一种表达微生物胆固醇酯酶的基因工程菌及其构建方法

摘要

本发明公开了一种表达微生物胆固醇酯酶的基因工程菌及其构建方法，属于酶工程技术领域。本发明方法是将Burkholderia？cepacia.源的胆固醇酯酶和胆固醇酯酶分子伴侣基因进行串联共表达，其中胆固醇酯酶基因和分子伴侣基因之间通过SD序列连接。本发明成功地表达了Burkholderia？cepacia.源的胆固醇酯酶，并实现了Burkholderia？cepacia.源的胆固醇酯酶的活性表达、高效表达。本发明构建的基因工程菌发酵的粗酶液中胆固醇酯酶酶活可达640U/L。

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达微生物胆固醇酯酶的基因工程菌及其构建方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

胆固醇酯酶是催化胆固醇酯水解成胆固醇和脂肪酸的一种酶。近些年的研究表明，很多的人类多发症，如心脑血管疾病、肝胆疾病、肾病、糖尿病等，都与人体的胆固醇代谢出现异常有关联，因而，测定血浆总胆固醇的含量己经成为临床诊断中的一个重要参考指标。就现阶段的TC检测来看，胆固醇酯酶是其中的一个关键酶，它能够快速准确的检测出血清中总胆固醇的浓度，以用来作为诊断诸如动脉硬化的脂质紊乱疾病，并且，可以用来研究其他诸多临床相关疾病如糖尿病、肾病等。胆固醇酯酶先水解胆固醇酯为游离的胆固醇和脂肪酸，经胆固醇氧化酶氧化，所产生的H₂O₂与4-氨基安替比林和苯酚反应生成醌亚胺。醌亚胺在500nm有特异吸收，反应产生的颜色强度与胆固醇含量成正比，因此可以用比色法测定胆固醇的量。

早期，胆固醇酯酶主要来源于哺乳动物的胰脏、肝脏、肾脏、肠粘膜等部位，它能帮助机体消化吸收油脂类物质。近年来，先后也有一些微生物产胆固醇酯酶的报道，例如可产胆固醇酯酶的微生物有假单胞菌(Pseudomonasp.)、产碱杆菌(Alcaligenesp.)、镰胞菌(Fusariumsp.)、链霉菌(Streptomycesp.)等。现在一般认为微生物源的胆固醇酯酶特异性与稳定性都较好，又可进行诱导提高酶产量，提纯工艺简单，因此己在国外试剂盒中普通采用。

Burkholderiacepacia.源胆固醇酯酶具有独特的酶学性质，具有巨大的潜在利用价值。目前，胆固醇酯酶的表达大多利用两种相容载体进行共表达，即两种复制子不同因而可以在宿主菌中共存载体进行共表达。然而，这样的相容载体不容易得到，因为绝大多数商品化大肠杆菌表达载体均为ColE1/pMB1复制子。而据已有报道显示，Burkholderiacepacia.源胆固醇酯酶的表达一定要有分子伴侣的参与，才能检测到有活性的目的蛋白，分析预测可能是分子伴侣辅助折叠中间体正确折叠，并降低此过程中的能障，为其提供空间立体信息，从而合成有活性物质。鉴于采用两种载体分别表达，存在构建方法繁琐、多个载体增加了细胞代谢负担等缺陷，本发明采用人工添加SD序列连接胆固醇酯酶基因与分子伴侣基因进行共表达，并检测到产生活性物质。

发明内容

为了克服上述问题，本发明提供了一种新的表达微生物胆固醇酯酶的方法和基因工程菌。

本发明的第一个目的是提供一种表达微生物胆固醇酯酶的方法，所述方法是将胆固醇酯酶基因和胆固醇酯酶分子伴侣基因进行串联共表达，其中胆固醇酯酶基因和分子伴侣基因之间通过SD序列连接，即直接在胆固醇酯酶基因终止密码子后添加SD，然后直接与伴侣蛋白基因的起始密码子相连。

所述SD序列为gatccataaggaggcaatctt(如SEQIDNO.1所示)。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物胆固醇酯酶是Burkholderiacepacia.源的胆固醇酯酶(cheS)，其氨基酸序列是NCBI上GenBank：BAD13379.1的序列。

在本发明的一种实施方式中，所述胆固醇酯酶分子伴侣是Burkholderiacepacia.源的胆固醇酯酶分子伴侣(limS)，其氨基酸序列是NCBI上GenBank：BAD13380.1的序列。

在本发明的一种实施方式中，所述串联共表达的核苷酸序列是SEQIDNO.2所示的序列。

在本发明的一种实施方式中，所述方法，是以pET28a(+)为载体、大肠杆菌为宿主进行微生物胆固醇酯酶的表达。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主为E.coliBL21(DE3)。

本发明的第二个目的是提供一种氨基酸序列，所述氨基酸序列是在胆固醇酯酶氨基酸序列的基础上，依次增添SD序列和胆固醇酯酶分子伴侣氨基酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述胆固醇酯酶氨基酸序列如NCBI上GenBank：BAD13379.1所示；所述SD序列为gatccataaggaggcaatctt(如SEQIDNO.1所示)；所述分子伴侣氨基酸序列如NCBI上GenBank：BAD13380.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述氨基酸序列是由如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列所编码的。

本发明的第三个目的是提供一种基因工程菌，所述基因工程菌共表达胆固醇酯酶和胆固醇酯酶分子伴侣，其中胆固醇酯酶基因和分子伴侣基因是通过串联共表达；所述串联共表达是在胆固醇酯酶氨基酸序列的基础上，依次增添SD序列和胆固醇酯酶分子伴侣氨基酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述串联共表达是表达的如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。

本发明还提供上述方法或者基因工程菌、氨基酸序列的应用，是应用于食品、医药、纺织、造纸等领域。

本发明的有益效果：

本发明方法通过在胆固醇酯酶氨基酸序列的基础上，依次增添SD序列(gatccataaggaggcaatctt)和胆固醇酯酶分子伴侣氨基酸序列，成功地表达了Burkholderiacepacia.源的胆固醇酯酶，并实现了Burkholderiacepacia.源的胆固醇酯酶的活性表达、高效表达。本发明克服了相容载体共表达所存在的相容载体不容易得到、构建方法繁琐等缺陷。同时，本发明构建的基因工程菌发酵的粗酶液中胆固醇酯酶酶活可达640U/L。

附图说明

图1：胆固醇酯酶及其分子伴侣基因纯化的琼脂糖凝胶鉴定照片；

图2：cheS诱导表达与纯化的SDS-PAGE鉴定照片。

具体实施方式

实施例1：重组载体和基因工程菌的构建

(1)胆固醇酯酶cheS基因片段，序列如GenBank登录号为AB175022.1(Burkholderiacepacia.源的胆固醇酯酶)。SD基因片段核苷酸序列为：gatccataaggaggcaatctt。胆固醇酯酶分子伴侣limS基因片段，序列如GenBank登录号为AB175022.1(Burkholderiacepacia.源的胆固醇酯酶分子伴侣)。

(2)化学合成SEQIDNO.2所示序列的cal基因片段，或者将上一步的cheS基因、limS基因进行优化后，与SD进行连接得到SEQIDNO.2所示序列的片段。

(3)以SEQIDNO.2所示序列的片段为模板，序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4分别为上下游引物进行PCR，用quickcutDpnⅠ消化PCR产物，去除模板质粒。得到含有SEQIDNO.2所示序列的重组质粒pET28a(+)-cal。

(4)将pET28a(+)-cal转化得到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中，验证重组转化子，验证正确的即为菌株E.coli-cal，所产胆固醇酯酶即为CHE。

实施例2：基因工程菌发酵产酶

粗酶液的制备

种子液的培养条件：采用250mL摇瓶培养，装液为20％的LB培养基，并在培养基中加入过滤除菌的100mg·mL^-1硫酸卡那霉素50μL，取单菌落至培养基中，37℃，180rpm，过夜培养。

发酵液培养条件：采用500mL摇瓶培养，装液为20％的发酵培养基，其中的MgSO₄·7H₂O，葡萄糖，甘油分别配成母液，单独灭菌，用时添加相应的量，并加入过滤除菌100mg·mL^-1的硫酸卡那霉素100μL，加入5％的种子液，37℃，200rpm，培养8h，加入20％的乳糖诱导液，28℃，200rpm，诱导培养20h。

菌体的收集及粗酶液的获得：将发酵液8000rpm离心5min，称得湿重，按1g湿菌体加入20mLpH7.0，0.11M的磷酸钾缓冲液的比例重悬菌体，进行超声破碎，使用过程破壁4min，停1min，并吹打菌液，防止破壁过程中因温度过高导致酶的失活，破壁30min后8000rpm离心10min，上清即为粗酶液。经测定，粗酶液的酶活是640U/L。

胆固醇酯酶酶活定义：在37℃下，每分钟催化1μmol胆固醇酯底物转化成产物所需的酶量定义为1个酶活力单位(U)。

其中，酶活测定的基本步骤是先用胆固醇酯酶水解胆固醇酯为游离胆固醇和脂肪酸，胆固醇再被胆固醇氧化酶氧化为Δ⁴-胆甾烯酮和H₂0₂。终点产物的测定可测Δ⁴-胆甾烯酮和H₂0₂。现常用Tninder显色系统:过氧化物酶，4-氨基安替比林和苯酚三者合称(PAP)来检测H₂0₂。反应生成红色醌亚胺染料，500nm条件下测量，其所得的吸光值与样品中的胆固醇浓度有一对应的线性关系，可通过预先得到的标准曲线求出对应的总胆固醇浓度。

具体操作：比色管中加入2mL检测液A(4-氨基-安替比林，1.5mmol/L；苯酚，22mmol/L；叠氮钠，0.2g/L；0.33％(wt/vol)TritonX-100；过氧化物酶，5U/mL；胆固醇氧化酶，0.6U/mL；磷酸钾缓冲液，0.11mol/L，pH7.0)+100uL酶液+1mL胆固醇酯底物(异丙醇为溶剂)，三种组分振荡混匀后，37℃水浴10min，立即用沸水煮10min，使酶失活，放冷水中冷却；9000rpm，离心2min；上清A500处测吸光值，平行实验测三次，取平均值。酶活标准曲线的测定参见文献(陈亦.胆固醇氧化酶亲和纯化及酶稳定性研究〔D〕.无锡.江南大学.2013)。

实施例3：CAL的纯化

以琼脂糖为基质，2-羟基-1，3-丙二胺连接臂，8-氯咯嗪为配体合成的介质进行亲和纯化。

1.样品制备：将上样粗酶液的的电导率与0.11M磷酸钾缓冲液(pH7.0)的电导率调节到一致。

2.装柱：15mL塑料小柱垂直固定，柱子下端导管打开，装入3mL介质，静置沉淀，使柱中乙醇流出约至略高出介质界面。

3.平衡：用0.11M磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡10个柱体积。

4.上样：取20mL粗酶液加到平衡好的亲和介质中。

5.洗涤：用0.11M磷酸钾缓冲液(pH7.0)洗10个柱体积，洗去未结合的蛋白，再用含0.1mol·L^-1NaCl的磷酸钾缓冲液(pH7.0)洗去部分与介质结合不牢固的杂蛋白。

6.洗脱：以含0.5mol·L^-1NaCl的磷酸钾缓冲液(pH7.0)为洗脱液，收集并测定胆固醇酯酶活性用SDS-PAGE检测蛋白的分子量大小和纯度。结果如图2所示。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。