条件培养基诱导人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的连续进行性特征(英文)

摘要

背景:骨髓间充质干细胞具有多方向分化潜能,如何将其在体外诱导分化为软骨细胞是目前此研究领域的前沿方向。目的:加入一定条件培养基后以体外方式诱导人骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化,观察其在原代、传代培养一系列连续进行性过程中的特征变化。设计:单一样本、开放性实验。单位:苏州大学附属儿童医院骨科。材料:选取2002-08/2003-09苏州大学附属儿童医院收治的单纯性骨囊肿患者5例,3～12岁,在采用自体骨髓注射移植治疗时,均经家属同意每例患者采集5mL骨髓,与浓度为20U/mL的肝素1mL混匀使用,作为本实验人骨髓间充质干细胞的来源。F-12培养液(美国,Gibco);新生牛血清(杭州四季青生物工程有限公司);胰蛋白酶(美国,Sigma);转化生长因子β1(美国,Sigma);维生素C(南京第三制药厂,批号021017)。方法:①标准培养液的配制:向F-12培养液中加入体积分数为0.1的新生牛血清,青霉素、链霉素各100U/mL,Hepes5.8g/L;NaHCO32g/L,谷氨酰胺0.3g/L,pH调至7.2～7.4。②条件培养液的配制:向标准培养液中加入转化生长因子β1使终浓度为1μg/L,再加入维生素C使终浓度为50μg/L,pH调至7.2～7.4。③细胞原代培养:抗凝骨髓5mL,稀释后离心,取有核细胞层,以3×109L-1密度接种于两个50mL培养瓶,另以1×109L-1密度接种于铺有盖玻片的6孔板。选1瓶及3孔加入条件培养液,另1瓶及余下3孔加入标准培养液,分别于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中饱和湿度培养,48h首次换液,以后2～3d换液1次,均为全量换液。倒置显微镜下观察细胞形态。④细胞传代培养:当加入标准培养液的原代细胞培养10～14d,铺满瓶底的80%以上时,用胰蛋白酶+乙二胺四乙酸的混合液消化传代。取传至3,6代的细胞,每一代均分装于两个50mL培养瓶中,1瓶使用标准培养液,1瓶使用条件培养液;同时在铺有盖玻片的6孔板上,3孔使用标准培养液,3孔使用条件培养液。诱导培养时间≥7d。倒置显微镜下观察细胞形态变化。⑤指标检测:采用阿尔新蓝染色法检测原代及传至3,6代细胞糖胺多糖阳性率。免疫组化法测定第3,6代细胞Ⅱ型胶原的阳性表达。主要观察指标:①细胞形态观察。②糖胺多糖的分泌检测。③Ⅱ型胶原的表达检测。结果:①倒置显微镜下,原代培养的骨髓间充质干细胞多数为成纤维细胞样的纺锤形细胞,偶有宽阔、平坦的多边形细胞,传代后表现为一致的纺锤形细胞,经转化生长因子β1+维生素C条件培养液诱导后变为圆形或椭圆形。②与原代细胞浆内糖胺多糖阳性率82.4%比较,使用条件培养液的第3代细胞糖胺多糖阳性率降低至76.3%(χ2=1.14,P>0.05),第6代细胞则显著降低至68.5%(χ2=5.22,P<0.05)。使用标准培养液的传代细胞均为阴性。③使用条件培养液的第3,6代细胞Ⅱ型胶原均呈阳性表达,可见棕黄色的颗粒分布于细胞浆内;而使用标准培养液的传代细胞均为阴性。结论:人骨髓间充质干细胞在转化生长因子β1及维生素C条件培养基的作用下,糖胺多糖和Ⅱ型胶原表达阳性,表现出软骨细胞的生物学特性。