一种检测猪囊尾蚴、猪旋毛虫、猪弓形虫的试剂盒及应用

摘要

本发明提供一种检测猪囊尾蚴、猪旋毛虫、猪弓形虫的试剂盒，包含：无菌去离子水、PCR反应液、

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，尤其涉及一种检测猪囊尾蚴、猪旋毛虫、猪弓形虫3种食源性寄生虫的试剂盒，可以同时对单个或多个混合感染猪囊尾蚴、猪旋毛虫、猪弓形虫的标本进行鉴别检测。

背景技术

目前我国养宠物的人越来越多，人群流动性越来越大，生食海鲜、喜好野味的人也越来越多，各种动物源性疾病开始在非流行区播散，食源性寄生虫病已对公共卫生构成巨大的威胁。旋毛虫病是由旋毛虫(Trichinella spiralis)成虫寄生于哺乳动物肠道及其幼虫寄生于肌肉组织而引起的疾病，是一种严重危害公共卫生安全的人畜共患病。旋毛虫可以感染大多数哺乳动物，家畜中除猫和犬等肉食动物之外，猪患病率最高，但患病猪往往没有临床症状，人因生食入半熟或生的含有旋毛虫的猪肉而感染，常导致出现胃肠道症状、发热、水肿和血液嗜酸粒细胞增多，原因不明的常年肌肉酸痛，重者丧失劳动能力，甚至致人死亡。囊尾蚴病是由猪带绦虫(Taenia sodium)的幼虫囊尾蚴(Cysticercus)寄生在中间宿主而引起的一种重要的人畜共患寄生虫病，是我国重点防治的寄生虫病之一；猪囊尾蚴病不仅造成养猪业的巨大损失，而且也给人体的生命安全带来严重危害。弓形虫(Toxoplasma gondii)主要侵犯脑、眼、心、肝、淋巴结等，孕妇受染后病原通过胎盘感染胎儿，直接影响胎儿发育，致畸严重；据研究表明，婴儿出生时出现症状或发生畸形者病死率为12%，而存活中80%有精神发育障碍，50%有视力障碍，该病成为人类先天性感染中最严重的疾病之一。人类大多是通过食用生的或未经彻底加热的感染有这些寄生虫的肉食而感染这些疾病。因此，要控制这类寄生虫病的流行必须首先从源头抓起，控制食源性寄生虫病在畜禽中流行，把好屠宰检疫关。

目前，食品安全卫生问题非常严峻，但屠宰检疫技术却非常落后。一些在屠宰检疫中的必检项目如旋毛虫和囊尾蚴等的检测仅仅是依靠肉眼观察来诊断，极易造成漏检，严重影响肉品质量，同时也给消费者的健康构成巨大威胁。因此，对这些严重影响人类健康的疾病建立一种操作简单、快速、敏感、特异的检测方法势在必行。PCR方法是一种操作简单、敏感性高、特异性强的分子生物学检测方法，多重PCR方法除具有普通PCR的优点之外，还可以在一个反应体系中同时扩增两份或者多份DNA样本的不同目的基因片段，特别适合用于混合感染的大量临床样本的快速诊断。因此建立这三种食源性人畜共患寄生虫的PCR快速检测方法，可以为临床上这三种病的防治提供科学依据，而且对提高动物疫病的检测、监控水平，保障动物源性食品安全具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测猪囊尾蚴、猪旋毛虫、猪弓形虫的试剂盒，该试剂盒包含：无菌去离子水、PCR反应液、Taq DNA聚合酶、GoldView DNA染料、溴酚蓝上样缓冲液、标准品、对照品。  

其中：

标准品：猪囊尾蚴（T. solium）标准品的核苷酸序列如SEQ ID No：7，猪旋毛虫（T. spiralis）标准品的核苷酸序列如SEQ ID No：8，猪弓形虫（T. gondii）标准品的核苷酸序列如SEQ ID No：9，具体序列见序列表；

对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阳性对照为有猪囊尾蚴、猪旋毛虫和猪弓形虫DNA片段的DNA样品，阴性对照为无猪囊尾蚴、猪旋毛虫和猪弓形虫DNA的DNA样品；

PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、检测用引物，

其中检测用引物分别为检测3种寄生虫的上游引物和下游引物共6条（表1）：

本试剂盒保存于-20 ℃，尽量减少反复冻融。

本发明的另一个目的是提供所述试剂盒在检测猪囊尾蚴、猪旋毛虫、猪弓形虫三种食源性寄生虫中的应用。

本发明试剂盒使用方法：

每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。标准品用无菌去离子水稀释为60 ng/μl。

1. PCR反应管制备：总体积为25 μl，PCR反应液于冰上融化及制备PCR反应管。依次取PCR反应液21.87 μl，Taq DNA聚合酶0.13 μl，浓度60 ng/μl的样品DNA（待检测样本、标准品、阳性对照品、阴性对照品） 3 μl于PCR反应管中混合。用手指轻弹制备好的PCR反应管或用微量移液器吹打混匀，瞬时高速离心2 s。

2. 扩增检测：把PCR反应管置于PCR仪上，设置反应条件为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s、54.6 ℃退火45 s、72 ℃延伸90 s共 30个循环，72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。

3. 检测结果判定：将1 g琼脂糖溶于100 ml 的0.5×TBE电泳缓冲液中，然后加入5μl GoldView DNA染料，混匀后煮沸，倾倒凝胶板。凝胶冷却凝固后，将PCR产物5 μl与适量上样缓冲液混合，加入凝胶孔中进行电泳。电泳结束后取出凝胶置于紫外灯下观察、拍照。标准品孔和阳性对照孔均有目的条带而阴性对照孔无任何条带说明PCR反应检测成功。被检样本孔出现的电泳条带与标准品孔、阳性对照孔相应条带大小一致则判定为阳性，反之则为阴性。

本发明的优点是只需一个反应即可快速、准确地检测出被检标本中的猪囊尾蚴、猪旋毛虫、猪弓形虫DNA，也可用于猪囊尾蚴、猪旋毛虫、猪弓形虫感染的分子流行病学调查及疗效监测。本方法的模板DNA制备步骤简单费用低，仅仅在一个PCR反应管中即可同时检测三种寄生虫的DNA，尤其是用于大量样品的大规模检测时，操作简单，不仅省时省力而且节省了大量的试剂和耗材，提高了工作效率。本方法是建立在分子生物学基础上的一种敏感性高、特异性强的检测方法，可同时对单个或多个混合感染猪囊尾蚴、猪旋毛虫、猪弓形虫的标本进行鉴别检测，大大提高了检测准确率，降低了假阳性率。

附图说明

图1 三种寄生虫标准品的多重PCR产物电泳结果。

图2 三种寄生虫阳性样本的多重PCR检测结果。

图3 本发明对采集的部分标本检测结果。

具体实施方式

本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例一  

本发明试剂盒包含：无菌去离子水、PCR反应液、Taq DNA聚合酶、GoldView DNA染料、溴酚蓝上样缓冲液、标准品、对照品。  

其中，PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、检测用引物。

其中检测用引物分别为检测3种寄生虫的上游引物和下游引物共6条（表1）：

标准品序列为猪囊尾蚴（T. solium）具有SEQ ID No：7的核苷酸序列，猪旋毛虫（T. spiralis）具有SEQ ID No：8的核苷酸序列，猪弓形虫（T. gondii）具有SEQ ID No：9的核苷酸序列，具体序列见序列表。

对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阳性对照为有猪囊尾蚴、猪旋毛虫和猪弓形虫DNA片段的DNA样品，阴性对照为无猪囊尾蚴、猪旋毛虫和猪弓形虫DNA的DNA样品。

本试剂盒保存于-20 ℃，尽量减少反复冻融。

实施例二   猪囊尾蚴、猪旋毛虫、猪弓形虫的三种寄生虫标准品的多重PCR检测

1. 材料

Taq DNA聚合酶反应系统、pMD18-T克隆系统、通用基因组提取试剂盒（Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver. 3.0）、DNA分子量标准marker均购自宝生物工程（大连）有限公司，质粒小量抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒为杭州艾思进有限公司产品，氨苄青霉素等常用试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司，PCR仪为德国Biometra? T-gradient PCR仪。

2. 引物设计与合成（表2）

以上述虫种目的基因序列为模板，使用Primer Premier 5.0软件进行分析、设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

3. 检测标准品制备

分别取猪囊尾蚴、猪旋毛虫、猪弓形虫三种寄生虫的虫体，根据通用基因组提取试剂盒说明书提取基因组DNA作为模板，用相应虫体的标准品上下游引物在PCR仪上进行扩增，反应条件为95 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s、54.6 ℃退火45 s、72 ℃延伸90 s共 30个循环，72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。PCR产物经1%琼脂糖电泳确认条带大小正确之后切下目的条带进行凝胶回收。回收产物用克隆系统插入pMD18-T载体，并转化入大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基中培养，将阳性克隆送杭州华大基因研发中心进行测序验证。测序表明插入片段正确的相应凝胶回收产物用无菌去离子水调整为60 ng/μl即为标准品。

4. 结果

经测序表明，上述设计标准品完全与预期符合，猪囊尾蚴、猪旋毛虫、猪弓形虫三种标准品目的基因序列分别如序列表的SEQ ID No：7、8、9。PCR结果见图1：M，DNA分子量标准marker；1：三重PCR标准品条带；2-4：猪旋毛虫、猪囊尾蚴、猪弓形虫三个标准品各自的标准参考条带；5：阴性对照品。

实施例三   猪囊尾蚴、猪旋毛虫、猪弓形虫的三种寄生虫阳性样本的多重PCR检测

1. 标本DNA提取

分别采集4例经传统方法确诊的猪囊尾蚴、猪旋毛虫、猪弓形虫病猪膈肌标本9 克及2例无猪囊尾蚴、猪旋毛虫、猪弓形虫三种病原体的健康猪膈肌标本各9 克，按通用基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，用无菌去离子水调整DNA浓度为60 ng/μl。

2. 标本检测

取出PCR反应液于冰浴融化后取21.87 μl，加入DNA聚合酶0.13 μl，再加入待检标本DNA 3 μl即可。另外同时再设置3个PCR反应管，依次加入上述试剂，但DNA分别用标准品、阳性对照品、阴性对照品代替。制备好的PCR反应试剂管用微量移液器吹打混匀后瞬时高速离心2 s，置于PCR仪上后运行如下反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s、54.6 ℃退火45 s、72 ℃延伸90 s共 30个循环，72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。

3. 检测结果

检测结果见图2。S：标准品对照；P：阳性对照；N：阴性对照；1：猪旋毛虫阳性；2：猪弓形虫与猪旋毛虫均为阳性；3：猪囊尾蚴、猪旋毛虫、猪弓形虫均为阴性；4：猪囊尾蚴阳性；5：猪囊尾蚴、猪旋毛虫、猪弓形虫均为阴性；6：猪囊尾蚴、猪旋毛虫、猪弓形虫均为阳性。

实施例四  猪囊尾蚴、猪旋毛虫、猪弓形虫的检测试剂盒的应用

方法同实施例二，随机采集猪膈肌标本，提取DNA，PCR扩增，结果参见图3：最左边两泳道“+、-”分别为阳性对照和阴性对照；2泳道为旋毛虫与囊尾蚴均阳性，4泳道为弓形虫阳性，5与20泳道为囊尾蚴阳性，8泳道弓形虫、旋毛虫、囊尾蚴均为阳性，12泳道为弓形虫与囊尾蚴阳性，14与19泳道为弓形虫与旋毛虫阳性，17与23泳道为旋毛虫阳性；其余泳道均为阴性。

本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

<110>浙江大学

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<213>猪弓形虫（Toxoplasmagondii）

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