法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2014-08-13
授权
授权
2012-06-27
实质审查的生效 IPC(主分类):C07K19/00 申请日:20100422
实质审查的生效
2012-05-02
公开
公开
技术领域
本发明涉及体内半衰期增加的融合蛋白质或融合肽，以及使用所述融合蛋白质或融合肽增加蛋白质或肽的体内半衰期的方法。
背景技术
蛋白质和肽类药物具有极好的治疗效果，用普通合成的化学药物治疗不会达到这种极好的治疗效果，因此在医学和药学中蛋白质和肽类药物具有重要作用。例如，重组人生长激素(hGH)是治疗生长激素缺陷唯一有效的治疗剂，重组人红细胞生成素(EPO)用于治疗慢性肾脏疾病引起的贫血，因为它能够增加红细胞的水平，重组粒细胞集落刺激激素(G-CSF)用作增加化疗后的癌症病人白细胞数量的唯一药物。此外，在人体中发现的各种类型的细胞因子、激素和肽用作目前无法向其提供其它可选的治疗剂的疾病的唯一广谱治疗剂。
尽管这些蛋白质或肽类药物在体内显示出极好的治疗效果，但由于这些蛋白质和肽类药物注射后被血液蛋白酶立即降解或通过肾脏或肝脏快速从体内排出，它们很快失去其治疗活性并因此具有短的体内半衰期。因此，为了维持这些蛋白质或肽类药物的固定血液水平或滴度需要频繁注射，在这方面，这些蛋白质或肽类药物是不便利的。由于长期使用时对注射的恐惧和注射疼痛或重复给药的不方便，这种频繁注射使患者的药物依从性降低。
为了增加蛋白质或肽类药物的血液稳定性和维持血液中的药物水平持续一段较长的时间段，已经连续进行了许多研究。
例如，用可生物降解的聚合物配制治疗性活性蛋白质或治疗性活性肽已经获得了药物的持续释放剂型，所述可生物降解的聚合物使蛋白质或肽从注射部位缓慢地释放。当皮下注射或肌内注射持续释放药物时，该药物缓慢释放以将该药物维持在固定的水平持续一段特定的时间段(M.Chasin & R. Langer等，Biodegradable polymer as drug delivery system，Marcel Dekker(1990)；J.Heller，等，Adv.Drug Del Rev.，10，163(1993))。在可生物降解的聚合物中，PLGA(聚乳酸-co-乙醇酸)已被广泛使用。例如，生产了LHRH(促黄体生成激素释放激素)激动剂肽的持续剂型，并发现该产品在体内释放所述肽超过一个月或三个月。可生物降解聚合物的使用已经应用于大分子量的蛋白质。例如，美国专利第6,500,448号公布了持续释放人生长激素的药物组合物，所述组合物包含生物相容性聚合物和金属阳离子-复合的人生长激素颗粒。在另一研究中，韩国专利第10-0236771号和第10-0329336号描述了透明质酸在蛋白质药物的持续释放微粒中的使用，这是重组人生长激素应用的特征。
虽然，对于药物的持续释放而言，可生物降解的聚合物已经成功地应用于低分子量的肽，但是它们在大分子量的蛋白质中的应用受到限制。其原因是在生产持续释放微粒的过程中蛋白质容易变性，且变性的氨基酸降低蛋白质的活性，在人体内引起一些不期望的免疫反应。此外，蛋白质或肽的持续释放微粒的尺寸一般较大，当注射入人体时需要的注射器针头较粗，在注射部位造成疼痛。同时，对商业目的来说，所述微粒在产品生产中具有产品产率较低的经济劣势。
为了克服上述问题，研究已经指向延迟蛋白质或肽的肾清除。总的来说，分子量为60,000道尔顿或更小的蛋白质通过肾脏而不被肾脏保留。因此，已经尝试使肽或蛋白质治疗剂的低分子量增大以延长体内循环的时间，由此减少注射的频率。根据这些技术，提供的不是持续释放形式的生理活性蛋白质和生理活性肽，而是提供一种长效形式的生理活性蛋白质和生理活性肽。
用于减少注射频率的最普通的策略之一是将诸如聚乙二醇(以下称为“PEG”)之类的高度可溶的聚合物附着于药学活性蛋白质或药学活性肽的表面。PEG可非特异性地附着于蛋白质或肽的氨基酸的氨基。聚乙二醇化作用可为疏水性药物和疏水性蛋白质提供水溶性，并且提高所述药剂的流体动力学尺寸，从而当其被注射入人体时，循环时间得以延长(Sada等，J.Ferment Bioeng 71，137-139，1991)。
最近，为了减少注射间隔，已经将聚乙二醇化的干扰素α商业化。此外，Kinstler等证明每周注射一次(一个化学疗法周期)聚乙二醇化的粒细胞集 落刺激因子(G-CSF)与每周注射三次G-CSF的药效相同(Kinstler等，Pharm Res 12，1883-1888，1995)。PEG-GCSF已是商品名为“Neulast”的商品。
因为蛋白质的聚乙二醇化作用由PEG与蛋白质表面的非特异性共价结合引起，在聚乙二醇化区域，蛋白质与其受体之间的相互作用可能受到阻碍，因此蛋白质的体内活性显著降低。此外，由于在纯化过程中生理活性位点处的聚乙二醇化的蛋白质必须被排出以留下活性降至可能的最低程度的PEG-蛋白质结合物，聚乙二醇化作用有些难处理。因此在这个过程中，期望的PEG-蛋白质结合物的产品产率显著降低，导致经济上的不利情况。此外，至于一些在水溶液中不稳定的蛋白质而言，其与PEG结合的尝试已经失败。
同时，糖基化工程技术已经用于减少注射频率并且现已商业化。Elliot等报道了通过取代某些位置的氨基酸对红细胞生成素(EPO)进行额外的糖基化作用(Nat Biotechnol 21，414-421，2003；美国专利第7,217,689号)。目前通过糖基化工程技术修饰的红细胞生成素是商品名为“阿法达贝泊汀”(“Aranesp”)的商品，并且已知由于在末端用唾液酸添加糖链并增加了分子量，修饰的红细胞生成素在血流中的循环、新陈代谢和排泄减慢。然而，向蛋白质引入额外的糖基化位点的糖基化工程技术还未广泛使用，因为，糖链的附着或添加可引起生理活性蛋白质失活，并且它维持多种蛋白质的体内稳定性的能力还未被证实。同时可额外附着糖链的生理活性蛋白质的位点的选择面非常窄。此外，糖基化工程技术不易应用于低分子量肽。
基因工程技术的发展通过将生理活性蛋白质与高分子量的蛋白质融合，已使生理活性蛋白质的尺寸得以增加(Curr Opin Drug Discov Devel 12，284-295，2009)。例如，将生理活性蛋白质基因融合于人白蛋白基因，并随后在酵母细胞中表达以生产融合蛋白质(国际专利公布第WO 93/15199号和第WO 93/15200号)。生理活性蛋白质融合于白蛋白的例子包括粒细胞集落刺激因子(Halpern等，Pharm Res 19，1720-1729，2002)、人生长激素(Osborn等，Eur J Pharmacol 456，149-158，2002)、胰高血糖素样肽-1(Baggio等，Diabetes 53，2492-2500，2004)以及干扰素α(Osborn等，J Pharmacol Exp Ther 303，540-548，2002)。
对重组融合技术而言，将蛋白质与铁传递蛋白融合也是已知的。例如，美国专利第7,176,278号公开了一种融合分子，其中将胰高血糖素样肽-1融 合于天然的铁传递蛋白或糖基化的铁传递蛋白，则体内半衰期增加。
同时，蛋白质的体内半衰期可通过融合于免疫球蛋白(Ig)Fc片段而延长(美国专利第5,116,964号和第5,605,690号)。TNF-α受体片段和IgG1 Fc片段的融合基因在动物细胞(中国仓鼠卵巢，CHO)中表达，用编码融合蛋白质的基因转化所述细胞，在USFDA批准所述融合蛋白质作为风湿性关节炎的治疗剂之后，所述融合蛋白质现在是商售的(商品名为：恩利)。此外，Wang(Qinghua Wang；WO 2007/012188)通过将蛋白质融合于Ig Fc片段而延长了半衰期较短的GLP-1(t1/2＜2分钟)或毒蜥外泌肽-4(exendin-4)的体内半衰期。
即使Ig Fc被广泛地用作融合蛋白质的载体以增加体内半衰期，IgG1 Fc保持其自身的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)或补体依赖的细胞毒性作用(CDC)。因此，当注射入人体时，生理活性蛋白质和IgG1 Fc的融合蛋白质可能引起复杂的免疫反应。此外，Fc融合蛋白质的重复给药持续一段很长的时间段可能产生不期望的抗体。因此，IgG1 Fc融合蛋白质的使用在临床应用中受到限制。
韩国专利第10-0725315号公开了使用免疫球蛋白片段的蛋白复合物及其制备方法，在所述方法中通过PEG将生理活性蛋白质融合于IgG Fc。含有生理活性蛋白质-PEG-Fc结构的“蛋白复合物”的体内半衰期比用药代动力学测定法所检测的生理活性蛋白质的体内半衰期长。然而，由于生理活性蛋白质和Fc片段是通过PEG分子化学键合的，在Fc融合方法中表现出的相似的缺点或问题也可在“蛋白复合物”中观察到。
在促进肽类药物的体内稳定性中使用免疫球蛋白的另一例子是将完整的IgG抗体分子与低分子量的肽融合(Rader等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100，5396-5400，2003，Doppalapudi等，Bioorg & Med Chem 17，501-506，2007)。然而，称为“CovX-Body”的这种技术不能应用于大分子量的蛋白质，并且由于生产Fc融合蛋白质或PEG融合蛋白质时所产生的问题，这种技术的使用受到限制。
如上所述，已经进行过许多尝试将生物聚合物融合于生理活性蛋白质或治疗性肽，但这种融合仅仅可应用于有限的蛋白质或肽类范围，原因如下：体内驻留时间不足以形成药用融合蛋白质；明显的低产品产率导致经济上的 不利情况；长时间使用时出现不期望的免疫反应；以及当用于与蛋白质或肽的结合时出现不想要的有毒化学衍生物残余。因此，需要可延长生理活性蛋白质或生理活性肽的体内半衰期且体内活性损失最低的新型融合蛋白质或融合肽。
发明内容
技术问题
本发明的发明人对具有延长的体内半衰期且体内活性损失最小的融合蛋白质或融合肽进行了深入和全面的研究，发现与所述蛋白质或肽自身相比，α-1抗胰蛋白酶或其变体使与其融合的生理活性蛋白质或生理活性肽维持持续的体内循环，并因此具有增加的体内稳定性和体内半衰期(T1/2)，从而得到本发明。
技术方案
本发明提供体内半衰期延长的融合蛋白质或融合肽并且维持所述融合蛋白质或融合肽的持续循环，以及使用所述融合蛋白质或融合肽延长蛋白质或肽的体内半衰期的方法。
附图说明
图1是说明人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]、人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]以及人生长激素/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T109T：α1AT(P357N，S359T)/hGH]的药代动力学变化的图。
图2是说明人干扰素α/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T502：α1AT(P357N)/IFN-α]的药代动力学变化的图。
图3是说明粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T602S：α1AT(P357N，C232S)/G-CSF]和粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶三变体融合[T602ST：α1AT(P357N，C232S，S359T)/G-CSF]的药代动力学变化的图。
图4是说明毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T304：毒蜥外泌肽 -4/α1AT(P357N)]的药代动力学变化的图。
图5是显示人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]的体内活性(脑下垂体去除大鼠的体重变化)的图。
图6是显示粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T602S：α1AT(P357N，C232S)/G-CSF]和粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶三变体融合[T602ST：α1AT(P357N，C232S，S359T)/G-CSF]的体内活性(白细胞数量增加)的图。
图7是显示用毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T304：毒蜥外泌肽-4/α1AT(P357N)]进行的腹膜内葡萄糖耐量测试的结果的图。
图8是显示在糖尿病小鼠模型中毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T304：毒蜥外泌肽-4/α1AT(P357N)]对血糖水平的影响的图。
图9是显示人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]、人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]以及人生长激素/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T109T：α1AT(P357N，S359T)/hGH]的细胞内活性的图。
图10是显示粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T602S：α1AT(P357N，C232S)/G-CSF]和粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶三变体融合[T602ST：α1AT(P357N，C232S，S359T)/G-CSF]的细胞内活性的图。
图11是显示人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]和人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]对胰蛋白酶的抑制活性的图。
图12是显示人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]和人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]对人中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制活性的图。
图13是显示SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]和人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]，以及人生长激素/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T109T：α1AT(P357N，S359T)/hGH]的蛋白质条带的照片。
具体实施方式
根据本发明的一方面，本发明提供体内半衰期延长的融合蛋白质或融合肽，在所述融合蛋白质或融合肽中将生理活性蛋白质或生理活性肽融合于α-1抗胰蛋白酶，由此，所述生理活性蛋白质或生理活性肽可在体内以持续的方式循环。
根据本发明的另一方面，本发明提供体内半衰期延长的融合蛋白质或融合肽，在所述融合蛋白质或融合肽中将生理活性蛋白质或生理活性肽融合于α-1抗胰蛋白酶变体，所述变体在一个或一个以上氨基酸残基处突变，由此，所述生理活性蛋白质或生理活性肽可在体内以持续的方式循环。
根据本发明的又一方面，本发明提供延长生理活性蛋白质或生理活性肽的体内半衰期的方法，所述方法包括将生理活性蛋白质或生理活性肽融合于α-1抗胰蛋白酶或含有一个或一个以上突变氨基酸的α-1抗胰蛋白酶变体，由此，所述生理活性蛋白质或生理活性肽可在体内以持续的方式循环。
下面，给予本发明的详细描述。
根据本发明的融合蛋白质或融合肽的特征是通过将生理活性蛋白质或生理活性肽融合于α-1抗胰蛋白酶或α-1抗胰蛋白酶变体来使用α-1抗胰蛋白酶或α-1抗胰蛋白酶变体维持所述生理活性蛋白质或生理活性肽的持续循环，从而延长体内半衰期。
如本文所使用的术语“融合蛋白质/融合多肽”指新型蛋白质分子，在所述新型蛋白质分子中将大分子量的生理活性蛋白质融合于α-1抗胰蛋白酶或α-1抗胰蛋白酶变体的N-末端或C-末端。同样地，本文所使用的术语“融合肽”指新型肽分子，在所述新型肽分子中将低分子量的生理活性肽融合于α-1抗胰蛋白酶或α-1抗胰蛋白酶变体的N-末端或C-末端。
所述生理活性蛋白质或生理活性肽可直接地或通过由氨基酸组成的连接物融合于α-1抗胰蛋白酶或一个或一个以上氨基酸突变的α-1抗胰蛋白酶变体。
优选地，基因重组技术用于将所述生理活性蛋白质或生理活性肽融合于α-1抗胰蛋白酶或一个或一个以上氨基酸突变的α-1抗胰蛋白酶变体。可选地，本领域所熟知的连接物可用于将所述生理活性蛋白质或生理活性肽融合于α-1抗胰蛋白酶的N-末端或C-末端或游离基团或一个或一个以上氨基酸突变的α-1抗胰蛋白酶变体的N-末端或C-末端或游离基团。
生理活性蛋白质包括激素及其受体、生物应答调节剂及其受体、细胞因子及其受体、酶、抗体和抗体片段。生理活性蛋白质的具体例子包括但不限于：人生长激素(hGH)、胰岛素、促卵泡激素(FSH)、人绒毛膜促性腺激素、甲状旁腺激素(PTH)、红细胞生成素(EPO)、促血小板生成素(TPO)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白介素、巨噬细胞活化因子、肿瘤坏死因子、组织纤维蛋白溶酶原激活剂、凝血因子VII、VIIa、VIII和IX、人成骨蛋白2(hBMP2)、角质化细胞生长因子(KGF)、血小板源生长因子(PDGF)、葡糖脑苷脂酶、α-半乳糖苷酶A、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、乳糖酶、腺苷脱氨酶、丁酰胆碱酯酶、几丁质酶、谷氨酸脱羧酶、伊米苷酶、脂肪酶、尿酸酶、血小板活化因子乙酰水解酶、中性肽链内切酶、尿激酶、链激酶、髓过氧物酶、超氧化物歧化酶、肉毒杆菌毒素、胶原酶、透明质酸酶、L-天冬酰胺酶、单克隆抗体、多克隆抗体、scFv、Fab、Fab′、F(ab′)2和Fd。
生理活性肽的例子包括但不限于：胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及其类似物、毒蜥外泌肽及其类似物、生长激素抑制素及其类似物、促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂及拮抗剂、促肾上腺皮质激素、生长激素释放激素、催产素、胸腺素α-1、促肾上腺皮质激素释放因子、降血钙素、比伐卢定、抗利尿素类似物以及生理活性蛋白质的片段。
α-1抗胰蛋白酶是约50,000道尔顿的哺乳动物血清蛋白，在血液中的量高达约2mg/mL(Robin W.C.等，Nature 298，329-334，1982)。因为α-1抗胰蛋白酶抑制多种蛋白酶，它也被称为α-1蛋白酶抑制剂。然而，结合已知的疾病，α-1抗胰蛋白酶具有保护肺组织免受中性粒细胞弹性蛋白酶破坏的显著功效(Beatty等，J Biol Chem 255，3931-3934，1980)。在α-1抗胰蛋白酶缺失的情况下，中性粒细胞弹性蛋白酶不受约束地破坏有助于肺部弹性的弹性蛋白，导致诸如肺气肿之类的呼吸系并发症。这种蛋白质失调包括α-1抗胰蛋白酶缺乏(一种遗传性异常)。自从被FDA批准后，从血清中提取的α-1抗胰蛋白酶已经成为商售的肺气肿治疗剂，商品名为“Prolastin”。已经证明了Prolastin的稳定性和安全性并且以每周60mg/kg的剂量静脉注射。此外，已知α-1抗胰蛋白酶自身的体内半衰期为约5天至6天(Weweres，MD，等，N.Engl J Med 316， 1055-1062，1987)。在上述内容提供的理论基础之上，即使进行大量α-1抗胰蛋白酶的给药对人体也是安全的，所述α-1抗胰蛋白酶可通过与生理活性蛋白质或生理活性肽相互融合而起增加生理活性蛋白质或生理活性肽的体内半衰期的作用。已知α-1抗胰蛋白酶的结构和α-1抗胰蛋白酶作为蛋白酶抑制剂所起的作用(Elliott，P.等，JMB 275，419-425，1998)。α-1抗胰蛋白酶中的P1氨基酸残基(N-末端起第358位)是甲硫氨酸，甲硫氨酸是结合弹性蛋白酶所必需的残基。还已知α-1抗胰蛋白酶抑制多种蛋白酶，包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶和弹性蛋白酶。α-1抗胰蛋白酶的基因是高度多态的，至今识别了超过100个等位基因，使用IEF(等电聚焦)确定α-1抗胰蛋白酶的表型，并指定字母代号(A到Z)(Stoller等，The Lancet，365，2225-2236，2005)。M等位基因家族(等位基因中最为普遍的)被指定为M，且根据氨基酸序列的突变进一步分成亚型，例如M1(Val213)、M1(Ala213)、M2和M3。因此，本发明中使用的α-1抗胰蛋白酶是属于M等位基因家族的特定亚型，其它亚型也以相同的功效使用。
α-1抗胰蛋白酶变体可通过在一个或一个以上氨基酸处的定点突变来制备。例如，α-1抗胰蛋白酶变体可在P2的357位用天冬酰胺代替脯氨酸。除了在P2的357位用天冬酰胺代替脯氨酸之外，α-1抗胰蛋白酶变体还可含有在其它位置的一个或一个以上其它突变氨基酸。详细地，α-1抗胰蛋白酶变体可在357位用天冬酰胺代替脯氨酸，且任选地，在359位用苏氨酸代替丝氨酸和/或在232位用丝氨酸代替半胱氨酸。在本发明中有用的α-1抗胰蛋白酶变体可选自α-1抗胰蛋白酶单变体[α1AT(P357N)]、α-1抗胰蛋白酶双变体[α1AT(P357N，S359T)]、α-1抗胰蛋白酶双变体2[α1AT(P357N，C232S)]和α-1抗胰蛋白酶三变体[α1AT(P357N，C232S，S359T)]。
从N-末端起，在P2的357位用天冬酰胺(Asn)代替脯氨酸(Pro)得到α-1抗胰蛋白酶单变体[α1AT(P357N)]。该α-1抗胰蛋白酶变体的特征是生成了新的N-糖基化位点Asn-X-Ser，该新的N-糖基化位点的生成有助于发挥如下作用：中和α-1抗胰蛋白酶作为蛋白酶抑制剂的抑制活性以及使注射时氨基酸替代引起的免疫原性降至最低。
在P2的357位用天冬酰胺代替脯氨酸并在359位用苏氨酸代替丝氨酸得到α-1抗胰蛋白酶双变体[α1AT(P357N，S359T)]。该α-1抗胰蛋白酶变体的特 征是生成了新的N-糖基化位点Asn-X-Thr，该新的N-糖基化位点的生成有助于发挥如下作用：中和α-1抗胰蛋白酶作为蛋白酶抑制剂的抑制活性以及使注射时氨基酸替代引起的免疫原性降至最低。
在P2的357位用天冬酰胺代替脯氨酸并在232位用丝氨酸代替半胱氨酸得到α-1抗胰蛋白酶双变体2[α1AT(P357N，C232S)]。该α-1抗胰蛋白酶双变体2的特征是生成了新的N-糖基化位点Asn-X-Ser，该新的N-糖基化位点的生成有助于发挥如下作用：中和α-1抗胰蛋白酶作为蛋白酶抑制剂的活性以及使注射时氨基酸替代引起的免疫原性降至最低，另外防止游离半胱氨酸介导的二聚体形成。
在P2的357位用天冬酰胺代替脯氨酸、在232位用丝氨酸代替半胱氨酸以及在359位用苏氨酸代替丝氨酸得到的α-1抗胰蛋白酶三变体[α1AT(P357N，C232S，S359T)]的特征是生成了新的N-糖基化位点Asn-X-Thr，该新的N-糖基化位点的生成有助于发挥如下作用：中和α-1抗胰蛋白酶作为蛋白酶抑制剂的活性以及使注射时氨基酸替代引起的免疫原性降至最低，另外防止游离半胱氨酸介导的二聚体形成。
本发明的融合蛋白质或融合肽包括人生长激素/α-1抗胰蛋白酶[T109wt：α1AT/hGH](SEQ ID NO：1)、人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体[T109：α1AT(P357N)/hGH](SEQ ID NO：2)、人生长激素/α-1抗胰蛋白酶双变体[T109T：α1AT(P357N，S359T)/hGH](SEQ ID NO：3)、人干扰素α/α-1抗胰蛋白酶单变体[T502：α1AT(P357N)/IFN-α](SEQ ID NO：4)、粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体[T602S：α1AT(P357N，C232S)/G-CSF](SEQ ID NO：5)、粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶三变体[T602ST：α1AT(P357N，C232S，S359T)/G-CSF](SEQ ID NO：6)，以及毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶单变体[T304：毒蜥外泌肽-4/α1AT(P357N)](SEQ ID NO：7)。
与生理活性蛋白质或生理活性肽自身相比，本文所述的所有融合蛋白质或融合肽(人生长激素/α-1抗胰蛋白酶[T109wt：α1AT/hGH]、人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体[T109：α1AT(P357N)/hGH]、人生长激素/α-1抗胰蛋白酶双变体[T109T：α1AT(P357N，S359T)/hGH]、人干扰素α/α-1抗胰蛋白酶单变体[T502：α1AT(P357N)/IFN-α]、粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体[T602S：α1AT(P357N，C232S)/G-CSF]、粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶三 变体[T602ST：α1AT(P357N，C232S，S359T)/G-CSF]和毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶单变体[T304：毒蜥外泌肽-4/α1AT(P357N)])的血清半衰期(t1/2)显著增加，并表现出极好的体内稳定性。
当将人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]注射入脑下垂体去除的大鼠时，发现该人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]诱导动物体重增加。当将粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T602S：α1AT(P357N，C232S)/G-CSF]或粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶三变体融合[T602ST：α1AT(P357N，C232S，S359T)/G-CSF]注射入大鼠时，大鼠体内白细胞水平增加。用毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T304：Exendin-4/α1AT(P357N)]进行给药的组表现出血糖水平比用毒蜥外泌肽-4进行给药的组的血糖水平低，并且这种低血糖水平在给药之后维持了至少24小时。因此，根据本发明的融合蛋白质或融合肽保持体内活性持续一段较长的时间段。
此外，融合蛋白质或融合肽，人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]、人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]、人生长激素/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T109T：α1AT(P357N，S359T)/hGH]、粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T602S：α1AT(P357N，C232S)/G-CSF]和粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶三变体融合[T602ST：α1AT(P357N，C232S，S359T)/G-CSF]具有相似的细胞内活性(EC50)，因此，它们的活性不随载体的类型(即，α-1抗胰蛋白酶和α-1抗胰蛋白酶变体)而显著改变。
此外，本发明的人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]对胰蛋白酶和人中性粒细胞弹性蛋白酶表现出极好的抑制活性，而人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]对胰蛋白酶和人中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制活性很低。因此，人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]和人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]通过持续循环增加体内半衰期的事实不依赖于α-1抗胰蛋白酶的固有性质。
如上所述，与生理活性蛋白质或生理活性肽自身相比，根据本发明的融合蛋白质或融合肽通过持续循环增加了血清半衰期(T1/2)，并因此具有较高 的体内稳定性。因此，本发明的融合蛋白质或融合肽可应用于研制蛋白质或肽类药物的持续循环剂型。
实施例
通过下面的实施例可更好的理解本发明，下面的实施例是对本发明的举例说明但不能解释为对本发明的限制。
实施例1：人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]的制备
1.表达载体pSNAT的构建
构建带有α-1抗胰蛋白酶的表达载体，用于融合于α-1抗胰蛋白酶C-末端的人生长激素的表达。详细地，使用ALT21(SEQ ID NO：8)和ALT30(SEQ ID NO：9)这对引物(所述引物被设计为将人生长激素融合于α-1抗胰蛋白酶的C-末端)通过PCR从载体hMU001448(KRIBB)中获得α-1抗胰蛋白酶基因。同时引物ALT30被设计为具有连接物，所述连接物可向维持融合蛋白质提供必要的柔韧性。用两种限制性内切酶XhoI和BamHI酶切扩增的核酸，并将其克隆至pSGHV0(GenBank Accession No.AF285183)而得到重组载体，称作pSNAT。
2.人生长激素/α-1抗胰蛋白酶载体[T109wt：α1AT/hGH]的构建
使用DH22(SEQ ID NO：10)和ALT12(SEQ ID NO：11)这对引物通过PCR从IOH45734载体(Invitrogen)中扩增人生长激素(hGH)基因。用两种限制性内切酶BamHI和NotI酶切由此获得的PCR产物，并在相同的限制性内切位点BamHI/NotI处将所述PCR产物克隆至pSNAT，从而得到重组的表达载体，称作T109wt(SEQ ID NO：1)。
3.人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合(T109wt)的表达
在中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中表达上面1-2中制备的人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合(T109wt)。在37℃，5％CO2的条件下，CHO-K1保存在补充有10％FBS(胎牛血清)和抗生素的DMEM(Dulbecco′s改良的Eagle培养 基)中。在向CHO-K1细胞中加入人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合(T109wt)的前一天，以1x106个细胞的密度将所述细胞接种到100mm培养皿中。向800μL不含FBS和抗生素的DMEM中加入5μg人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合(T109wt)，并将该混合物在室温下培养1min，与20μg PEI(聚氮丙啶，线型，Polysciences公司(目录号：23966，分子量约25,000))混合，在室温下静置10分钟至15分钟。同时，用PBS洗涤培养了一天的细胞并提供6mL新鲜的DMEM。将在室温静置了10分钟至15分钟的人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合(T109wt)加入培养皿中。第二天，用PBS洗涤细胞并提供不含FBS的IMDM(目录号12200-028，Gibco，Iscove′s改良的Dulbecco′s培养基)以确定蛋白质的表达。
4.人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合(T109wt)的纯化
如上面1-3中所述，T109wt蛋白在中国仓鼠卵巢细胞(CHO0K1)中表达之后，如下所述纯化所述T109wt蛋白。详细地，由于人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合(T109wt)被分泌在培养基中，将细胞培养物离心以收集上清液。用平衡缓冲溶液(20mM磷酸钠，pH 8.0)稀释该上清液，并加至预先用平衡缓冲溶液平衡的Q-琼脂糖凝胶柱(GE Healthcare，美国)中，用平衡缓冲溶液充分洗涤，接着用具有增加的NaCl浓度梯度的洗脱剂(0～400mM NaCl，20mM磷酸钠，pH 8.0)洗脱。将蛋白洗出液与盐混合，加至平衡的苯基-琼脂糖凝胶柱(GE Healthcare，美国)，并用有效量的平衡缓冲溶液洗涤，接着用具有降低的NaCl浓度梯度的洗脱剂(2～0M NaCl，20mM磷酸钠，pH 6.8)洗脱。借助Vivaspin20(GE Healthcare，美国)将蛋白分离物浓缩以产生高度纯化的T109wt。
实施例2：人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]的制备
1.α-1抗胰蛋白酶单变体(pDHT3N克隆载体)的制备
由于在融合分子中用于融合载体的α-1抗胰蛋白酶本身具有抑制活性，通过产生α-1抗胰蛋白酶变体实质上降低了α-1抗胰蛋白酶的抑制活性。就这点 而言，通过PCR从载体hMU001448(KRIBB)中扩增α-1抗胰蛋白酶基因，并将所述基因克隆到yT&A载体中以产生重组载体pDHT3。然后，借助突变形成试剂盒(Stratagene，QuikChange II目录号200523-5)，使用ALT1(SEQ ID NO：12)和ALT2(SEQ ID NO：13)这对引物进行由N-糖基化的天冬酰胺代替P2的357位脯氨酸残基的替代突变，从而产生克隆载体pDHT3N。
2.表达载体pSNATN的构建
构建带有α-1抗胰蛋白酶单变体的表达载体pSNATN，用于融合于失活的α-1抗胰蛋白酶C-末端的人生长激素的表达。详细地，使用ALT14(SEQ ID NO：14)和ALT30(SEQ ID NO：9)这对引物通过PCR从载体pDHT3N中获得α-1抗胰蛋白酶单变体基因，并将其克隆到pSNAT中，称作pSNATN，所述pSNAT已用两种限制性内切酶EcoRV和BamH1酶切以提供重组载体。
3.人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体载体[T109：α1AT(P357N)/hGH]的构建
将实施例1-2中扩增的人生长激素基因在限制性内切位点BamHI/NotI处插入到pSNATN中，从而提供重组表达载体，称作T109(SEQ ID NO：2)。
4.人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合(T109)的表达
用与实施例1-3相同的步骤确定人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合(T109)在中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中的表达。
5.人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合(T109)的纯化
用与实施例1-4相同的方式纯化人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合(T109)。
实施例3：人生长激素/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T109T：α1AT(P357N，S359T)/hGH]的制备
1.α-1抗胰蛋白酶双变体(pDHT3NT克隆载体)的制备
对α-1抗胰蛋白酶进行双突变以降低其活性且实现糖基化作用的均一性，用于通过在分子的活性位点引入糖基化作用位点来制备失活的α-1抗胰蛋白酶。就这点而言，借助突变形成试剂盒(Enzynomics，EZchange目录号EM020)，使用ALT82(SEQ ID NO：15)和ALT83(SEQ ID NO：16)这对引物，在N-糖基化-诱导的pDHT3N克隆载体上用苏氨酸代替359位的丝氨酸残基以形成糖基化作用的均一性，从而产生克隆载体，称作pDHT3N，所述pDHT3N克隆载体带有通过将P2的357位的脯氨酸突变成天冬酰胺而降低活性的α-1抗胰蛋白酶单变体。
2.表达载体pSNATNT的构建
构建表达载体pSNATNT，用于融合于α-1抗胰蛋白酶双变体C-末端的人生长激素的表达，所述融合具有糖基化作用的均一性和降低的活性。就这点而言，使用ALT14(SEQ ID NO：14)和ALT30(SEQ ID NO：9)这对引物(所述引物被设计成将人生长激素融合于α-1抗胰蛋白酶双变体的C-末端)通过PCR从pDHT3NT中扩增α-1抗胰蛋白酶双变体基因，并将α-1抗胰蛋白酶双变体基因克隆到预先用两种限制性内切酶EcoRV和BamHI处理的pSNAT中，得到重组的表达载体，称作pSNATNT。
3.人生长激素/α-1抗胰蛋白酶双变体载体[T109T，α1AT(P357N，S359T)/hGH]的构建
在限制性内切位点BamHI/NotI处将实施例1-2中扩增的人生长激素核酸克隆到pSNATNT中，从而得到表达载体，称作T109T(SEQ ID NO：3)。
4.人生长激素/α-1抗胰蛋白酶双变体融合(T109T)的表达
用与实施例1-3相同的方式确定人生长激素/α-1抗胰蛋白酶双变体融合(T109T)在中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中的表达。
5.人生长激素/α-1抗胰蛋白酶双变体融合(T109T)的纯化
用与实施例1-4相同的方式纯化人生长激素/α-1抗胰蛋白酶双变体融合(T109T)。
实施例4：人干扰素α/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T502：α1AT(P357N)/IFN-α]的制备
1.人干扰素α/α-1抗胰蛋白酶单变体载体[T502，α1AT(P357N)/IFN-α]的构建
使用ALT45(SEQ ID NO：17)和ALT49(SEQ ID NO：18)这对引物通过PCR从MHS1010-98051913载体(Open biosystems)中扩增人干扰素α(IFN-α)基因。用BamHI和NotI双酶切由此得到的PCR产物，然后在限制性内切位点BamHI/NotI处将PCR产物克隆到pSNATN中，从而得到重组的表达载体，称作T502(SEQ ID NO：4)。
2.人干扰素α/α-1抗胰蛋白酶单变体(T502)的表达
用与实施例1-3相同的方式确定人干扰素α/α-1抗胰蛋白酶单变体融合(T502)在中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中的表达。
3.人干扰素α/α-1抗胰蛋白酶单变体(T502)的纯化
用与实施例1-4相同的方式纯化人干扰素α/α-1抗胰蛋白酶单变体融合(T502)。
实施例5：粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T602S：α1AT(P357N，C232S)/G-CSF]的制备
1.α-1抗胰蛋白酶双变体2(pDHT3NS克隆载体)的制备
为了降低α-1抗胰蛋白酶的固有活性并消除半胱氨酸介导的二聚体形成而引起蛋白质变性的可能性，通过α-1抗胰蛋白酶的突变来制备α-1抗胰蛋白酶双变体2，用于蛋白质或肽类治疗剂的制备。就这点而言，借助突变形成试剂盒(Stratagene，QuikChange II目录号200523-5)，使用ALT52(SEQ ID NO：19)和ALT53(SEQ ID NO：20)这对引物，在N-糖基化-诱导的pDHT3N克隆载体上进行由苏氨酸代替232位的半胱氨酸残基的替代突变，从而产生克隆载体，称作pDHT3NS，所述pDHT3N克隆载体带有α-1抗胰蛋白酶单变体，所 述α-1抗胰蛋白酶单变体通过将P2的357位的脯氨酸突变成天冬酰胺而降低活性。
2.表达载体pSNATNS的构建
构建表达载体pSNATNS，用于融合于α-1抗胰蛋白酶双变体2的C-末端的粒细胞集落刺激因子的表达，所述融合于α-1抗胰蛋白酶双变体2的C-末端的粒细胞集落刺激因子具有降低的抑制活性。就这点而言，使用ALT14(SEQ ID NO：14)和ALT30(SEQ ID NO：9)这对引物(所述引物被设计成将集落刺激因子融合于α-1抗胰蛋白酶双变体2的C-末端)通过PCR从pDHT3NS中扩增α-1抗胰蛋白酶双变体2，将α-1抗胰蛋白酶双变体2克隆至预先用两种限制性内切酶BstEII和BamHI处理的pSNAT中，从而得到重组的表达载体，称作pSNATNS。
3.粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体2载体[T602S，α1AT(P357N，C232S)/G-CSF]的构建
使用ALT56(SEQ ID NO：21)和ALT57(SEQ ID NO：22)这对引物通过PCR从IHS1380-97652343(Open biosystems)中扩增粒细胞集落刺激因子(G-CSF)基因。用BamHI和NotI双酶切由此获得的PCR产物，并在限制性内切位点BamHI/NotI处将所述PCR产物克隆到pSNATNS中，从而得到重组的表达载体，称作T602S(SEQ ID NO：5)。
4.粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合(T602S)的表达
用与实施例1-3相同的方式确定粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合(T602S)在中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中的表达。
5.粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合(T602S)的纯化
用与实施例1-4相同的方式纯化粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合(T602S)。
实施例6：粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶三变体融合[T602ST： α1AT(P357N，C232S，S359T)/G-CSF]的制备
1.α-1抗胰蛋白酶三变体(pDHT3NST克隆载体)的制备
为了实现糖基化作用的均一性，通过α-1抗胰蛋白酶双变体的突变来制备α-1抗胰蛋白酶三变体，用于蛋白质或肽类治疗剂的制备。就这点而言，在存在ALT82(SEQ ID NO：15)和ALT83(SEQ ID NO：16)这对引物的情况下使用突变形成试剂盒(Enzynomics，EZchange目录号EM020)，在N-糖基化作用-诱导的pDHT3NS克隆载体上进行苏氨酸代替359位的丝氨酸残基，用于糖基化均一性，所述pDHT3NS克隆载体带有α-1抗胰蛋白酶双变体2，所述α-1抗胰蛋白酶双变体2中的固有活性的降低由P2的357位的脯氨酸被天冬酰胺代替而引起，并且用丝氨酸代替232位的半胱氨酸排除了由半胱氨酸介导的二聚体形成而引起蛋白质变性的可能性。
2.表达载体pSNATNST的构建
构建表达载体pSNATNST，用于融合于α-1抗胰蛋白酶三变体的C-末端的粒细胞集落刺激因子的表达，所述α-1抗胰蛋白酶三变体的活性降低。就这点而言，使用ALT14(SEQ ID NO：14)和ALT30(SEQ ID NO：9)这对引物(所述引物被设计成将粒细胞集落刺激因子融合于α-1抗胰蛋白酶三变体的C-末端)通过PCR从pDHT3NST中扩增α-1抗胰蛋白酶三变体基因，并将所述α-1抗胰蛋白酶三变体基因克隆至预先用两种限制性内切酶BstEII和BamHI处理过的pSNAT上，从而得到重组表达载体，称作pSNATNST。
3.粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶三变体载体[T602ST，α1AT(P357N，C232S，S359T)/G-CSF]的构建
使用ALT56(SEQ ID NO：21)和ALT57(SEQ ID NO：22)这对引物通过PCR从IHS1380-97652343载体(Open biosystems)中扩增粒细胞集落刺激因子(G-CSF)基因。用BamHI和NotI双酶切扩增的核酸，并限制性位点BamHI/NotI处将扩增的核酸克隆至pSNATNST中，从而得到重组表达载体，称作T602ST(SEQ ID NO：6)。
4.粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶三变体融合(T602ST)的表达
用与实施例1-3相同的方式确定粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶三变体融合(T602ST)在中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中的表达。
5.粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶三变体融合(T602ST)的纯化
用与实施例1-4相同的方式纯化粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶三变体融合(T602ST)。
实施例7：毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T304：毒蜥外泌肽-4/α1AT(P357N)]的制备
1.表达载体pSCAT的构建
构建pSCAT载体，用于融合于α-1抗胰蛋白酶的N-末端的毒蜥外泌肽-4的表达。详细地，使用ALT21(SEQ ID NO：8)和ALT5(SEQ ID NO：23)这对引物通过PCR从hMU001448载体(KRIBB)中扩增α-1抗胰蛋白酶，毒蜥外泌肽-4将融合于所述α-1抗胰蛋白酶的N-末端。用两种限制性内切酶XhoI和NotI酶切扩增的核酸，并将扩增的核酸克隆至pSGHV0(GenBank Accession No.AF285183)中，从而得到重组载体，称作pSCAT。
2.表达载体pSCATN的构建
构建pSCATN，用于融合于失活的α-1抗胰蛋白酶单变体的N-末端的毒蜥外泌肽-4的表达。就这点而言，从载体pDHT3N得到编码α-1抗胰蛋白酶单变体的基因，并用两种限制性内切酶EcoRV和NotI将所述基因克隆至pSCAT中，从而得到重组载体，称作pSCATN。毒蜥外泌肽-4融合将融合于所述α-1抗胰蛋白酶单变体的N-末端。
3.毒蜥外泌肽-4的制备
使用DH15(有义密码子，SEQ ID NO：24)和DH16(反义密码子，SEQ ID NO：25)通过PCR扩增毒蜥外泌肽-4基因。
4.毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶单变体[T304，毒蜥外泌肽-4/α1AT(P357N)]的构建
使用ALT44(SEQ ID NO：26)和ALT41(SEQ ID NO：27)这对引物通过PCR从实施例7-3制备的基因中扩增毒蜥外泌肽-4基因。用XhoI和BamHI双酶切该扩增的核酸，并在限制性位点XhoI/BamHI处将所述扩增的核酸克隆至pSCATN中，从而产生毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶单变体载体(T304，SEQ ID NO：7)。
5.毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶单变体融合(T304)的表达
用与实施例1-3相同的方式确定毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶变体融合(T304)在中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中的表达。
6.毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶单变体融合(T304)的纯化
用与实施例1-4相同的方式纯化毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶单变体融合(T304)。
测试实例1：融合蛋白质或融合肽的酶免疫分析
如下所述，进行酶免疫分析来分析本发明的融合蛋白质或融合肽。
1.人生长激素(hGH)、人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]、人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]和人生长激素/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T109T：α1AT(P357N，S359T)/hGH]的酶免疫分析
在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中将抗-人生长激素单克隆抗体(Medix Biochemica，芬兰)稀释至浓度为1μg/mL至5μg/mL，以100μL/孔的量将稀释液等分到96-孔板(Nunc，丹麦)上，在室温下孵育15小时至18小时。除去仍然悬浮的抗体之后，以250μL/孔的量加入含有1％牛血清白蛋白的PBS，在室温下孵育2小时。用洗涤缓冲液(0.05％吐温20，PBS)洗涤该板三次并将溶液吸出。用含有1％牛血清白蛋白的PBS稀释样本，并将该样本加入96-孔板，接着室温孵育2小时。用洗涤缓冲液洗涤96-孔板五次，并向96-孔板 的每个孔加入100μL人生长激素单克隆抗体-生物素的结合物，然后在室温孵育2小时，所述结合物用磺酸基-NHS-生物素(Pierce生物技术，美国)制备。用洗涤缓冲液洗涤该板五次，并在室温用streptabidin-HRP孵育30分钟。再用洗涤缓冲液洗涤板五次，并在暗处使该板的每孔与100μLTMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)和过氧化氢的混合物反应30分钟。向每孔加入100μL 1M硫酸以终止反应，然后在VersaMax酶标仪(Molecular Device，美国)上检测450nm处的吸光率。绘制参考物质的标准曲线后，通过回归分析计算每个样本的值。
2.人干扰素α(IFN-α)、人干扰素α/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T502：α1AT(P357N)/IFN-α]的酶免疫分析
人干扰素α(IFN-α)和人干扰素α(IFN-α)/α-1抗胰蛋白酶单变体融合的酶免疫分析用人IFN-α匹配的ELISA抗体对(bender Medsystems，奥地利)进行。使IFN-α抗体(10μg/ml)附着于96-孔板，并像测试实例1-1中描述的那样将其封闭。样本的稀释液与抗体在室温下震荡反应2小时。以50uL/孔的量加入抗-IFN-α-HRP结合物，使其与抗体在室温下震荡反应2小时。用与测试实例1-1相同的方式进行随后的步骤。
3.粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T602S：α1AT(P357N，C232S)/G-CSF]、粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶三变体融合[T602ST：α1AT(P357N，C232S，S359T)/G-CSF]的酶免疫分析
除了将抗-粒细胞集落刺激因子(G-CSF)单克隆抗体(RND systems，美国)(而不是抗-人生长激素抗体)稀释至浓度为1μg/mL至5μg/mL，和使用粒细胞集落刺激因子多克隆抗体-生物素结合物(RND systems，美国)(而不是人生长激素单克隆抗体-生物素结合物)之外，重复与测试实例1相同的步骤。
4.毒蜥外泌肽-4、毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T304：毒蜥外泌肽-4/α1AT(P357N)]的酶免疫分析
除了用PBS将抗-毒蜥外泌肽-4多克隆抗体(Peptron，韩国)(而不是抗- 人生长激素抗体)稀释至浓度为5μg/mL至10μg/mL，和使用毒蜥外泌肽-4单克隆抗体-生物素结合物(而不是人生长激素单克隆抗体-生物素结合物)之外，重复与测试实例1-1相同的步骤。
对于实施例7中制备的毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶单变体融合(T304)而言，将其与Freund佐剂(Sigma，美国)混合后注射入大鼠以产生抗血清。使用蛋白质G-琼脂糖(GE Healthcare，美国)纯化抗体。用PBS将纯化的抗体稀释至浓度为10μL/mL至20μL/mL，并用所述抗体包被96-孔板，使其与毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶单变体融合(T304)多克隆抗体-生物素结合物反应，所述结合物以与测试实例1-1类似的方式用磺基-NHS-生物素结合物(Pierce生物技术，美国)制备。在震荡的同时进行样本和结合物的反应。
测试实例2：融合蛋白质或融合肽的药代动力学分析
为了监测融合蛋白质和融合肽的药代动力学，本发明进行下列试验。
1.人生长激素(hGH)、人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]、人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]、人生长激素/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T109T：α1AT(P357N，S359T)/hGH]的药代动力学
Sprague-Dawley大鼠用作实验动物，将人生长激素给药于三只Sprague-Dawley大鼠，同时指定五只大鼠用于每个融合-给药组。以720μg/kg的剂量将在实施例1至实施例3中制备的所有人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]、人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]和人生长激素/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T109T：α1AT(P357N，S359T)/hGH]皮下注射入各组Sprague-Dawley大鼠。注射之前用PBS稀释样本。在注射后0小时、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、24小时、30小时和48小时采集血样，并离心，从而获得血清。作为对照，以200μg/kg的剂量皮下注射Scitropin(SciGen，新加坡；一种人生长激素)。使用PBS作为稀释液。在注射后0小时、0.33小时、1小时、2小时、5小时、8小时、12小时、18小时、24小时、30小时和48小时采集血样，并离心，从而获得血清。用与测试实例1的酶免疫分析相同的方式分析 每个样本。
在图1中绘制了人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]、人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]和人生长激素/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T109T：α1AT(P357N，S359T)/hGH]的药代动力学曲线。
如图1所示，人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]的血清半衰期(t1/2)为5.3小时，且达到血清浓度峰值的时间(Tmax)为8小时，人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]的血清半衰期(t 1/2)为5.4小时且Tmax为12小时，以及人生长激素/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T109T：α1AT(P357N，S359T)/hGH]的血清半衰期(t1/2)为4.9小时且Tmax为12.8小时。另一方面，人生长激素(hGH)的血清半衰期(t1/2)为0.8小时，Tmax为1小时。因此，观察到所有人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]、人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]和人生长激素/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T109T：α1AT(P357N，S359T)/hGH]的体内稳定性均显著增加，超过人生长激素的体内稳定性。
2.人干扰素α(IFN-α)、人干扰素α/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T502：α1AT(P357N)/IFN-α]的药代动力学
Sprague-Dawley大鼠用作实验动物，指定五只大鼠用于每个测试组。以200μg/kg的剂量将实施例4中制备的人干扰素α/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T502：α1AT(P357N)/IFN-α]皮下注射入一个测试组的Sprague-Dawley大鼠，0小时、0.33小时、1小时、2小时、5小时、8小时、12小时、18小时、24小时、30小时、48小时、72小时和96小时后采集血样，并离心，从而获得血清。作为对照，以60μg/kg的剂量将人干扰素α(IFN-α，Intermaxα，LG生命科学，韩国)皮下注射入大鼠，0小时、0.33小时、1小时、2小时、5小时、8小时、12小时、18小时和24小时后采集血样并离心，从而获得血清。用与测试实例1的酶免疫分析相同的方式分析每个样本。
图2表示人干扰素α/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T502：α1AT(P357N)/IFN-α]的药代动力学曲线。
如图2所示，人干扰素α/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T502： α1AT(P357N)/IFN-α]的血清半衰期(t1/2)为18.5小时且Tmax为12小时，而人干扰素α的血清半衰期(t1/2)为3.4小时，Tmax为1.4小时。因此，与人干扰素α相比，本发明的人干扰素α/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T502：α1AT(P357N)/IFN-α]的体内稳定性显著增加。
3.粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T602S：α1AT(P357N，C232S)/G-CSF]、粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶三变体融合[T602ST：α1AT(P357N，C232S，S359T)/G-CSF]的药代动力学
Sprague-Dawley大鼠用作实验动物，将粒细胞集落刺激因子给药于三只Sprague-Dawley大鼠，同时指定五只大鼠用于每个融合-给药组。以340μg/kg的剂量将实施例5至实施例6中制备的所有粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T602S：α1AT(P357N，C232S)/G-CSF]、粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶三变体融合[T602ST：α1AT(P357N，C232S，S359T)/G-CSF]皮下注射入各组Sprague-Dawley大鼠。在注射后0小时、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、24小时、30小时和48小时采集血样，并离心，从而获得血清。作为对照，以100μg/kg的剂量皮下注射非格司亭(Gracin，Jeil制药有限公司，韩国，一种商售的粒细胞集落刺激因子)。在注射后0小时、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、18小时、24小时、30小时和48小时采集血样，并离心，从而获得血清。用与测试实例1的酶免疫分析相同的方式分析每个样本。
图3描绘了粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T602S：α1AT(P357N，C232S)/G-CSF]和粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶三变体融合[T602ST：α1AT(P357N，C232S，S359T)/G-CSF]的药代动力学曲线。
如图3中所示，粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T602S：α1AT(P357N，C232S)/G-CSF]的血清半衰期(t1/2)为5.1小时且Tmax为13.6小时，粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶三变体融合[T602ST：α1AT(P357N，C232S，S359T)/G-CSF]的血清半衰期(t1/2)为4.5小时且Tmax为16小时。另一方面，在用粒细胞集落刺激因子给药的组中检测到血清半衰期(t1/2)为1.8小时，Tmax为1.8小时。因此，发现与粒细胞集落刺激因子相比，粒细胞集落刺 激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T602S：α1AT(P357N，C232S)/G-CSF]和粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶三变体融合[T602ST：α1AT(P357N，C232S，S359T)/G-CSF]的体内稳定性显著增加。
4.毒蜥外泌肽-4、毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T304：毒蜥外泌肽-4/α1AT(P357N)]的药代动力学
Sprague-Dawley大鼠用作实验动物，指定五只大鼠用于每个测试组。以520μg/kg的剂量将实施例7中制备的毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T304：毒蜥外泌肽-4/α1AT(P357N)]皮下注射入每个测试组的Sprague-Dawley大鼠。在注射后0小时、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、24小时、30小时、48小时和72小时采集血样，并离心，从而获得血清。作为对照，以40μg/kg的剂量将毒蜥外泌肽-4皮下注射入大鼠。在注射后0分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、60分钟、120分钟、180分钟、240分钟、300分钟和360分钟采集血样到肝素管中，并离心，从而获得血清。用与测试实例1的酶免疫分析相同的方式分析每个样本。
图4描绘了毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T304：毒蜥外泌肽-4/α1AT(P357N)]的药代动力学曲线。
如图4中所示，毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T304：毒蜥外泌肽-4/α1AT(P357N)]的血清半衰期(t1/2)为19.1小时且Tmax为10.4小时，而毒蜥外泌肽-4的血清半衰期(t1/2)为0.8小时，Tmax为0.4小时。因此，与毒蜥外泌肽-4相比，毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T304：毒蜥外泌肽-4/α1AT(P357N)]的体内稳定性显著增加。
测试实例3：融合蛋白质或融合肽的体内活性的测定
为了检测根据本发明的融合蛋白质或融合肽的体内活性，本发明进行下列试验。
1.人生长激素(hGH)、人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]的体内活性
脑下垂体去除的Sprague-Dawley大鼠用作实验动物，将其分为三组，每 组七只。每天以每只大鼠18μg和5μg的剂量分别将实施例2中制备的人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]和人生长激素(Eutropin，LG生物科学有限公司，韩国)皮下注射入垂体切除的Sprague-Dawley大鼠。用PBS作为对照。注射后每天对大鼠进行称重。
图5表示人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]的体内活性的分析结果(脑下垂体去除大鼠中的体重变化)。
如图5所示，当用PBS给药时，脑下垂体去除大鼠的体重几乎没有增加，而在用人生长激素和人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]给药的脑下垂体去除大鼠中，在第七天分别观察到约10.2％和9.4％的体重增加。因此，发现本发明的人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]在脑下垂体去除大鼠中保持有效的体内活性，如同人生长激素一样。
2.粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T602S：α1AT(P357N，C232S)/G-CSF]和粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶三变体融合[T602ST：α1AT(P357N，C232S，S359T)/G-CSF]的体内活性
Sprague-Dawley大鼠用作实验动物，将其分为五组，每组五只。以340μg/kg和1,700ug/kg的剂量将实施例5中制备的粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T602S：α1AT(P357N，C232S)/G-CSF]皮下注射入Sprague-Dawley大鼠。以1,700μg/kg和100μg/kg的剂量分别将实施例6中制备的粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶三变体融合[T602ST：α1AT(P357N，C232S，S359T)/G-CSF]和粒细胞集落刺激因子非格司亭(Gracin，Jeil制药有限公司，韩国)皮下注射入另一组大鼠。试验前3天从尾部采集血样，在注射后的第1天、第2天、第3天、第4天和第5天采集血样，并使用血液分析器(Pentra 120)对白细胞计数。
图6表示粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T602S：α1AT(P357N，C232S)/G-CSF]和粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶三变体融合[T602ST：α1AT(P357N，C232S，S359T)/G-CSF]的体内活性的分析结果(白细 胞水平的变化)。
如图6所示，在用粒细胞集落刺激因子非格司亭给药的组中观察到白细胞数量在第一天达到峰值水平，然后从第2天起降低至基线，在用340μg/kg剂量的粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T602S：α1AT(P357N，C232S)/G-CSF]给药的组中，白细胞数量在第二天达到峰值水平，然后从第三天起降低。在用1,700μg/kg剂量的粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T602S：α1AT(P357N，C232S)/G-CSF]和粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶三变体融合[T602ST：α1AT(P357N，C232S，S359T)/G-CSF]分别给药的组中，白细胞数量保持较高直到第3天，在第4天开始降低。因此，发现粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T602S：α1AT(P357N，C232S)/G-CSF]和粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶三变体融合[T602ST：α1AT(P357N，C232S，S359T)/G-CSF]的体内活性延长，超过粒细胞集落刺激因子的体内活性。
3.毒蜥外泌肽-4和毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T304：毒蜥外泌肽-4/α1AT(P357N)]的体内活性
为了检测本发明的毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T304：毒蜥外泌肽-4/α1AT(P357N)]的体内活性，如下所述，在糖尿病小鼠模型中进行腹膜内葡萄糖耐量测试和血糖降低测试。
3-1.腹膜内葡萄糖耐量测试
用高脂肪的饲料喂养八周大的C57BL/6小鼠四周，以诱导所述小鼠肥胖。使所述小鼠挨饿15小时后，进行腹膜内葡萄糖耐量测试。就这点而言，以10nmol/kg的剂量将实施例7中制备的毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T304：毒蜥外泌肽-4/α1AT(P357N)]和毒蜥外泌肽-4腹膜内注射入各组小鼠一次，30分钟、12小时和24小时之后，以1.5g/5mL/kg的剂量将葡萄糖腹膜内注射入所述小鼠。在注射葡萄糖后0分钟、10分钟、20分钟、30分钟、60分钟、90分钟和120分钟使用葡萄糖计(Allmedicus，韩国)检测小鼠的血糖水平。
图7显示毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T304：毒蜥外泌肽 -4/α1AT(P357N)]的腹膜内葡萄糖耐量测试的结果。
如图7中所示，与用毒蜥外泌肽-4给药的组相比，用毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T304：毒蜥外泌肽-4/α1AT(P357N)]给药的组保持低葡萄糖水平持续一段较长的时间段。
3-2.糖尿病小鼠模型中的血糖降低
9周大的db/db小鼠用作实验动物，将其分为三组，每组六只。使db/db小鼠自由地接近饲料，以100nmol/kg的剂量将实施例7中制备的毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T304：毒蜥外泌肽-4/α1AT(P357N)]或毒蜥外泌肽-4皮下注射入所述db/db小鼠，0小时、1小时、3小时、6小时、24小时、43小时、48小时和52小时后，使用葡萄糖计(Allmedicus，韩国)检测血糖浓度。
图8表示毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T304：毒蜥外泌肽-4/α1AT(P357N)]对糖尿病小鼠模型的影响。
如图8所示，从注射后24小时起，毒蜥外泌肽-4-给药组的血糖水平与对照相似，而毒蜥外泌肽-4/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T304：毒蜥外泌肽-4/α1AT(P357N)]给药组保持了较低的血糖水平，这说明融合蛋白质的活性延长了。
测试实例4：融合蛋白质或融合肽的体外活性
为了检测本发明的融合蛋白质或融合肽的体外活性，本发明进行下列试验。
1.人生长激素(hGH)、人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]、人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]、人生长激素/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T109T：α1AT(P357N，S359T)/hGH]的体外活性
在37℃，5％CO2的条件下，将大鼠淋巴瘤细胞系(NB2细胞)保存在补充有10％HS(马血清)、10％FBS、2-巯基乙醇和抗生素的RPMI1640中。试验前，NB2细胞在补充有10％HS的RPMI 1640中培养24小时。此后，用 1x DPBS(Dulbecco′s磷酸盐缓冲盐水)洗涤NB2细胞一次，并以5％HS补充的RPMI 1640中2×104个细胞/100μL/孔的密度将NB2细胞接种到96-孔板(Corning，美国)中，最终体积为100μL。以20μL的量将一系列浓度的样本加入96-孔板的每个孔中，然后在5％CO2的条件下，于37℃培养48小时。接着，将20μL MTS溶液(Promega，美国)加入96-孔板的每个孔中，并使之在5％CO2的条件下于37℃反应3小时。将20μL 10％SDS(十二烷基磺酸钠)加入每个孔中终止反应。使用VersaMax酶标仪(Molecular Device，美国)检测490nm处的吸光率。在使用MTS方法测得的吸光率的基础上确定药物的EC50(50％有效浓度)值，即，50％细胞存活的浓度。
表1和图9分别总结和描绘了人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]、人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]、人生长激素/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T109T：α1AT(P357N，S359T)/hGH]的体外活性的分析结果。
表1
如表1和图9的数据所示，人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]、人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]、人生长激素/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T109T：α1AT(P357N，S359T)/hGH]在EC50值上没有显著差异。因此，不考虑α-1抗胰蛋白酶的氨基酸突变，人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]、人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]和人生长激素/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T109T：α1AT(P357N，S359T)/hGH]表现出相对稳定的体外活性(EC50)。
2.粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶 双变体融合[T602S：α1AT(P357N，C232S)/G-CSF]和粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶三变体融合[T602ST：α1AT(P357N，C232S，S359T)/G-CSF]的体外活性
在37℃，5％CO2的条件下，在补充有10％FBS、小鼠IL-3和抗生素的RPMI 1640中培养鼠成髓细胞NFS-60。用与测试实例4-1相同的方式检测在490nm处细胞的吸光率。在使用MTS方法测得的吸光率的基础上，确定药物的EC50(50％有效浓度)值，即，50％细胞存活的浓度。
表2和图10显示粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T602S：α1AT(P357N，C232S)/G-CSF]和粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶三变体融合[T602ST：α1AT(P357N，C232S，S359T)/G-CSF]的体外活性的分析结果。
表2
如表2和图10所示，粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T602S：α1AT(P357N，C232S)/G-CSF]和粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶三变体融合[T602ST：α1AT(P357N，C232S，S359T)/G-CSF]在EC50上没有显著差异。因此，不考虑α-1抗胰蛋白酶的氨基酸突变，粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T602S：α1AT(P357N，C232S)/G-CSF]和粒细胞集落刺激因子/α-1抗胰蛋白酶三变体融合[T602ST：α1AT(P357N，C232S，S359T)/G-CSF]表现出相对稳定的体外活性(EC50)。
测试实例5：融合蛋白质或融合肽对胰蛋白酶的抑制活性的测定
为了检测人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]和人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]对胰蛋白酶的抑制活性，本发明进行以下试验。
将实施例1中制备的人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH] 和实施例1中制备的人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]分别与胰蛋白酶混合。使用的胰蛋白酶和所述人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]以及所述人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]的浓度分别为10nM。混合物在室温下培养1小时后，将其与0.2mM底物N-苯甲酰基-Val-Gly-Arg对硝基苯胺盐酸盐(Sigma，美国)反应，然后检测405nm处的吸光率。将胰蛋白酶单位设定为引起0.001的吸光率变化的底物浓度且酶活性表示为单位/mg胰蛋白酶。胰蛋白酶用作对照以作比较。
结果在图11中描述。
如图11所示，对于人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]来说，胰蛋白酶和α-1抗胰蛋白酶之间的Ka(平衡结合常数)计算为约7.5×108M-1，对于人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]来说，Ka计算为约8.0×106M-1。人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]对胰蛋白酶表现出极好的抑制活性，而人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]并不是很好的胰蛋白酶抑制剂。因此，人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]和人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]通过持续循环增加体内半衰期的事实不依赖于α-1抗胰蛋白酶的固有性质。
测试实例6：融合蛋白质或融合肽对人中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制活性的测定
为了检测人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]和人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]对人中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制活性，本发明进行以下试验。
将实施例1中制备的人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]和实施例1中制备的人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]分别与人中性粒细胞弹性蛋白酶混合。使用浓度为40nM的弹性蛋白酶和所述人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]以及所述人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]。混 合物在室温下培养1小时后，使其与1mM底物MeOSuc-AAPV-pNA(Santa Cruz生物技术公司，美国)反应，然后检测405nm处的吸光率。将人中性粒细胞弹性蛋白酶单位设定为引起0.001的吸光率变化的底物浓度且酶活性表示为单位/mg弹性蛋白酶。
结果在图12中描述。
如图12中所示，观察到人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]抑制几乎100％的人中性粒细胞弹性蛋白酶，而人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]的Ka为约1.4×107M-1。因此，人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]用作极好的人中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制剂，而人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]对人中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制活性低。所以，人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]和人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]通过持续循环增加体内半衰期的事实不依赖于α-1抗胰蛋白酶的固有性质。
测试实例7：融合蛋白质或融合肽的电泳测定
为了检测由糖基化作用位点的添加引起的分子量变化，对人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]、人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]和人生长激素/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T109T：α1AT(P357N，S359T)/hGH]进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
结果在图13中显示。
如图13中所示，与没有生成额外的糖基化作用位点的天然人生长激素/α-1抗胰蛋白酶融合[T109wt：α1AT/hGH]相比，含有额外的糖基化作用位点(Asn-X-Ser)的人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]的蛋白染色条带迁移到分子量较高的位置。至于人生长激素/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T109T：α1AT(P357N，S359T)/hGH]，它在357位含有更大程度的额外的糖基化(Asn-X-Thr)作用，其增加的分子量更加明显。因此，由于糖基化作用位点的引入，人生长激素/α-1抗胰蛋白酶单变体融合[T109：α1AT(P357N)/hGH]和人生长激素/α-1抗胰蛋白酶双变体融合[T109T： α1AT(P357N，S359T)/hGH]的分子量增加。
工业用途
与生理活性蛋白质或生理活性肽自身相比，以持续循环的形式存在的本发明的融合蛋白质或融合肽的血清半衰期(T1/2)显著增加并表现出极好的体内稳定性。因此，本发明的融合蛋白质或融合肽可应用于研制蛋白质或肽类药物的持续循环剂型。
α1AT(P357N，S359T)/hGH]的分子量增加。
工业用途
与生理活性蛋白质或生理活性肽自身相比，以持续循环的形式存在的本发明的融合蛋白质或融合肽的血清半衰期(T1/2)显著增加并表现出极好的体内稳定性。因此，本发明的融合蛋白质或融合肽可应用于研制蛋白质或肽类药物的持续循环剂型。
库列表
<110>阿特根公司
<120>通过体内持续释放维持的体内半衰期增加的融合蛋白质或融合肽以及使用所述融合蛋白质或融合肽增加体内半衰期的方法
<130>P10-08083
<150>KR10-2009-0035190
<151>2009-04-22
<160>27
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>590
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>T109wt(α-1AT/hGH)
<400>1
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His
15 10 15
Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu
20 25 30
Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr
35 40 45
Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe
85 90 95
Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu
100 105 110
Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp
115 120 125
Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr
130 135 140
Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr
145 150 155 160
Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu
165 170 175
Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Typ Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Glr Glu Glu Glu Asp Phe
195 200 205
His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu
210 215 220
Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Ttp Val Leu
225 230 235 240
Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
245 250 255
Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile
260 265 270
Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Seg Ser Ala Ser Leu His Leu
275 280 285
Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly
290 295 300
Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320
Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala
325 330 335
Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe
340 345 350
Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
355 360 365
Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Asp Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe
370 375 380
Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys Gly Gly Gly Gly Ser Phe
385 390 395 400
Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala
405 410 415
His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Gln Glu Phe Glu Glu
420 425 430
Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln
435 440 445
Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu
450 455 460
Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu
465 470 475 480
Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe
485 490 495
Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu
500 505 510
Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu
515 520 525
Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys
530 535 540
Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly
545 550 555 560
Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu
565 570 575
Arg Ile Val Gys Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
580 585 590
<210>2
<211>590
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>T109[α-1AT(P357N)/hGH]]
<400>2
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His
15 10 15
Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu
20 25 30
Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr
35 40 45
Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe
85 90 95
Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu
100 105 110
Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp
115 120 125
Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr
130 135 140
Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr
145 150 155 160
Val Glu Lys Gly Thr Gly Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu
165 170 175
Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe
195 200 205
His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu
210 215 220
Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
225 230 235 240
Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
245 250 255
Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile
260 265 270
Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu
275 280 285
Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly
290 295 300
Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320
Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala
325 330 335
Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe
340 345 350
Leu Glu Ala Ile Asn Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
355 360 365
Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Asp Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe
370 375 380
Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys Gly Gly Gly Gly Ser Phe
385 390 395 400
Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala
405 410 415
His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu
420 425 430
Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln
435 440 445
Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu
450 455 460
Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu
465 470 475 480
Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe
485 490 495
Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu
500 505 510
Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu
515 520 525
Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys
530 535 540
Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly
545 550 555 560
Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu
565 570 575
Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
580 585 590
<210>3
<211>590
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>T109T[α-1AT(P357N，S359T)/hGH]
<400>3
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His
15 10 15
Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu
20 25 30
Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr
35 40 45
Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe
85 90 95
Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu
100 105 110
Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp
115 120 125
Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr
130 135 140
Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr
145 150 155 160
Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu
165 170 175
Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe
195 200 205
His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu
210 215 220
Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
225 230 235 240
Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
245 250 255
Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile
260 265 270
Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu
275 280 285
Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly
290 295 300
Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320
Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala
325 330 335
Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe
340 345 350
Leu Glu Ala Ile Asn Met Thr Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
355 360 365
Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Asp Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe
370 375 380
Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys Gly Gly Gly Gly Ser Phe
385 390 395 400
Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala
405 410 415
His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu
420 425 430
Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln
435 440 445
Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu
450 455 460
Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu
465 470 475 480
Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe
485 490 495
Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu
500 505 510
Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu
515 520 525
Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys
530 535 540
Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly
545 550 555 560
Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu
565 570 575
Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
580 585 590
<210>4
<211>564
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>T502[α-1AT(P357N)/IFN-α]
<400>4
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His
1 5 10 15
Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu
20 25 30
Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr
35 40 45
Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe
85 90 95
Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu
100 105 110
Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp
115 120 125
Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr
130 135 140
Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr
145 150 155 160
Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu
165 170 175
Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe
195 200 205
His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu
210 215 220
Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
225 230 235 240
Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
245 250 255
Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile
260 265 270
Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu
275 280 285
Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly
290 295 300
Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320
Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala
325 330 335
Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe
340 345 350
Leu Glu Ala Ile Asn Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
355 360 365
Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Asp Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe
370 375 380
Met Gly Lys Val ValAsn Pro Thr Gln Lys Gly Gly Gly Gly Ser Cys
385 390 395 400
Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu
405 410 415
Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg
420 425 430
His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys
435 440 445
Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn
450 455 460
Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu
465 470 475 480
Asp Lys Phe Thr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala
485 490 495
Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu
500 505 510
Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr
515 520 525
Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala
530 535 540
Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu
545 550 555 560
Arg Ser Lys Glu
<210>5
<211>573
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>T602S[α-1AT(P357N，C232S)/G-CSF]
<400>5
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His
1 5 10 15
Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu
20 25 30
Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr
35 40 45
Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe
85 90 95
Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu
100 105 110
Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp
115 120 125
Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr
130 135 140
Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr
145 150 155 160
Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu
165 170 175
Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Typ Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe
195 200 205
His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu
210 215 220
Gly Met Phe Asn Ile Gln His Ser Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
225 230 235 240
Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
245 250 255
Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile
260 265 270
Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu
275 280 285
Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly
290 295 300
Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320
Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala
325 330 335
Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe
340 345 350
Leu Glu Ala Ile Asn Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
355 360 365
Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Asp Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe
370 375 380
Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys Gly Gly Gly Gly Ser Thr
385 390 395 400
Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys
405 410 415
Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu
420 425 430
Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu
435 440 445
Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro
450 455 460
Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly
465 470 475 480
Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro
485 490 495
Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe
500 505 510
Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala
515 520 525
Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln
530 535 540
Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu
545 550 555 560
Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
565 570
<210>6
<211>573
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>T602ST[α-1AT(P357N，C232S，S359T)/G-CSF]
<400>6
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His
1 5 10 15
Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu
20 25 30
Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr
35 40 45
Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe
85 90 95
Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu
100 105 110
Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp
115 120 125
Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr
130 135 140
Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr
145 150 155 160
Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu
165 170 175
Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Typ Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe
195 200 205
His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu
210 215 220
Gly Met Phe Asn Ile Gln His Ser Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
225 230 235 240
Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
245 250 255
Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile
260 265 270
Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu
275 280 285
Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Tyr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly
290 295 300
Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320
Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala
325 330 335
Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe
340 345 350
Leu Glu Ala Ile Asn Met Thr Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
355 360 365
Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Asp Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe
370 375 380
Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys Gly Gly Gly Gly Ser Thr
385 390 395 400
Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys
405 410 415
Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu
420 425 430
Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu
435 440 445
Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro
450 455 460
Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly
465 470 475 480
Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro
485 490 495
Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe
500 505 510
Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala
515 520 525
Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln
530 535 540
Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu
545 550 555 560
Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
565 570
<210>7
<211>433
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>T304[毒蜥外泌肽-4/α-1AT(P357N)]
<400>7
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln
35 40 45
Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys
50 55 60
ILe Thr Pro Asn Leu Ala Glu Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu
65 70 75 80
Ala His Gln Ser Asn Ser Thr Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile
85 90 95
Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His
100 105 110
Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu
115 120 125
Ala Gln Ile His Glu Gly Phe Gln Glu Leu Leu His Thr Leu Asn Gln
130 135 140
Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser
145 150 155 160
Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu
165 170 175
Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala
180 185 190
Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile
195 200 205
Val Asp Leu Val Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val
210 215 220
Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys
225 230 235 240
Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys
245 250 255
Val Pro Met Met Lys Arg Leu Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys
260 265 270
Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr
275 280 285
Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn
290 295 300
Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg
305 310 315 320
Arg Ser Ala Ser Leu His Leu Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr
325 330 335
Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser
340 345 350
Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu
355 360 365
Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr
370 375 380
Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Asn Met Ser Ile Pro
385 390 395 400
Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Asp Gln
405 410 415
Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln
420 425 430
Lys
<210>8
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物(ALT21)
<400>8
ccctcctcga gaatgccgtc ttctgtctcg 30
<210>9
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物(ALT30)
<400>9
gggcccggat cctcctcctc ctttttgggt gggatt36
<210>10
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物(DH22)
<400>10
ggatccttcc caaccattcc cttatc 26
<210>11
<211>30
<2l2>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物(ALT12)
<400>11
gggggcggcc gcctagaagc cacagctgcc 30
<210>12
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物(ALT1)
<400>12
ccatgttttt agaggccata aacatgtcta tccccccc 38
<210>13
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物(ALT2)
<400>13
gggggggata gacatgttta tggcctctaa aaacatgg 38
<210>14
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物(ALT14)
<400>14
gggcccctcg aggaagatcc ccagggagat gc 32
<210>15
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物(ALT82)
<400>15
actatccccc ccgaggtcaa gttcaacaaa ccc 33
<210>16
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物(ALT83)
<400>16
catgtttatg gcctctaaaa acatggc 27
<210>17
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物(ALT45)
<400>17
gggcccggat cctgtgatct gcctcaaacc 30
<210>18
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物(ALT49)
<400>18
gcgggcggcc gctcattcct tacttcttaa 30
<210>19
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物(ALT52)
<400>19
gcatgtttaa catccagcac tctaagaagc tgtccagc 38
<210>20
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物(ALT53)
<400>20
gctggacagc ttcttagagt gctggatgtt aaacatgc 38
<210>21
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物(ALT56)
<400>21
gggcccggat ccacccccct gggccctgcc 30
<210>22
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物(ALT57)
<400>22
gcgggcggcc gctcagggct gggcaaggtg 30
<210>23
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物(ALT5)
<400>23
gggcccgcgg ccgcagttat ttttgggtgg g 31
<210>24
<211>145
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物(DH15)
<400>24
ggatccgacg atgacgataa gcatggcgaa ggaacattca ccagcgactt gtcaaaacag 60
atggaagagg aggcagtgcg gttatttatt gagtggctta agaacggcgg accaagtagc 120
ggggcacctc cgccatctgc tagca 145
<210>25
<211>145
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物(DH16)
<400>25
gctagcagat ggcggaggtg ccccgctact tggtccgccg ttcttaagcc actcaataaa 60
taaccgcact gcctcctctt ccatctgttt tgacaagtcg ctggtgaatg ttccttcgcc 120
atgcttatcg tcatcgtcgg atcca 145
<210>26
<211>108
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物(ALT44)
<400>26
gggcccctcg agatggctac aggctcccgg acgtccctgc tcctggcttt tggcctgctc 60
tgcctgccct ggcttcaaga gggcagtgcc catggcgaag gaacattc 108
<210>27
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物(ALT41)
<400>27
ggggggatcc tcagatggcg gaggtgcccc 30
机译： 通过体内持续释放来维持体内半衰期增加的蛋白质或融合肽，以及使用该蛋白质或融合肽增加体内半衰期的方法。
机译： 体内半衰期增加了通过持续体内释放而维持的融合蛋白或融合肽，以及使用该融合蛋白或肽增加体内半衰期的方法
机译： 体内半衰期增加，通过持续体内释放维持的融合蛋白或肽，以及使用该融合蛋白或肽增加体内半衰期的方法
