一种高效构建LIC表达载体的方法和一种高效构建RNA干扰载体的方法

摘要

人类基因组测序计划的完成推动了生物学研究向后基因组时代的迈进。大量的基因信息迫切要求发展适合于高通量、自动化的研究基因功能的方法。蛋白质是基因表达的重要产物之一，是生命活动的主体，因此研究蛋白质的功能具有重大意义。近年来，RNA干扰技术被证明是有效阐明基因功能的有力工具。本研究着眼于发展新的构建LIC载体的方法，以用于高通量蛋白质表达纯化；另外，还提出了新的构建RNA干扰载体的方法，使其能有效的用于基因功能研究。 本研究中提出了一种新的产生不依赖连接酶(Ligation-independent cloning，LIC)的表达载体的方法，并将此LIC载体用来表达产生不带有任何额外氨基酸的天然蛋白质。本实验中，LIC载体经缺刻酶N．BbvC IA和限制性内切酶SwaI依次酶切，产生两个带有固定碱基的一定长度的单链粘性末端；相应的目的基因的PCR片段在dGTP存在的条件下用T4 DNA聚合酶处理，生成与载体相匹配的粘性末端。处理后的载体和片段体外温育，退火，转化大肠杆菌后分子间的缺刻被修复，形成完整的重组质粒。另外，在载体上编码亲和标签和靶蛋白的序列之间设计有一TEV蛋白酶识别位点。得到的重组质粒能用来表达融合有His<,6>-tag或His<,6>-GST的重组蛋白，纯化的融合蛋白经体外TEV蛋白酶酶切后能有效的出去标签，得到不含任何外源氨基酸的天然蛋白。此方法不仅使用于单个目的蛋白的表达纯化，也能有效的用于蛋白质组的研究。 另一方面，本研究提出了一种新的方法来构建RNA干扰载体，即利用反向PCR的方式来扩增RNA干扰骨架载体，通过在引物中加上针对靶基因的干扰序列，同时使正反向引物带上10bp同源区，PCR产物直接转化大肠杆菌感受态细胞，在大肠杆菌体内同源重组而得到环化的重组质粒。实验中，构建了针对萤火虫荧光素酶和p53两个不同基因的RNA干扰载体，结果证明我们的方法能高效的用于RNA干扰载体的构建，且操作简便快速。这一方法能有效的用于单个基因的RNA干扰载体的构建，也能用于大规模的基因功能研究。

目录

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论文说明：缩略词

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引言

第一部分文献综述

1.1后基因组学研究概况

1.2基因功能研究概述

1.2.1高通量蛋白质表达纯化的意义

1.2.2基因克隆技术概述

1.2.3大肠杆菌中表达克隆化基因

1.2.4本研究的背景和目的

1.3 RNA干扰研究概述

1.3.1 RNA干扰作用机制

1.3.2 RNA干扰的生物学意义

1.3.3 RNA干扰的应用

1.3.4 RNA干扰技术进展

1.3.5本研究的目的

第二部分材料和方法

2.1材料

2.1.1菌株和质粒

2.1.2培养基

2.1.3试剂和酶

2.1.4主要缓冲液:

2.1.5仪器和设备

2.2方法

2.2.1质粒DNA的抽提及纯化

2.2.2大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.3大肠杆菌常规转化

2.2.4 PCR反应体系

2.2.5 PCR产物的T4 DNA聚合酶处理

2.2.6 SDS聚丙烯酰胺凝胶

2.2.7重组蛋白的诱导表达

2.2.8 His6-tag融合蛋白的纯化

2.2.9 GST融合蛋白的纯化

2.2.10融合蛋白的体外酶割

2.2.11 DNA片段miR30的合成

2.2.12 HEK293T细胞的传代培养

2.2.13质粒DNA转染哺乳动物细胞

第三部分结果与分析

3.1蛋白质表达纯化的结果与分析

3.1.1 LIC载体的构建

3.1.2目的基因的克隆和融合蛋白表达分析

3.1.3融合蛋白纯化及体外TEV蛋白酶消化

3.2 RNA干扰的结果与分析

3.2.1 RNA干扰骨架载体的构建

3.2.2针对特定靶基因的RNA干扰载体的构建

3.2.3 RNA干扰效果检测

第四部分讨论与展望

4.1讨论

4.1.1酶切产生LIC载体的优点

4.1.2本研究中LIC载体的特点

4.1.3基于miRNA的RNA干扰载体的构建

4.1.4反向PCR方法构建RNA干扰载体

4.1.5筛选方法对克隆成功率的影响

4.2展望

4.2.1 LIC载体用于大规模的蛋白质表达与纯化

4.2.2构建不同亲和标签的LIC表达载体

4.2.3 RNA干扰效果的测定

4.2.4 PCR条件和引物设计的优化

参考文献

附录：本实验中用到的引物

致谢