钙激活氯通道ANO1/TMEM16A在诊断和治疗前列腺癌中的用途

摘要

本发明公开了钙激活氯通道ANO1/TMEM16A在诊断和治疗前列腺癌中的用途。本发明首先通过体外实验发现，ANO1/TMEM16A与人前列腺癌密切相关，且随着癌症恶性度的增高，ANO1表达增高；进一步的体外实验发现，ANO1/TMEM16A可体外促进人前列腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。体内实验发现，抑制ANO1/TMEM16A的表达可有效抑制前列腺癌细胞的增殖，表明ANO1/TMEM16A在前列腺癌的发展过程中起到了重要的作用，可将ANO1/TMEM16A作为生物标志物，用于诊断或检测前列腺癌或用于前列腺癌的预后和治疗后预后的评估指标，还可将其制备成基因药物用于治疗人前列腺癌。

说明书

技术领域

本发明涉及钙激活氯通道ANO1/TMEM16A的新用途，尤其涉及钙激活氯通道ANO1/TMEM16A在制备诊断和治疗前列腺癌的试剂或药物中的用途，属于钙激活氯通道ANO1/TMEM16A的医药用途领域。

背景技术

钙激活氯通道广泛地存在于各种兴奋性和非兴奋性细胞上，在生理状态下发挥多种重要功能，如：调控细胞兴奋性、收缩、细胞周期、分泌以及细胞转移等等，它们对于维护组织内稳态起到了至关重要的作用。离子通道这些重要作用主要是通过控制通过细胞的离子流、调节细胞体积以及产生膜电位来实现的。

氯离子通道在控制细胞膜兴奋性、跨膜转运以及调节细胞体积的过程中起到了重要的作用。在细胞进行主动吸收、胞吐、增殖以及分化过程中，有效抵挡细胞体积变化、维持体积恒定及内稳态是细胞存活的必要条件。

前列腺癌或腺癌始发于腺上皮细胞，是男性最常见的恶性肿瘤之一。然而其发病机制至今尚未明确。证据表明，改变钙离子内稳态或使电压门控离子通道表达上调可导致一些细胞发生癌变。

ANO1/TMEM16A是细胞膜上的钙激活氯通道(其核苷酸序列为SEQ IDNo.1所示，所编码的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示)。ANO/TMEM16家族在哺乳动物中共有10个成员，它们分别是TMEM16A-TMEM16J(ANO1-ANO10)。ANO/TMEM16家族为8次跨膜通道，并且其N-端及C-端均位于胞内。编码ANO1通道的基因TMEM16A位于人类常染色体11q13。迄今为止，尚未有文献报道ANO1/TMEM16A是前列腺癌的生物标记物，可用于前列腺癌的诊断、预后和治疗后预后的评估指标。

发明内容

本发明的目的是提供钙激活氯通道ANO1/TMEM16A的一种新的医药用途。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明首先通过体外实验发现，ANO1/TMEM16A与人前列腺癌密切相关，且随着癌症恶性度的增高，ANO1表达增高；进一步的体外实验发现，ANO1/TMEM16A可体外促进人前列腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。体内实验发现，抑制ANO1/TMEM16A的表达可有效抑制前列腺癌细胞的增殖，说明ANO1/TMEM16A在前列腺癌的发展过程中起到了重要的作用。

通过本发明的这一系列实验，证明钙激活氯通道ANO1/TMEM16A至少可具有以下几方面的医药用途：

由于ANO1/TMEM16A与人前列腺癌密切相关，可将其作为生物标志物，用于诊断或检测前列腺癌，也即是说，可将ANO1/TMEM16A制备成检测或诊断前列腺癌的试剂，例如，可将ANO1/TMEM16A蛋白作为抗体制备成诊断或检测前列腺癌的试剂盒，或者是将ANO1/TMEM16A基因制备成基因芯片用于诊断或检测人前列腺癌。另外，由于随着癌症恶性度的增高，ANO1表达增高，可以将ANO1/TMEM16A用于前列腺癌的预后和治疗后预后的评估指标。

另外，本发明通过实验发现，抑制ANO1/TMEM16A的表达可有效抑制前列腺癌细胞的增殖，因此可将ANO1/TMEM16A制备成基因药物用于预防或治疗人前列腺癌。例如，可通过RNA干扰方法，制备得到抑制ANO1/TMEM16A表达的基因工程药物，这些方法都是本领域技术人员所习知。

具体的，本发明首先通过实验发现，在人前列腺癌细胞(PC-3)中，ANO1/TMEM16A的mRNA及蛋白表达水平均高于正常人前列腺上皮细胞(RWPE-1)。由此证明ANO1/TMEM16A与人前列腺癌密切相关；为了进一步研究ANO1/TMEM16A与人前列腺癌的相关性，本发明采用RNA干扰手段，检测当敲除人前列腺癌细胞PC-3中的ANO1/TMEM16A时，其对PC-3细胞体外增殖、迁移、侵袭能力及裸鼠体内成瘤的影响。实验结果发现，当将特异性靶向ANO1/TMEM16A的shRNA(shRNA3)体外转染人前列腺癌细胞PC-3时，发现敲除ANO1/TMEM16A后，PC-3细胞增殖能力减弱。由此表明ANO1/TMEM16A促进人前列腺癌细胞增殖。本发明通过细胞划痕实验以及利用Tranwell迁移小室分别检测特异性敲除ANO1/TMEM16A后对人前列腺癌细胞PC-3的迁移及侵袭能力的影响。根据实验结果可知，相对于转染Negative control shRNA组，转染ANO1 shRNA3后，PC-3细胞的迁移能力大大降低。即：ANO1/TMEM16A可促进癌细胞迁移。本发明通过细胞侵袭实验(利用Transwell小室)检测癌细胞侵袭能力。实验结果表明，相对于转染Negative control shRNA组，转染ANO1shRNA3后，PC-3细胞的侵袭能力降低。由此可见ANO1/TMEM16A亦可促进癌细胞的侵袭。由以上实验结果表明，ANO1/TMEM16A可体外促进人前列腺癌细胞PC-3的增殖、迁移及侵袭能力。

为了进一步观察ANO1/TMEM16A与人前列腺癌的关系，本发明在动物瘤体注射ANO1 shRNA进行了体内实验，体内结果表明，ANO1 shRNA可减慢裸鼠肿瘤(前列腺癌细胞移植瘤)的生长，此结果进一步证明ANO1/TMEM16A在前列腺癌的发展过程中起到了重要的作用。

附图说明

图1Real-time PCR及western检测ANO1/TMEM16A在人前列腺癌细胞中mRNA和蛋白水平的表达情况结果。

图2ANO1在正常人、前列腺增生病人和前列腺癌病人的前列腺组织中的表达结果；A为正常人前列腺组织，没有检测到ANO1表达；B为前列腺增生病人组织，同样没有ANO1表达；而C则为前列腺癌病人组织染色结果。

图3正常人前列腺上皮细胞(RWPE-1)以及两种前列腺癌细胞系(DU145和PC-3)的ANO1全细胞电流实验结果。

图43段靶向ANO1/TMEM16A的特异性shRNA(shRNA1-3)对ANO1/TMEM16A的抑制效率试验结果。

图5敲除人前列腺癌细胞(PC-3)中ANO1/TMEM16A对其体外增殖能力的影响试验结果。

图6细胞划痕实验检测特异性敲除ANO1/TMEM16A后对人前列腺癌细胞PC-3的迁移及侵袭能力影响的实验结果。

图7细胞侵袭实验(利用Transwell 小室)用于检测ANO1/TMEM16A对癌细胞侵袭能力应县的实验结果。

图8瘤体注射ANO1shRNA后的影响肿瘤增殖的实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实验例1ANO1/TMEM16A与人前列腺癌的相关性实验

首先通过Real-time PCR及western检测ANO1/TMEM16A在人前列腺癌细胞中mRNA和蛋白水平的表达情况。

为了检测ANO1/TMEM16A在人前列腺癌细胞中mRNA水平的表达情况，本实验分别提取正常人前列腺上皮细胞(RWPE-1)(购自ATCC公司)以及人前列腺癌细胞(PC-3以及DU145)(购自ATCC公司)的全细胞RNA(Trizol法)，然后应用逆转录试剂盒(Promega公司)将全细胞RNA逆转录为cDNA后，进而应用Premix Ex TaqTM II kit(日本TAKARA公司)进行Real-Time PCR实验的检测。Real-Time PCR实验采用20ul体系：95℃、30秒预变性；然后放大40个循环(95℃、5秒变性；60℃、34秒退火及延伸)。Real-Time PCR所需的引物分别为：ANO1/TMEM16A正向引物为：TCTGCTGGATGAAGTTTACGG；ANO1/TMEM16A反向引物为：AGGCGACATAGAAGATGGGAG；

β-actin正向引物为：TGTTACCAACTGGGACGAC；

β-actin反向引物为：GGTGTTGAAGGTCTCAAACAT.

为进一步检测ANO1/TMEM16A在人前列腺癌细胞中蛋白水平的表达情况，本实验采用western检测方法。首先分别提取正常人前列腺上皮细胞(RWPE-1)以及人前列腺癌细胞(PC-3以及DU145)的全细胞蛋白，继而用BCA蛋白定量方法(试剂购自美国Thermo公司)将各组细胞蛋白进行定量。进行western实验时，上样量为30ug。实验过程中ANO1/TMEM16A抗体(兔抗人ANO1/TMEM16A，购自英国Abcam公司)稀释倍数为1∶1000；β-actin抗体(羊抗人β-actin购自美国Santa Cruz公司)稀释倍数为1∶500；二抗均购自美国Santa Cruz公司，且稀释倍数为1∶5000。

实验结果见图1。实验结果表明：在人前列腺癌细胞PC-3(购自ATCC公司)中，ANO1/TMEM16A的mRNA及蛋白表达水平均高于正常人前列腺上皮细胞(RWPE-1)。由此证明ANO1/TMEM16A与人前列腺癌密切相关。

为进一步筛查ANO1在前列腺癌病人组织的表达情况，通过免疫组化的手段，分别检测了72例不同程度(TNM临床分期I到IV期)的前列腺癌病人、16例前列腺增生病人、以及5例正常人的前列腺组织中ANO1的表达情况。实验结果见图2。由结果可知在正常人及前列腺增生病人的前列腺组织中均没有检测到ANO1表达，而前列腺癌病人组织中则有不同程度的ANO1表达。

表1和表2分别是由免疫组化染色进行评分、分析后得到的统计结果。表1介绍了不同病人前列腺组织中ANO1表达情况。5例正常人组织中无一例检测到ANO1表达。16例前列腺增生病人中有2例检测到ANO1表达升高，阳性率为12.5％。而在检测的72例前列腺癌病人中，有65例病人检测到ANO1表达升高，阳性率达到90.3％。表2进一步根据TNM分期以及Gleason评分进行统计分析，发现随着TNM分期以及Gleason评分的升高(即随着前列腺癌恶性程度增高)，ANO1表达逐步增高。这就表明ANO1很可能成为前列腺癌的生物标记物。

表1

表2

接下来，本实验分别对正常人前列腺上皮细胞(RWPE-1)以及两种前列腺癌细胞系(DU145和PC-3)的ANO1全细胞电流。本实验分别记录了正常人前列腺上皮细胞(RWPE-1)以及两种前列腺癌细胞系(PC-3和DU145)。实验在室温下进行，所采用的电极内液配方为(mM)：140NMDG-Cl，7.4Ca2+-EGTA，2.6NMDG-EGTA，and 10NMDG-HEPES；电极外液配方为(mM)：140NMDG-Cl，5KCl，2CaCl2，1MgCl2，and 10 NMDG-HEPES。内外液pH值均为7.2。记录时采用HEKA公司的EPC10膜片钳放大器。记录时电极电阻保持在3-5MΩ。

实验结果见图3。由实验结果可知，PC-3细胞的ANO1电流约2.66nA，而正常人前列腺上皮细胞(RWPE-1)则只有约917.5pA，二者相差4.5倍左右，然而加了5uM DIDS后ANO1通道电流被抑制，重新灌流电极外液后电流恢复。从而证明在人前列腺癌细胞系PC-3中的ANO1表达多于正常人前列腺上皮细胞。

实验例2

为了进一步研究ANO1/TMEM16A与人前列腺癌的相关性，本实验采用RNA干扰手段，检测当敲除人前列腺癌细胞PC-3中的ANO1/TMEM16A时，其对PC-3细胞体外增殖、迁移、侵袭能力及裸鼠体内成瘤的影响。

首先，本实验制作了3段靶向ANO1/TMEM16A的特异性shRNA(分别命名为shRNA1-3)并检测其对ANO1/TMEM16A的抑制效率。

3段靶向ANO1/TMEM16A的特异性shRNA以及阴性对照shRNA由上海吉凯基因技术有限公司设计并合成。

所所设计的三段siRNA靶向人类ANO1/TMEM16A基因的序列分别为：ANO1/TMEM16A gene(GenBank NM_018043)：CGTGTACAAAGGCCAAGTA(1077-1095nt)，GCATCTATTTGACTTGTCT(991-1009nt)以及CGAAGAAGATGTACCACAT(837-855nt)；

为了检测所设计的三个shRNA对ANO1的抑制效率，首先将ANO1质粒转染进空白HEK293细胞(购自美国ATCC公司)中，待其表达后，再分别将shRNA1-3、阴性对照shRNA转染进HEK293-ANO1细胞中。两天后分别提取各组细胞蛋白通过western实验检测其ANO1表达情况。

实验结果见图4。由实验结果可见，相对于转染Negative controlshRNA组以及阳性对照组(HEK293-ANO1组)，3段靶向ANO1/TMEM16A的特异性shRNA(shRNA1-3)对表达于HEK293细胞中的ANO1/TMEM16A的抑制效应分别为：85％、87％和96％。由此证实3段ANO1 shRNA均有效且ANO1 shRNA3对ANO1/TMEM16A的抑制效率最高，可用于进一步实验。

接下来，本实验首先利用WST-8法进行细胞增殖实验，检测敲除人前列腺癌细胞PC-3中ANO1/TMEM16A对其体外增殖能力的影响：

本实验采用ANO1 shRNA3进行实验，分别将Negative control shRNA及ANO1 shRNA3体外转染人前列腺癌细胞PC-3。转染三天后，分别将两组细胞接种于96孔板中(5000个/孔)，设置6个平行复孔。然后在不同时间点(从第一天开始)加入WST-8(日本Dojindo公司)(它在电子载体1-Methoxy PMS存在的情况下能够被还原成水溶性的甲臜染料，继而用酶标仪测定在450nm处的吸光度，此数值即O.D.值可直接反映活细胞数量)溶液，每孔10ul。5％CO₂/37℃孵育5小时后，检测450nm处吸光度值。

实验结果见图5，根据实验结果可见，当将特异性靶向ANO1/TMEM16A的shRNA(shRNA3)体外转染人前列腺癌细胞PC-3时，发现敲除ANO1/TMEM16A后，PC-3细胞增殖能力减弱。由此表明ANO1/TMEM16A促进人前列腺癌细胞增殖。

本实验通过细胞划痕实验以及利用Tranwell迁移小室分别检测特异性敲除ANO1/TMEM16A后对人前列腺癌细胞PC-3的迁移及侵袭能力的影响。细胞划痕实验目的是检测特异性敲除ANO1/TMEM16A后对人前列腺癌细胞PC-3的迁移能力的影响。Negative control shRNA及ANO1shRNA分别体外转染人前列腺癌细胞PC-3三天后，将等数量细胞接种于6孔板中。待细胞长满后，用微量移液器头平行划痕、无血清培养基冲洗划痕边缘两次。分别于0h、12h、24h和36h低倍镜下观察划痕宽度。实验结果见图6。

由实验结果可知(图6)，相对于转染Negative control shRNA组，转染ANO1shRNA3后，PC-3细胞的迁移能力大大降低。即：ANO1/TMEM16A可促进癌细胞迁移。

细胞侵袭实验(利用Transwell小室)用于检测癌细胞侵袭能力。Negative control shRNA及ANO1shRNA3分别体外转染人前列腺癌细胞PC-3三天后，将培养基换成无血清培养基继续培养18小时。然后将1.5x10⁵个细胞接种于Transwell上室。上室含300ul无血清培养基，下室为含10％血清培养基。5％C0₂/37℃孵育24小时后，取出上室，用棉签轻轻擦拭掉上室内侧细胞，然后进行甲醇固定、DAPI染色，20X荧光显微镜下观察。实验结果表明(图7)，相对于转染Negative control shRNA组，转染ANO1shRNA3后，PC-3细胞的侵袭能力降低。由此可见ANO1/TMEM16A亦可促进癌细胞的侵袭。

由以上实验结果表明，ANO1/TMEM16A可体外促进人前列腺癌细胞PC-3的增殖、迁移及侵袭能力。

实验例3

首先在裸鼠(购自北京大学医学部实验动物中心)体内种PC-3细胞，使其成瘤。当瘤体生长到80-100mm³时，随机分为三组：1)空白对照组(不做任何处理)；2)阴性对照组(瘤体上注射Negative control shRNA)；3)实验组(瘤体上注射ANO1shRNA3)。注射量为50ug/次，每周一次，连续注射6周。每次注射前测量瘤体体积并记录。

实验结果见图8，由实验结果可见，瘤体注射ANO1shRNA3后，可减慢裸鼠肿瘤(前列腺癌细胞移植瘤)的生长。此结果证明ANO1/TMEM16A在前列腺癌的发展过程中起到了重要的作用。