基于外源基因旁侧序列鉴定转基因水稻吉生粳2号的方法

摘要

本发明涉及一种基于外源基因旁侧序列鉴定转基因水稻吉生粳2号的方法，属于生物技术领域。具体提供了基于外源插入片段旁侧序列鉴定转基因水稻品系吉生粳2号的特异性引物；以待测水稻总DNA为模板，用所述特异性引物进行PCR检测，确定待测水稻是否为转基因水稻品系吉生粳2号，同时确定是否为纯合型或杂合型吉生粳2号。本发明可以快速准确地鉴定出待测样品是否是转基因水稻吉生粳2号，同时能够判断纯合型或杂合型，建立了高度灵敏、特异性的转基因水稻品系吉生粳2号的品系特异性PCR检测方法，适合于转基因水稻吉生粳2号及其衍生品种制品的定性检测，为转基因安全提供了保证。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于外源基因旁侧序列鉴定转基因水稻 吉生粳2号的方法，及相应的引物和纯合型转基因水稻吉生粳2号特异性PCR扩增 片段的核苷酸序列。

背景技术

目前，已报道的转基因作物成分检测方法，主要包括针对外源目的基因和调 控元件检测的基因特异性检测方法，针对遗传转化载体的特征建立的载体特异性 检测方法，针对外源DNA插入特征序列建立的转基因作物品系特异性检测方法等 三类。与前两种方法相比，转基因作物品系特异性检测方法具有最高的特异性， 最适合转基因产品的定性和定量检测。由于每个转基因作物品系，外源基因在受 体基因组中的整合位点具有随机性，即相同的载体多次转化，整合的位置具有高 度的特异性和不可重复性，因此利用外源基因旁侧序列进行品系特异性检测的方 法具有特异性和准确性，并且能够鉴别外源DNA插入的纯合或杂合状态。

水稻是我国乃至全世界最重要的粮食作物之一，是世界上食用人口最多、历 史最悠久的农作物。随着转基因技术在水稻中的广泛研究和应用，已经有多个转 基因水稻品系进行了环境释放，申请商业化种植。对转基因植物进行品系特异性 检测是对转基因植物进行监督管理，保障其健康发展的重要技术基础。目前已经 有部分专利和文献报道了利用品系特异性PCR检测方法鉴定转基因植物的方法。 张琰等人于2010年根据转基因水稻品系科丰6号的外源插入片段的边界序列设计 了科丰6号特异性引物和特异性探针，提供了可以快速检测转基因水稻科丰6号的 方法，为转基因安全提供了保证；金芜军等人于2013年基于转基因抗虫水稻品系 TT51-1的旁侧序列建立了鉴定纯合型转基因抗虫水稻品系TT51-1的方法。然而， 在对现有的专利和文献的分析中发现，国内外目前还没有鉴定转基因抗虫水稻品 系吉生粳2号检测方法的相关报道。

发明内容

本发明提供一种基于外源基因旁侧序列鉴定转基因水稻吉生粳2号的方法， 及相应的引物，并提供纯合型转基因水稻吉生粳2号特异性PCR扩增片段的核苷酸 序列。

为了实现本发明的目的，本发明的一种检测转基因抗虫水稻品系吉生粳2号 的3条特异性引物，其包括：

正向引物SEQIDNO.1:ACGAGACATGGCAAAGTTTGATT，

反向引物SEQIDNO.2:CGCGCTTAAAGATATACAAACCA,

T-DNA特异性引物SEQIDNO.3:TAATGTGTGAGTAGTTCCCAGATAAG。

该3条引物是基于转基因抗虫水稻品系吉生粳2号外源基因的旁侧序列而设 计的引物，其正向引物和反向引物依据水稻基因组序列设计，位于水稻1号染色 体(GenBank登记号：NC_008394.4)的41607255-41607277bp和 41608280-41608258bp位置，T-DNA特异性引物按照T-DNA左边界区域序列设计， 位于T-DNA左边界338-313bp区段。利用该引物在特定的扩增条件下进行聚合酶链 式扩增(PCR)，在以纯合型转基因抗虫水稻品系吉生粳2号的基因组DNA为模板可 以扩增出一条短片段SEQIDNO.4(446bp)，以杂合型转基因抗虫水稻品系吉生粳2 号的基因组DNA为模板扩增出两条片段(1026bp和446bp)，以非转基因水稻的基因 组DNA为模板扩增出一条PCR条带(1026bp)。

本发明提供基于外源基因旁侧序列建立的鉴定转基因抗虫水稻品系吉生粳 2号的方法，包括步骤：1)提取植物基因组；2)以步骤1)的基因组为模板，利 用上述特异性引物进行PCR检测。

PCR反应条件优选为：94℃2min；94℃20s，55℃40s，35个循环；72℃ 10min。

PCR反应体系优选为：：2μl200ng/μl模板，康为世纪2×EsTaq MasterMix(含有EsTaqDNAPolymerase,PCRbuffer,3mMMgCl₂,400uMdNTPmix), 1μl10μM正向引物，1μl10μM反向引物，1μlT-DNA特异性引物，补ddH₂O 至20μl。

本发明首次基于外源基因旁侧序列建立转基因抗虫水稻品系吉生粳2号的鉴 定方法，并且能够鉴定外源基因的纯合型或杂合型，可用于转基因检测用标准物 质候选物的筛选鉴定，为转基因安全提供了保证。在转基因作物遗传育种过程中， 需要将转基因材料与其它材料进行杂交、转育以获得适合的栽培品种，利用分子 生物学手段快速、简便鉴定纯合体/杂合体育种材料，有利于缩短育种进程，为 后续的转基因作物遗传育种奠定了基础。

附图说明

图1为本发明通过PCR在水稻中的扩增结果；其中，M：100bpDNAladder； 1：空白对照；2：非转基因水稻吉粳88；3：外源基因杂合的粳稻品系吉生 粳2号；4：外源基因纯合的粳稻品系吉生粳2号。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook等的《分子克隆：实验室手册》(NewYork：ColdSpringHarbor LaboratoryPress，2001)中所述的条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条 件。所用试剂和材料均为市售商品。

实施例

利用引物，其中正向引物为SEQIDNO.1:ACGAGACATGGCAAAGTTTGATT，反向 引物为SEQIDNO.2:CGCGCTTAAAGATATACAAACCA,T-DNA特异性引物为 SEQIDNO.3:TAATGTGTGAGTAGTTCCCAGATAAG，进行PCR扩增鉴定待测样品是否为转 基因抗虫水稻粳稻品系吉生粳2号，并且可鉴定出外源基因的纯合或杂合状态。

1.实验材料

1.1植物材料

转基因抗虫水稻品系吉生粳2号，非转基因水稻吉粳88。

1.2酶与试剂

分子生物学试剂，康为世纪2×EsTaqMasterMix(含有EsTaqDNA Polymerase,PCRbuffer,3mMMgCl₂,400uMdNTPmix),100bpDNALadder Marker购自Takara。

其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由上海生工生物技术有限 公司合成。

1.3实验仪器

DNA处理仪器：低温混合球磨仪MM400(Retsch)；

PCR扩增仪：BioRAD(ABAppliedBiosystemsveriti96wellThermal Cycler(AB))；

核酸电泳仪：DYY-11型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)；

DNA电泳分析系统：GeneSnap凝胶成像分析系统；

其它仪器包括：恒温水浴锅、电子天平、离心机、涡旋仪、纯水仪、恒温 培养箱等。

2.实验方法

2.1水稻基因组DNA的提取

水稻单株种植，取幼嫩叶片作为DNA提取材料，用DNA样品提取液[200mM Tris-HCl(pH7.6)，25mMEDTA，250mMNaCl，0.5％SDS]进行水稻基因组DNA 的提取。

a.称取水稻新鲜叶片100mg，剪刀剪碎装入2ml离心管中，放入液氮中预 冷，用低温混合球磨仪充分破碎。加入500μlDNA样品提取液，轻摇20s,60℃ 水浴放置30min以充分抽提DNA，间歇摇动。

b.加入500μl氯仿，轻摇10min，12,000rpm离心5min，将上清移至新 的离心管中。

c.加入1/2体积的异丙醇，轻轻混匀，-20℃放置1h，此时可能会出现絮 状沉淀。

d.将所得的溶液或者絮状沉淀，10,000rpm离心5min，弃废液，置于室 温放置20min，以彻底晾干沉淀。

e.加50-100μlTE缓冲液，37℃放置2-5min，以彻底溶解DNA，4℃条 件下保存备用。

2.2DNA浓度和纯度测定

使用NanoDrop2000分光光度计(ThermoScientific)测定DNA的纯度和浓度， 并用去离子双蒸水调节DNA浓度至100ng/μl。

2.3聚合酶链式扩增(PCR)

根据在前期工作中利用染色体步移方法获得的5’端侧翼序列，用NCBI进行 序列比对分析，确定了包含外源基因的T-DNA在水稻基因组中的插入位点，即水 稻基因组1号染色体(GenBank登记号：NC_008394.4)的第41607441bp处，并检 测出T-DNA左边界序列丢失了第1-77bp区域。从插入位点两侧设计正向和反向引 物用于扩增非转基因对照特异性的片段，在T-DNA左边界区段设计T-DNA特异性反 向引物并与插入位点左侧的正向引物扩增出转基因水稻特异性片段。其中正向引 物位于水稻基因组中的插入位点左侧并距离插入位点186bp，反向引物位于插入 位点右侧并距离插入位点839bp，因此可以扩增出非转基因对照特异性的1026bp 片段，T-DNA特异性引物在靠近T-DNA的左边界区段离左边界的距离为338bp，由 于丢失了T-DNA左边界1-77bp区域，因此T-DNA特异性引物与正向引物扩增出长度 为446bp的转基因水稻特异性扩增片段SEQIDNO.4。

正向引物为:ACGAGACATGGCAAAGTTTGATT，反向引物为: CGCGCTTAAAGATATACAAACCA,T-DNA特异性引物为:TAATGTGTGAGTAGTTCCCAGATAAG。

PCR扩增体系为：总体系20l，康为世纪2×EsTaqMasterMix10μl(含有 EsTaqDNAPolymerase,PCRbuffer,3mMMgCl₂,400uMdNTPmix)，引物各1μ l(10μM)，水稻DNA2μl(100ng/μl)，剩余用ddH₂O补足。

PCR扩增程序：94℃1min；94℃10s，55℃1min，35个循环；72℃10min。

3.实验结果

根据转基因抗虫水稻品系吉生粳2号5’端旁侧序列，用NCBI数据库中的 BLAST工具进行比对确定了T-DNA在吉生粳2号基因组中的插入位点。根据已确定 的插入位点，在吉生粳2号插入位点两侧的基因组中设计了正向引物和反向引物, 在T-DNA的5’端设计了特异性引物。通过3条引物PCR方法，在非转基因水稻吉粳 88、纯合型转基因水稻品系吉生粳2号、杂合型转基因水稻品系吉生粳2号基因组 DNA中进行扩增，能够快速准确地扩增出吉生粳2号特异性片段和非转基因对照 特异性片段，因此能够鉴定出待测样品是否为吉生粳2号，并且也能够鉴定出吉 生粳2号的纯合或杂合状态。PCR扩增程序中我们把延伸时间限定为40S，因此扩 增产物长度不超过2Kb。PCR结果在纯合型转基因水稻吉生粳2号中只能扩增出一 条446bp的片段；杂合型转基因水稻吉生粳2号中扩增出两条片段，一条片段长度 为1026bp(非转基因水稻特异性片段)，另一条片段长度为446bp(吉生粳2号特 异性片段)；而非转基因水稻中只扩增出一条1026bp片段。扩增结果如图1所示， 其中琼脂糖凝胶浓度为1％。

对纯合型转基因水稻吉生粳2号的特异性PCR片段(446bp)进行了正反向测 序，通过分析，该PCR片段包括转化载体的部分序列(SEQIDNO.4中190-446bp)， 和水稻基因组序列(SEQIDNO.4中1-189bp)。该段序列与原先利用染色体步移 方法测定的吉生粳2号旁侧序列完全一致，并且外源基因在水稻基因组中的插入 位点也与利用染色体步移方法确定的结果完全一致，说明基于旁侧序列设计3条 引物进行PCR扩增出的DNA片段是纯合型转基因水稻吉生粳2号的特异性片段，而 不是非特异性扩增片段。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显 而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于 本发明要求保护的范围。