环二核苷酸cGAMP在防治抗肿瘤化药诱发的并发症或降低化疗药诱导的毒副作用中的应用

摘要

本发明属于医药技术和肿瘤免疫治疗领域，具体涉及一种环二核苷酸（cGAMP）在防治抗肿瘤化疗并发症和降低化药毒副作用中的应用。本发明研究表明，cGAMP可以防治抗肿瘤化疗药物诱发的并发症，增强抗肿瘤化疗药物疗效、降低化疗药物毒性。经小鼠肿瘤模型表明，cGAMP联合5-氟尿嘧啶能够加强5-氟尿嘧啶抑制结直肠癌细胞MC38效果，且能消减因为使用5-氟尿嘧啶诱发的肠道粘膜损伤；cGAMP联合环磷酰胺能够增强抑制淋巴细胞白血病L1210，延长小鼠生存周期，并增加血液中红细胞、血小板、中性粒细胞数量，有防治因为使用抗白血病化疗药诱导的贫血、免疫力低等并发症的作用。因此，环二核苷酸cGAMP可与抗肿瘤化药联合使用，用于防治因化疗药物引发的并发症或降低因化疗诱发的毒副作用。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术、肿瘤免疫治疗领域，具体涉及一种环二核苷酸（cGAMP）及衍生物在联合治疗肿瘤、降低抗肿瘤药物毒性中的应用。

背景技术

肿瘤是一类严重危害人类生命健康的重大疾病之一，表现为细胞过度增殖和分化异常。WHO专家预测，2020年全球人口肿瘤发病将达到2 000万人，死亡人数将达到1 200万人，肿瘤将成为本世纪人类第一杀手，对人类生存构成最严重的威胁。肺癌、结/直肠癌、胃癌、肝癌等的发病率和死亡率均居各类恶性肿瘤的前列。据全国肿瘤登记中心发布的(2012中国肿瘤登记年报》统计，每年新发生肿瘤病例约为312万例，平均每天8 550人，全国每分钟有6人被诊断为癌症。从病种来看，肺癌、胃癌、结/直肠癌、肝癌和食管癌，居全国恶性肿瘤发病的前五位。随着恶性肿瘤发病率和死亡率的逐年增加，恶性肿瘤治疗需求越来越大。

5-氟尿嘧啶,简称5-FU，5-氟尿嘧啶为嘧啶类的氟化物，属于抗代谢抗肿瘤药，能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻断脱氧嘧啶核苷酸转换成胸腺嘧啶核苷核，干扰DNA合成。对RNA的合成也有一定的抑制作用。临床用于结肠癌、直肠癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、绒毛膜上皮癌、恶性葡萄胎、头颈部鳞癌、皮肤癌、肝癌、膀胱癌等。5-FU是第一个根据一定设想而合成的抗代谢药并在临床上是目前应用最广的抗嘧啶类药物，对消化道癌及其他实体瘤有良好疗效，在肿瘤内科治疗中占有重要地位。5-氟尿嘧啶需经过酶转化为5-氟脱氧尿嘧啶核苷酸而具有抗肿瘤活性。5-FU通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶而抑制DNA的合成。此酶的作用可能把甲酰四氢叶酸的一碳单位转移给脱氧尿嘧啶核苷-磷酸合成胸腺嘧啶核苷一酸。5-FU对RNA的合成也有一定抑制作用。5-FU在体内经核糖基化和磷酰化等生物转化作用后，才具有细胞毒性。5-FU可经不同途径生成F-dUMP和FUMP。前者可与胸苷酸合成酶的活性中心共价结合，抑制此酶的活性，使脱氧核苷酸缺乏，DNA合成障碍。此外，5-FU的代谢物也可以伪代谢物形式惨入到RNA和DNA中，影响细胞功能，产生细胞毒性。5-FU是一种不典型的细胞周期特异性药，它除了主要作用于S期外，对其他期的细胞亦有作用。5-氟尿嘧啶副作用有：1.胃肠道反应有食欲减退、恶心、呕吐、口腔炎、胃炎、腹泻，严重者有血性腹泻。2.骨髓抑制：白细胞及血小板下降，严重时可有全血象下降。3.局部刺激：注射部位可引起静脉炎。动脉滴注可引起局部皮肤红斑、水肿、破溃、色素沉着。4.神经系统：少数可有小脑变性、共济失调。5.脱发、皮炎、甲床变黑等。

环磷酰胺，又叫CTX，是一种烷化剂，1958年首次人工合成。临床用于恶性淋巴瘤，多发性骨髓瘤，白血病、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、结肠癌、支气管癌、肺癌等，有一定疗效。环磷酰胺在体外无抗肿瘤活性，进入体内后先在肝脏中经微粒体功能氧化酶转化成醛磷酰胺，而醛酰胺不稳定，在肿瘤细胞内分解成酰胺氮芥及丙烯醛，酰胺氮芥对肿瘤细胞有细胞毒作用。环磷酰胺是双功能烷化剂及细胞周期非特异性药物，可干扰DNA及RNA功能，尤以对前者的影响更大，它与DNA发生交叉联结，抑制DNA合成，对S期作用最明显。环磷酰胺有很多副作用，包括：1、胃肠道反应：环磷酰胺有明显的胃肠道反应，如食欲不振，恶心呕吐等。2、 血液系统：应用环磷酰胺能抑制骨髓，使白细胞减少，大剂量使用可导致血小板减少，贫血。3、 泌尿系统：患者使用环磷酰胺后有时会尿频尿急尿痛，还可出现血尿，高浓度使用时，易造成出血性膀胱炎。4、 增加肿瘤发病率：长期应用环磷酰胺可发生白血病，皮肤癌症，淋巴瘤等，有报道长期应用环磷酰胺的患者膀胱癌的发病率高于正常人10倍。5、 其他：环磷酰胺能抑制卵细胞发育，影响生育，还可导致月经不调，暂时性脱发，皮肤、指甲色素沉着等副作用。

在天然免疫通路中，感染的哺乳动物细胞中微生物和病毒DNA能通过刺激干扰素分泌诱导內源强有力的免疫应答。内质网（ER）受体蛋白（STING）对胞质DNA的免疫应答是必需的因素。最近的研究表明，环化cGMP-AMP二核苷酸合成酶（cGAS）在结合DNA后的活化条件下，内源性地催化cGAMP的合成。cGAMP是一种胞质DNA传感器，它作为第二信使通过STING刺激INF-β的感应，介导TBK1和IRF-3的活化，进而启动INF-β基因的转录。最近报道，重组cGAS在DNA结合条件下催化环化cGMP-AMP二核苷酸GAMP。cGAS结合18bp dsDNA的复合物的晶体结构也已被报道，cGAMP在抗病毒免疫方面的研究已被证实。cGAMP结合STING，使转录因子IRF3激活并产生β干扰素，活化树突状细胞和T细胞，能够激活免疫应答反应，因此可能cGAMP作为STING的配体，可以激活免疫系统。

发明内容

本发明的目的是提供一种二核苷酸cGAMP在防治抗肿瘤化疗诱发的并发症和降低化药毒副作用中的应用。

本发明的二核苷酸cGAMP，其特征在于可增强化疗药物治疗肿瘤疗效，治疗因化疗药诱发的并发症, 降低化疗药物副作用。

发明的二核苷酸cGAMP，包括cGAMP及其硫代/硒代cGAMP衍生物。

发明的再一方面涉及本发明中所述的cGAMP在制备抗肿瘤化药诱发的毒副作用或并发症.具体地，所述肿瘤包括但不限于结直肠癌细胞、白血病。

发明的再一方面涉及本发明中所述的cGAMP在制备抗肿瘤化药诱发的毒副作用或并发症.具体地，所述肿瘤包括但不限于结直肠癌细胞、白血病；所述抗肿瘤药物包括但不限于5-氟尿嘧啶、环磷酰胺；所述的降低副作用包括减少肠道粘膜损伤、提升血小板数量。

本文提及二核苷酸cGAMP，如不加特殊说明，均指2’,5’-3’,5’-cGAMP Cyclic [G(2’,5’)pA(3’,5’)p] cGAMP(2’-5’) c[G(2’,5’)pA(3’,5’)p], CAS号为1441190-66-4，分子式为C₂₀H₂₂N₁₀O₁₃P₂>

具体实施方法

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例一：cGAMP制备

cGAMP （环化-GMP-AMP）按文献方法在结合DNA后的活化条件下，由环化cGMP-AMP二核苷酸合成酶（cGAS）催化合成。纯度在98％以上。（Pingwei Li，et al., Immunity, 2013, 39(6), 1019-1031.）

实施例二：小鼠结直肠癌肿瘤模型建立与药物治疗

1. 荷瘤鼠模型的建立

C57BL/6雌性小鼠、6-8周龄，均购自上海斯莱克实验动物有限公司。结直肠癌MC38细胞培养与传代均参照相应细胞培养方式培养与传代，并在对数时期用于肿瘤小鼠模型的建立。在小鼠结直肠癌细胞MC38对数期收集细胞，做成浓度为(1-5×10e6)/ml每毫升的细胞悬液，C57BL/6小鼠右前肢腋下注射0.2 ml MC38细胞悬液 (细胞数目为2-10×10e5个/只)，7-9天左右肿瘤长至直径约3-4mm，致瘤成功。

致瘤成功后，将荷瘤鼠随机均分为5组，每组10只。五组分别是A组：阴性对照组（腹腔注射生理盐水组）、B组：阳性药组（5-氟尿嘧啶，给药剂量10 mg/kg）、C组：阳性药加低剂量 cGAMP组（5-氟尿嘧啶给药剂量10 mg/kg，cGAMP给药剂量5 mg/kg）、D组：阳性药加中剂量 cGAMP组（5-氟尿嘧啶给药剂量10 mg/kg，cGAMP给药剂量10 mg/kg）、E组：阳性药加高剂量 cGAMP组（5-氟尿嘧啶给药剂量10 mg/kg，cGAMP给药剂量20 mg/kg）。阳性药及cGAMP每天尾静脉注射一次。

20天后，处死小鼠并称瘤体重量，观察肿瘤疫苗的作用，抑瘤率=[1-阴性对照组平均瘤重(B、C、D、E组为实验组) ／A组平均瘤重)]×100％。取小鼠肠道组织，染色，并做成切片，比较不同组肠道粘膜损伤情况，同时取正常小鼠的肠道粘膜染色作为对照。

2．统计分析

数据用x±s表示，利用SPSS10.0软件进行处理，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验比较各组瘤重差异的显著性，显著性水平a=0.05。

3.结果

小鼠皮下接种结直肠癌MC38肿瘤细胞后， cGAMP联合阳性药5-氟尿嘧啶可明显抑制肿瘤生长，治疗20天后的瘤重均显著低于未加cGAMP的5-氟尿嘧啶单独治疗效果（P<0.05 ，P<0.01），表明cGAMP联合5-氟尿嘧啶，具有增强5-氟尿嘧啶抗肿瘤疗效。具体结果见表1。 同时，加入cGAMP能够显著降低阳性药5-氟尿嘧啶对肠道粘膜的损伤，见图1。

表1cGAMP联合5-氟尿嘧啶对鼠结直肠癌细胞MC38抑制效果

（n=10，mean±SD）

组别 平均瘤重（g）平均抑瘤率（%）

阴性对照组2.434±0.179 （g）

阳性药组 （5-氟尿嘧啶） 1.263±0.231 （g） 48.1

阳性药加低剂量 cGAMP组 1.048±0.163 （g） 56.9

阳性药加中剂量 cGAMP组 0.727±0.214 （g）*70.1

阳性药加中剂量 cGAMP组 0.581±0.244 （g）** 76.1

注：*P<0.05 vs 阳性药组；**P<0.01 vs阳性药组

图1.cGAMP降低5-氟尿嘧啶对小鼠肠道粘膜损伤结果, 从左至右分别是：正常小鼠肠道、cGAMP单独给药组小鼠肠道粘膜染色结果、阳性药5-氟尿嘧啶给药组小鼠肠道粘膜染色结果、5-氟尿嘧啶联合cGAMP给药组小鼠肠道粘膜染色结果。

实施例三：小鼠白血病模型建立与药物治疗

1.白血病模型的建立

DBA/2雌性小鼠，6-8周龄，均购自上海斯莱克实验动物有限公司。白血病L1210细胞培养与传代均参照相应细胞培养方式培养与传代，并在对数时期用于肿瘤小鼠模型的建立。在小鼠L1210细胞对数期收集细胞，做成浓度为(3×10e7)/ml每毫升的细胞悬液，小鼠静脉注射0.1 ml L1210细胞悬液 (细胞数目为3×10e6个/只)。

将小鼠随机均分为5组，每组10只。五组分别是A组：阴性对照组（静脉注射生理盐水组）、B组：阳性药组（环磷酰胺，给药剂量10 mg/kg）、C组：阳性药加低剂量 cGAMP组（cGAMP给药剂量5 mg/kg）、D组：阳性药加中剂量 cGAMP组（cGAMP给药剂量10 mg/kg）、E组：阳性药加高剂量 cGAMP组（cGAMP给药剂量20 mg/kg）。阳性药及cGAMP每天静脉注射一次。观察小鼠平均生存期。在给药10天后采血，测定血常规，同时取正常的DBA/2小鼠作为对照。

2．统计分析

数据用x±s表示，利用SPSS10.0软件进行处理，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验比较各组小鼠生存曲线差异的显著性，显著性水平a=0.05。

3.结果

小鼠静脉接种L1210白血病细胞后， cGAMP联合环磷酰胺可明显提高小鼠生存期，cGAMP联合环磷酰胺治疗白血病小鼠生存期显著长于环磷酰胺单独治疗组的生存期（P<0.05 ，P<0.01），结果表明：cGAMP联合环磷酰胺，能显著增强环磷酰胺抗白血病疗效。具体结果见表2。且cGAMP可以抑制环磷酰胺的副作用，血小板数量更接近正常数，结果表明：cGAMP可以减少环磷酰胺的部分副作用，提高血小板数量。

表2cGAMP联合环磷酰胺治疗白血病小鼠平均生存期

（n=10，mean±SD）

组别 平均生存期（天）

阴性对照组 9±1.2 （天）

阳性药组 （环磷酰胺）23.2±2.5 （天）

阳性药加低剂量 cGAMP组24.1±1.9 （天）

阳性药加中剂量 cGAMP组 27.8±1.2 （天）*

阳性药加高剂量 cGAMP组30.6±2.1 （天）**

注：*P<0.05 vs环磷酰胺阳性对照组；**P<0.01 vs 环磷酰胺阳性对照组。

表3接受cGAMP联合环磷酰胺治疗的白血病小鼠的血液中血小板数量

（n=10，mean±SD）

组别血小板数（10e10个/L）

正常小鼠 126±27-

阳性药组 （环磷酰胺）27±17

阳性药加低剂量 cGAMP组59±13 *

阳性药加中剂量 cGAMP组77±24 **

阳性药加高剂量 cGAMP组94±36 **

注：*P<0.05 vs环磷酰胺阳性对照组；**P<0.01 vs 环磷酰胺阳性对照组。

表4>接受cGAMP联合环磷酰胺治疗的白血病小鼠的血液中红细胞数量

（n=10，mean±SD）

组别 红细胞数（10e12个/L）

正常小鼠8.5±1.4 -

阳性药组 （环磷酰胺） 4.2±1.1

阳性药加低剂量 cGAMP组4.7±1.3

阳性药加中剂量 cGAMP组5.9±0.8 *

阳性药加高剂量 cGAMP组 7.8±1.1 **

注：*P<0.05 vs环磷酰胺阳性对照组；**P<0.01 vs 环磷酰胺阳性对照组。

表5>接受cGAMP联合环磷酰胺治疗的白血病小鼠的血液中中性粒细胞数量

（n=10，mean±SD）

组别中性粒细胞数（10e9个/L）

正常小鼠 3.9±1.5-

阳性药组 （环磷酰胺）1.2±0.3

阳性药加低剂量 cGAMP组 1.4±0.2

阳性药加中剂量 cGAMP组 1.9±0.4 *

阳性药加高剂量 cGAMP组 3.2±0.5 **

注：*P<0.05 vs环磷酰胺阳性对照组；**P<0.01 vs 环磷酰胺阳性对照组。

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