μL CCK8溶液(孔中均无气泡产生)，再将加入CCK8溶液后的培养板在培养箱(37℃，5％CO

测定结果详见图3，可见，实验组在第3、6、9、12天的OD

实施例6

本实施例对不同培养基得到的第五代细胞标志物—COL 2A1、ACAN的mRNA相对表达水平进行检测。

实验组：采用实施例4中实验组第五代细胞

对照组：采用实施例4的对照组第五代细胞

分别取细胞融合约80％左右的实验组和对照组第五代人软骨细胞接种至30cm

(1)Trizol法提取细胞总RNA：

①弃掉培养基，冰冷的PBS漂洗2次，尽量吸尽PBS后，加入1ml Trizol，冰上裂解5分钟，反复吹打细胞，直至细胞完全裂解；

②于4℃，12000rpm，离心5min，弃沉淀；

③每管加200μL三氯甲烷，剧烈摇晃15s，室温静置15min；

④于4℃，12000rpm，离心15min，吸上层水相于另一EP管中，加入500μL异丙醇，冰上放置10min；

⑥于4℃，12000rpm，离心10min，弃上清，可见RNA沉于管底；

⑦加入1mL 75％无水乙醇，温和震荡，洗涤RNA；

⑧于4℃，8000rpm，离心5min，弃上清，将沉淀的RNA的EP管置于冰上晾干8min，直至沉淀呈无色胶冻样；

⑨25μLDEPC水溶解沉淀；

⑩用分光光度计测量所提RNA的浓度及纯度。

(2)RNA反转录为cDNA：

①用Transcriptase First Strand cDNA Synthesis Kit构建20μL逆转录反应体系，以不加入逆转录酶的样本为阴性对照，反应体系如下：

总RNA(1μg)；1μL锚定寡核苷酸(dT)18引物；2μL随机六聚寡核苷酸引物；ddH

上述变性模板引物mix加入：5μL 5×逆转录buffer；0.5μLprotectorRNaseinhibitor；2μLdNTP；0.5μL逆转录酶。上述反应体系轻轻混匀，稍微离心，放入PCR仪25℃加热10分钟，55℃加热30分钟，85℃加热5分钟。

(3)qPCR扩增基因片段：

①使用Primer5软件设计人COL2A1的特异性扩增引物：

SEQ ID NO：1：Forward 5′-AGAGACCTGAACTGGGCAGA-3′，

SEQ ID NO：2：Reverse 5′-TGACACGGAGTAGCACCATC-3′；

使用Primer5软件设计人ACAN的特异性扩增引物：

SEQ ID NO：3：Forward 5′-AAAGAAGTAGGAGTGGGCTTTGC-3′，

SEQ ID NO：4：Reverse 5′-CCCCATTCACACTGATGATCAT-3′；

使用Primer5软件设计人GAPDH的特异性扩增引物：

SEQ ID NO：5：Forward 5′-AACCACACTCGGACCACATC-3′，

SEQ ID NO：6：Reverse 5′-ACATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3′。

注：GAPDH是实时PCR的内参，在计算中使用。

②用ROX构建20μL qPCR反应体系，以H

7μL RNase Free H

③将上述预混液混匀后放入PCR仪器中，调节程序为95℃加热5min，95℃加热30s，60℃加热30s，40个循环。

实验组和对照组人软骨细胞标志物—Ⅱ型胶原mRNA相对表达水平测定结果详见图4，可见，实验组COL2A1的mRNA相对表达水平为15.05，对照组COL 2A1的mRNA相对表达水平仅为1，表明外泌体培养基培养人软骨细胞至第五代仍可高转录Ⅱ型胶原mRNA，有效表达Ⅱ型胶原。

实验组和对照组人软骨细胞标志物—蛋白聚糖mRNA相对表达水平测定结果详见图5，可见，实验组ACAN的mRNA相对表达水平为9.02，对照组ACAN的mRNA相对表达水平仅为1，表明外泌体培养基培养人软骨细胞至第五代仍可高转录蛋白聚糖mRNA，有效表达蛋白聚糖。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 清远市人民医院

<120> 一种人软骨细胞培养基及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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agagacctga actgggcaga 20

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tgacacggag tagcaccatc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aaagaagtag gagtgggctt tgc 23

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aaccacactc ggaccacatc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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acatcaagaa ggtggtgaag cagg 24