一种无刺蜂蜂蜜提取物及其提取方法和应用

摘要

本发明涉及一种无刺蜂蜂蜜提取物的提取方法及其应用；所述方法包括：1)将无刺蜂蜂蜜溶于pH值为1‑3的水溶液中，形成蜂蜜溶液；2)将活化后的大孔树脂添加到蜂蜜溶液中，搅拌后得到吸附有效成分的大孔树脂；3)将步骤2)得到的大孔树脂装填到洗脱柱中淋洗，洗脱并收集洗脱液；4)将洗脱液低温浓缩，复溶于水，萃取，收集有机层即得。本发明提出了一种更优良的无刺蜂蜂蜜提取物，该提取物的活性成分群具有良好的协同作用，并且意外发现该无刺蜂蜂蜜提取物对于结肠炎特别是溃疡性结肠炎，尤其是因硫酸葡聚糖诱导的急性溃疡性结肠炎而致病的疾病有尤为显著的应用活性，对于其他多种原因所致的结肠炎治疗同样具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学领域，具体涉及无刺蜂蜂蜜用于制备治疗或 预防结肠炎的药物、食品、保健品中的应用。

背景技术

肠道腔侧的肠道上皮细胞和肠道上皮细胞之间的紧密连接构成 了肠道黏膜的物理屏障功能，肠屏障可以有效阻止肠内细菌和内毒素 等有害物质穿过肠粘膜进入血液循环。其中，紧密连接对维持肠道机 械屏障的完整性和稳定性是极为重要的，由occludin、claudins及连接 黏附分子3种膜蛋白和闭合小环蛋白(ZO-1，ZO-2，ZO-3)等外周包 浆蛋白组成。紧密连接的破坏和功能紊乱，会导致细胞渗透性的增加， 使细菌和毒素等有毒物质极易进入肠道黏膜固有层而激活免疫细胞， 引发胃肠道疾病和全身性疾病。例如，炎症性肠病，急性胰腺炎，酒 精诱导肝损伤等。此外，肠道氧化应激也是造成肠道屏障损伤的重要机制之一。氧化应激过程中生成的过量的活性氧不但仅同作用与肠上 皮黏膜的巯基结合造成蛋白质变性和酶失活，而且可与细胞膜内的多 不饱和脂肪酸结合而导致脂质过氧化，进一步加剧肠道细胞损伤。当 前一些研究结果已经表明MAPK信号通路可以调控紧密连接蛋白表 达以及紧密连接的渗透性，在细胞紧密连接的完整性和肠道屏障功能 方面发挥重要作用。已有研究表明，肠道屏障的破坏在肠炎性疾病的 发病机理中具有重要作用，因此改善肠道屏障可以作为预防和治疗肠 道疾病的一种新方法。

无刺蜂(Stingless bees)是一类营群体生活并能酿蜜的昆虫，隶属 于膜翅目(Hymenoptera)、蜜蜂总科(Apoidea)、蜜蜂科(Apidae)，蜜蜂 亚科(Apinae)，麦蜂族(MeliPonini)。主要无刺蜂蜂蜜采集于Melipona 属无刺蜂，Scaptotrigona属无刺蜂和Trigona属无刺蜂。无刺蜂体呈 黑色，体小灵活，是热带地区植物的主要传粉蜂种，主要分布于热带 和亚热带地区，我国仅在云南、海南和台湾地区的田间森林有分布。 无刺蜂蜂蜜是无刺蜂从植物蜜腺或其他部位采来的花蜜，经充分酿 造，存储于巢房的甜蜜物质，与西方蜜蜂蜂蜜相比，具有水分含量高、 酸度高、酶值低、粘度低等特点。蜂蜜早已被人们作为一种天然的甜 味剂，由于其存在的活性成分，也被广泛应用于临床实践。已有报道 证明蜂蜜具有多种生物活性，而对无刺蜂蜂蜜的活性成分的提取和分 离研究进行的还比较少。

我国已发现的无刺蜂蜂种有黄纹无刺蜂(Trigona ventralis Smith)、顶无刺蜂(T.terminate Smith)、暗翅无刺蜂(T.vidua Lepeletier)、蜜色无刺蜂(T.luteaBingham)、黑胸无刺蜂(T.pagdeni Sehwarz)、棕足无刺蜂(T.smithii Smith)、棕胸无刺蜂(T.thoracica Smith)、黑腿无刺蜂(T.vidua Smith)、黑腹无刺蜂(T.canifrons Smith)、黄跗无刺蜂(T.iridipennis Smith)。但无有关我国无刺蜂蜂蜜有关保护 肠道健康活性的研究报道。

发明内容

本发明提供一种无刺蜂蜂蜜提取物及其提取方法，同时提供上述 无刺蜂蜂蜜在制备抑制肠炎类的药品、食品和保健品中的应用。

本发明采用如下技术方案：

一种无刺蜂蜂蜜的提取方法，包括如下步骤：

1)将无刺蜂蜂蜜溶于pH值为1-3的溶液中，形成蜂蜜溶液；

2)将活化后的大孔树脂添加到所述蜂蜜溶液中，搅拌后得到吸 附有效成分的大孔树脂；

3)将步骤2)得到的大孔树脂装填到洗脱柱中，先用pH值为 1.0-3.0的盐酸的水溶液淋洗，再淋洗至中性(优选以水淋洗)，最后 用甲醇洗脱并收集洗脱液；

4)将所述洗脱液通过低温浓缩去除甲醇后得固形物，复溶于水， 用正丁醇萃取，收集正丁醇层，即得无刺蜂蜂蜜提取物。

本发明所述的提取方法，步骤1)中，所述无刺蜂蜂蜜为pH为 3.0-4.0，淀粉酶值为20-40mL/(g·h)，总糖含量为40-50g/100g；无刺蜂 蜂蜜的酸度显著高于普通蜜蜂属蜂蜜。淀粉酶值是判断蜂蜜质量品质 的重要指标，而含糖量低于西方蜜蜂(Apis mellifera)蜂蜜(>60 g/100g)，其中葡萄糖含量最高，为20-30g/100g，其次为果糖 20-25g/100g和蔗糖0.1-0.5g/100g。

所述无刺蜂来源于Melipona属无刺蜂、Scaptotrigona属无刺蜂 或Trigona属无刺蜂。

进一步地，所述无刺蜂蜂蜜为Trigona，优选所述无刺蜂蜂蜜为 黄纹无刺蜂的蜂蜜。

和/或，所述无刺蜂蜂蜜的蜜源植物包括荔枝、龙眼、桉树中的 一种或几种，上述蜜源植物为热带、亚热带地区的植物；优选海南地 区。

和/或，所述无刺蜂蜂蜜为北半球热带、亚热带地区在5月-7月之 间收获的无刺蜂蜂蜜。

优选地，所述水溶液与所述无刺蜂蜂蜜的体积比为(3-5)：1； 更优选5:1。以达到充分溶解蜂蜜中活性物质的目的，且此比例蜂蜜 提取物得率最高。

优选的，步骤1)中的溶解操作为在超声条件下进行，超声参数 为：超声功率40/60KHz，时间30-60min，超声温度40-50℃。本发 明所述的提取方法，步骤2)中，

优选地，所述大孔树脂为Supelco Supelite^TM>

所述步骤2)的具体操作优选为称取无刺蜂蜂蜜50g，将蜂蜜放入500mL烧杯中，加入250mL pH＝2的溶液，得蜂蜜的水溶液；优选搅 拌时间30分钟。

本发明所述的提取方法，步骤3)中，

优选的，所述步骤3)的具体操作为，将Supelco Supelite^TM>

本发明所述的提取方法，步骤4)中，

优选地，所述低温浓缩为减压真空浓缩，温度为30-50℃。

进一步优选，还包括对步骤4)得到的无刺蜂蜂蜜提取物进行液相 色谱-串联质谱联用分离的操作：色谱条件:采用十八烷基硅烷色谱柱， 流动相为纯水-甲醇；流速0.2mL/min；进样量2yL；柱温30℃；洗脱 梯度为0-2min，5％；2-10min，15％-30％；10-25min，30％-90％； 25-30min，90％；30-31min 5％；质谱条件:ESI源，载气温度:350℃， 干燥气流速：11L/min，雾化气压:40psig。

优选地，步骤4)中，水相和有机相的体积比为1:3-4。

本发明还提供上述任一项技术方案所制备得到的无刺蜂蜂蜜提 取物。

所述无刺蜂蜂蜜提取物中，绿原酸当量至少为90ug/g；和/或， 槲皮素当量至少为15ug/g；优选地，所述无刺蜂蜂蜜提取物中，没食 子酸的含量至少为200μg/100g；

和/或，桑色素含量至少为200μg/100g。在上述活性成分含量下， 所述无刺蜂蜂蜜提取物具备更优良的应用效益。

所得蜂蜜提取物为棕褐色具有一定粘稠度的固体，易溶于乙醇等 有机溶剂，不溶于水。

同时，本发明提供一种无刺蜂蜂蜜提取物在制备抑制肠炎类的药 品、食品和保健品中的应用。

本发明所述的肠炎类，主要指结肠炎，其中，涵盖多种结肠炎， 包括缺血性结肠炎、乙状结肠炎、溃疡性结肠炎和伪膜性结肠炎等。 对于溃疡性结肠炎有更为显著的应用效果。

本发明所述的结肠炎，特别是指由局部巨噬细胞释放溶酶体导致 结肠粘膜屏障损伤，

或，肠道菌群改变和肠道粘膜屏障功能的丧失导致的溃疡性结肠 炎。

本发明所述的药品、食品、保健品是以所述无刺蜂蜂蜜提取物作 为单一活性成分或活性成分之一。

本发明提出了一种更优良的无刺蜂蜂蜜提取物，该提取物的活性 成分群具有良好的协同作用，并且意外发现该无刺蜂蜂蜜提取物对于 结肠炎特别是溃疡性结肠炎，尤其是因硫酸葡聚糖诱导的急性溃疡性 结肠炎而致病的疾病有尤为显著的应用活性，对于其他多种原因所致 的结肠炎治疗同样具有广阔的应用前景。同时，发现无刺蜂蜂蜜提取 物能显著增加紧密连接蛋白ZO-1和Occludin基因表达丰度。

附图说明

图1：来源于三种无刺蜂属无刺蜂蜂蜜对硫酸葡聚糖诱导的急 性溃疡性结肠炎大鼠疾病活动指数的影响。MST:Melipona属无刺 蜂；SST:Scaptotrigona属无刺蜂；TST:Trigona属无刺蜂。

图2：来源于三种无刺蜂属无刺蜂蜂蜜对硫酸葡聚糖诱导的急性 溃疡性结肠炎大鼠结肠长度的影响。MST:Melipona属无刺蜂；SST: Scaptotrigona属无刺蜂；TST:Trigona属无刺蜂。

图3：来源于三种无刺蜂属无刺蜂蜂蜜对硫酸葡聚糖诱导的急性 溃疡性结肠炎大鼠结肠紧密连接蛋白ZO-1基因表达的影响。MST: Melipona属无刺蜂；SST:Scaptotrigona属无刺蜂；TST:Trigona属 无刺蜂。

图4：来源于三种无刺蜂属无刺蜂蜂蜜对硫酸葡聚糖诱导的急性 溃疡性结肠炎大鼠结肠紧密连接蛋白Occludin基因表达的影响。MST: Melipona属无刺蜂；SST:Scaptotrigona属无刺蜂；TST:Trigona属无 刺蜂。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中所述的无刺蜂蜂蜜为黄纹无刺蜂的蜂蜜。

实施例1

本实施例提供一种无刺蜂蜂蜜提取物及其提取方法，具体步骤如 下：

1)称取无刺蜂蜂蜜50g，加入250ml盐酸溶液(pH为2.0)，搅拌 溶解后，在50kHz功率超声30min，棉花过滤，形成均一的蜂蜜溶液；

2)Supelco Supelite^TM>

3)静置，弃去上清液，并将大孔树脂填入玻璃柱中，分别用0.1L 的pH为2的盐酸水溶液、0.15L纯水淋洗以除去糖等极性物质，最后用 0.4L无水乙醇溶液洗脱并收集洗脱液，

4)40℃减压真空浓缩至固形物，复溶于10mL纯水，并用10mL 正丁醇萃取。收集正丁醇层，氮气吹干，得到无刺蜂蜂蜜提取物。

对本实施例所得无刺蜂蜂蜜提取物进行测定(福林酚法测定蜂蜜 提取物中的总酚含量、硝酸铝比色法测定蜂蜜中总黄酮含量)，结果 如下：总酚酸含量为121.7ug/g(绿原酸当量)；总黄酮含量为 20.6ug/g(槲皮素当量)；没食子酸和桑色素含量，分别至少为240μg/100g和225μg/100g。

实施例2

本实施例提供一种无刺蜂蜂蜜提取物及其提取方法，具体步骤如 下：

1)称取无刺蜂蜂蜜50g，加入150ml盐酸溶液ml(pH为3.0)，搅 拌溶解后，在40kHz功率超声60min，棉花过滤，形成均一的蜂蜜溶 液；

2)Supelco Supelite^TM>

3)静置，弃去上清液，并将大孔树脂填入玻璃柱中，分别用0.1L 的pH为3的盐酸水溶液、0.15L纯水淋洗以除去糖等极性物质，最后用 0.4L无水乙醇溶液洗脱并收集洗脱液，

4)60℃减压真空浓缩至固形物，复溶于10mL纯水，并用10mL 正丁醇萃取。收集正丁醇层，氮气吹干，得到无刺蜂蜂蜜提取物。

对本实施例所得无刺蜂蜂蜜提取物进行测定(福林酚法测定蜂蜜 提取物中的总酚含量、硝酸铝比色法测定蜂蜜中总黄酮含量)，结果 如下：总酚酸含量为105ug/g(绿原酸当量)；总黄酮含量为18ug/g(槲 皮素当量)；没食子酸和桑色素含量，分别为220μg/100g和218μ g/100g。

实施例3

本实施例提供一种无刺蜂蜂蜜提取物及其提取方法，具体步骤如 下：

1)称取无刺蜂蜂蜜50g，加入250ml盐酸溶液(pH为1.0)，搅拌 溶解后，在60kHz功率超声20min，棉花过滤，形成均一的蜂蜜溶液；

2)Supelco Supelite^TM>

3)静置，弃去上清液，并将大孔树脂填入玻璃柱中，分别用0.1L 的pH为1的盐酸水溶液、0.15L纯水淋洗以除去糖等极性物质，最后用0.4L无水乙醇溶液洗脱并收集洗脱液，

4)30℃减压真空浓缩至固形物，复溶于10mL纯水，并用10mL 正丁醇萃取。收集正丁醇层，氮气吹干，得到无刺蜂蜂蜜提取物。

对本实施例所得无刺蜂蜂蜜提取物进行测定(福林酚法测定蜂蜜 提取物中的总酚含量、硝酸铝比色法测定蜂蜜中总黄酮含量)，结果 如下：总酚酸含量为95ug/g(绿原酸当量)；总黄酮含量为15.5ug/g(槲 皮素当量)；没食子酸和桑色素含量，分别至少为205μg/100g和201 μg/100g。

对比例1

本对比例提供一种洋槐蜂蜜提取物及其提取方法，所述提取方法 以洋槐蜂蜜作为原料，其余提取步骤同于实施例1。

对比例2

本对比例提供一种无刺蜂蜂蜜提取物及其提取方法，所述提取方 法以CN107432877A中实施例1的方式进行提取。

以下通过试验例进一步阐明本发明所述无刺蜂蜂蜜在用于制备 改善肠道健康的药物、食品、保健品中的应用效果。

试验例1

本试验例提供无刺蜂蜂蜜的水分含量测定。

水分含量是评价蜂蜜质量的一个重要标准，所测三种无刺蜂属无 刺蜂蜂蜜样本(Melipona属无刺蜂蜂蜜、Scaptotrigona属无刺蜂蜂蜜 和Trigona属无刺蜂蜂蜜)中水分含量为25-27g/100g，由于蜂蜜国家 标准(GB 14963-2011)中规定：成熟蜜蜂属(Apis属)蜂蜜的水分 含量不得高于24g/100g，故相比较于西方蜜蜂(Apis mellifera)蜂蜜， 无刺蜂蜂蜜具有较高的含水量。pH值是影响蜂蜜货架期的重要因素， 无刺蜂蜂蜜pH为3.0-4.0，酸度显著高于普通蜜蜂属蜂蜜。淀粉酶值是 判断蜂蜜质量品质的重要指标，海南无刺蜂蜂蜜的淀粉酶值为20-40 DN。海南无刺蜂蜂蜜的总糖含量为40-50g/100g，低于西方蜜蜂(Apismellifera)蜂蜜(>60g/100g)，其中葡萄糖含量最高，为20-30g/100g， 其次为果糖20-25g/100g和蔗糖0.1-0.5g/100g，较低的含糖量使无刺蜂 蜂蜜甜味较淡。蜂蜜中存在的蛋白质主要来源于花蜜、花粉和蜜蜂分 泌的酶类。

试验例2

本试验例提供一种无刺蜂蜂蜜提取物对溃疡性结肠炎的治疗作 用。

(1)实验动物：雄性SPF级SD大鼠(45只，8周龄，体重190±20 g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物饲养于浙江省中 医药研究院实验动物中心，培养环境为12h光照+12h黑暗，温度23℃， 相对湿度50％～70％，自由采食和饮水。

(2)实验分组：大鼠在经过一周的适应性饲养后，随机分为5 组：

空白对照组(n＝5)；

模型组(n＝10)；

Melipona属无刺蜂蜂蜜(MST)灌胃组(n＝10，每日灌胃5g/kg 体重)；

Scaptotrigona属无刺蜂蜂蜜(SST)灌胃组(n＝10，每日灌胃5g/kg 体重)；

Trigona属无刺蜂蜂蜜(TST)灌胃组(n＝10，每日灌胃5g/kg体 重)。

日粮配方参考美国AIN-93M标准配方。

(3)实验步骤：实验大鼠经过1周实验日粮饲喂后，开始溃疡性 结肠炎的诱导。除空白对照组饮用蒸馏水外，其余40只大鼠饮用均饮 用含3％DSS，持续7d。7d后替换为正常蒸馏水。DSS饮水开始后直 到实验结束，进行大鼠疾病活动指数(Disease ActivityIndex,DAI) 评估。每日观察2次，按表1标准根据体重下降、大便性状、隐血情况 和动物总体状况评分相加，得出每只大鼠的疾病活动指数。

表1：疾病活动指数

1整体状况包括：活力、行为、姿势等；

2评分解释:0＝正常；1＝轻微；2＝中度；3＝严重；

(4)实验结果：

结果发现，来源于三种无刺蜂属无刺蜂蜂蜜对硫酸葡聚糖诱导的 急性溃疡性结肠炎大鼠疾病活动指数的影响见附图1。由图可见，与 正常对照组比，模型组大鼠从第4天开始出现明显的溃疡性结肠炎症 状，包括精神状态下降、腹泻、便血等症状，DSS开始后第8天DAI 指数达到高峰。与DSS模型组相比，无刺蜂蜂蜜处理即对大鼠疾病活 动指数有一定影响。造模第7天起，无刺蜂蜂蜜处理组即能显著降低 大鼠疾病活动指数。

来源于三种无刺蜂属无刺蜂蜂蜜对DSS诱导的大鼠溃疡性结肠 炎结肠长度的影响结果见附图2。由图可见，与正常对照组比，模型 组大鼠结肠长度减短。与DSS模型组相比，三种无刺蜂属无刺蜂蜂 蜜处理组即能显著提升大鼠的结肠长度。

利用荧光定量PCR检测溃疡性结肠炎大鼠肠道上皮细胞紧密连 接蛋白ZO-1和Occludin基因，结果如图3、4所示。DSS溃疡性结肠炎 大鼠后可显著抑制ZO-1和Occludin的基因表达。相比较与DSS损伤组， 经无刺蜂蜂蜜处理后，ZO-1和Occludin的基因表达显著提高。由此得 出，无刺蜂蜂蜜能够促进紧密连接ZO-1和Occludin基因的表达，并对DSS损伤有一定的拮抗作用，能够减少紧密连接的损伤程度，对肠道 屏障功能具有保护作用。

试验例3

本试验例提供实施例1、对比例1所提供的蜂蜜提取物对于小鼠结 肠炎的应用效果检测。

实验对象：雄性ICR小鼠(6–8周龄，18–22g)，8只/笼饲养 于光照(12h昼夜循环)和温度(20-23℃)稳定的房间。供应空气 为过滤无病原菌空气，相对湿度50％。小鼠自由采食饮水，饮食供应 为商业化无污染饲料。

实验方法：经过1周的适应期，小鼠随机分为5个组(n＝8)：(1) 空白对照组，该组小鼠采用溶剂对照处理；(2)模型组，该组小鼠服 用含硫酸葡萄糖的饮水，持续一周，诱导急性溃疡性结肠炎；(3)阳 性对照组，该组小鼠在硫酸葡萄糖刺激前服用2mg/kg氨基水杨酸； (4)无刺蜂蜂蜜组，该组小鼠口服1000mg/kg无刺蜂蜂蜜一周后饮 用含硫酸葡萄糖的饮水；(5)洋槐蜂蜜组，该组小鼠口服1000mg/kg 洋槐蜂蜜一周后饮用含硫酸葡萄糖的饮水。

实验结果表明洋槐蜂蜜组并不能缓解小鼠硫酸葡聚糖诱导急性 溃疡性结肠炎症状；无刺蜂蜂蜜效果良好，可以有效缓解腹泻、便血 等症状，效果同阳性对照组类似。

试验例4

本试验例提供实施例1、对比例2所提供的蜂蜜提取物对于小鼠结 肠炎的应用效果检测。

实验对象：雄性ICR小鼠(6–8周龄，18–22g)，8只/笼饲养 于光照(12h昼夜循环)和温度(20-23℃)稳定的房间。供应空气 为过滤无病原菌空气，相对湿度50％。小鼠自由采食饮水，饮食供应 为商业化无污染饲料。

实验方法：经过1周的适应期，小鼠随机分为5个组(n＝8)：(1) 空白对照组，该组小鼠采用溶剂对照处理；(2)模型组，该组小鼠服 用含硫酸葡萄糖的饮水，持续一周，诱导急性溃疡性结肠炎；(3)阳 性对照组，该组小鼠在硫酸葡萄糖刺激前服用2mg/kg氨基水杨酸； (4)实施例1无刺蜂蜂蜜组，该组小鼠口服1000mg/kg实施例1得到 的无刺蜂蜂蜜提取物一周后饮用含硫酸葡萄糖的饮水；(5)对照组， 该组小鼠口服1000mg/kg对比例2所提供蜂蜜提取物一周后饮用含 硫酸葡萄糖的饮水。

实验结果表明：无刺蜂蜂蜜效果良好，可以有效缓解腹泻、便血 等症状，效果同阳性对照组类似；对照组具有一定缓解腹泻效果，但 疾病活动指数显著高于无刺蜂蜂蜜组，且不能有效提升肠道紧密连接 蛋白基因表达丰度。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发 明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神 的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。