钙激活氯通道ANO1/TMEM16A在肿瘤发生、发展和痛觉调制中的作用机制研究

摘要

一:研究表明,细胞膜表面离子通道异常表达以及胞内 Ca2+内稳态失衡可影响细胞迁移和凋亡。钙激活氯通道广泛表达于上皮细胞并参与细胞分泌以及容量性调节,从而维持细胞在迁移、分化以及凋亡等生理过程中的离子平衡。近期发现的钙激活氯通道 ANO1/TMEM16A定位于人染色体11q13区域,已有报道表明ANO1基因定位于人类染色体11q13被称为“Amplicon core”的区域,此区域很多基因在上皮类癌症如乳腺癌、肺癌和口腔上皮癌中高表达且在癌症发生发展过程中均发挥重要作用,因此提示 ANO1在上皮类肿瘤的发生发展中发挥调节作用。本研究探讨了钙激活氯通道ANO1在前列腺癌发生和发展过程中的作用。
　　本研究首先证实,相对于人正常前列腺上皮细胞系RWPE-1,ANO1mRNA及蛋白水平在人前列腺癌细胞系LNCaP和PC-3中表达明显增高;全细胞膜片钳实验结果证实在此两种前列腺癌细胞系中,ANO1通道电流明显增大。免疫组化实验证实 ANO1在人前列腺癌组织中高表达而在前列腺增生和癌旁组织中低表达或无表达,并且随着TNM临床分期及Gleason评分的增高ANO1表达增加。通过设计三段针对ANO1 N端的shRNA,应用CCK8、克隆形成、划痕以及Transwell小室等实验手段进一步证实, ANO1沉默可以明显抑制PC-3前列腺癌细胞系的增值、迁移以及侵袭等能力。此外,裸鼠体内成瘤实验证实将 PC-3细胞系诱导的裸鼠瘤体内ANO1沉默后可明显抑制肿瘤的生长。本学位论文的第一部分得出如下结论:
　　1.钙激活氯通道ANO1mRNA和蛋白水平在人前列腺癌细胞系LNCaP和PC-3中表达明显高于人正常前列腺上皮细胞系RWPE-1;
　　2.钙激活氯通道 ANO1在人前列腺癌组织中高表达,而在前列腺增生和前列腺癌癌旁组织中无表达或低表达,并且随着前列腺癌增加而 ANO1表达水平上升;
　　3.抑制钙激活氯通道ANO1的表达可抑制PC-3前列腺癌细胞系体外增值、迁移、侵袭效率以及裸鼠体内肿瘤生长能力;
　　4.膜蛋白 ANO1也许可作为前列腺癌治疗和治疗过程中恢复的潜在靶点和生物标志物。
　　摘要二:钙激活氯通道ANO1/TMEM16A广泛表达于小DRG神经元中,而小DRG神经元主要参与伤害性感受调节,提示ANO1在痛觉传导过程中的作用。为探究钙激活氯通道ANO1在伤害性感受调节中的作用,本研究首先记录了ANO1对于小DRG神经元兴奋性的影响,过表达ANO1可使小DRG神经元细胞去极化并且增加其兴奋性。应用real-time PCR和western手段证实,在CFA诱导的大鼠足底炎症痛模型中ANO1的mRNA和蛋白表达水平降低,并且随着炎症痛的缓解而表达回升至正常水平。此外,大鼠鞘内注射ANO1-shRNA敲低DRG神经元细胞中的ANO1后可明显降低大鼠足底热敏痛阈值,白介素4(IL-4)在CFA诱导的大鼠足底炎症痛模型中的表达情况呈现出与ANO1相似的趋势。在原代培养的小DRG神经元细胞中用IL-4刺激可使ANO1的mRNA表达水平呈剂量依赖性增加,且大鼠鞘内注射IL4-shRNA后可使DRG神经元细胞中的ANO1mRNA表达降低。在IL-4敲除小鼠的DRG神经元细胞中ANO1的mRNA和蛋白表达水平也明显低于正常小鼠,在人支气管上皮细胞HBSMC中IL-4通过经典的STAT6通路调节ANO1的表达。本研究证实了钙激活氯通道ANO1受抗炎因子IL-4调节而在慢性炎症痛过程中起到镇痛作用,推测此过程构成了神经-免疫系统调节的反馈性保护机制。
　　本学位论文的第二部分得出如下结论:
　　1.过表达钙激活氯通道ANO1可增加小DRG神经元兴奋性;
　　2.在CFA诱导的大鼠足底炎症痛模型中钙激活氯通道ANO1的mRNA和蛋白表达水平降低,且随着炎症痛的缓解而恢复至正常水平;
　　3.大鼠鞘内注射ANO1-shRNA后可使其足底热敏痛阈值降低;
　　4. IL-4通过经典的STAT6通路调节ANO1的表达。

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缩略语表

第一部分：沉默钙激活氯通道 ANO1/TMEM16A可抑制前列腺癌肿瘤的生长和侵袭

中文摘要

英文摘要

2. 引言

3. 实验材料和方法

3.1 质粒提取

3.2 细胞培养与质粒转染

3.3 Real-Time PCR实验

3.4 Western blot实验

3.5 电生理学记录

3.6 免疫组织化学实验

3.7 体外水平实验

3.8 体内水平实验

3.9 统计学处理

4. 实验结果

4.1 ANO1在人正常组织中的表达谱

4.2 ANO1在人前列腺癌细胞及组织中高表达

4.3 沉默 ANO1可抑制 PC-3前列腺癌细胞系增值、迁移及侵袭效

4.4 沉默 ANO1可抑制裸鼠体内瘤体生长

5. 讨论

6. 结论

参考文献

第二部分：钙激活氯通道 ANO1在 CFA诱导的大鼠足底炎症痛模型中表达降低及其镇痛作用

中文摘要

英文摘要

2. 引言

3. 实验材料和方法

3.1 重组质粒的构建

3.2 细胞培养与质粒转染

3.3 Real-Time PCR实验

3.4 Western blot实验

3.5 电生理学记录

3.6 行为学实验

3.7 统计学处理

4. 实验结果

4.1 过表达 ANO1可增加大鼠小 DRG神经元兴奋性

4.2 敲低 CaCC ANO1可降低大鼠基础痛阈

4.3 大鼠足底炎症痛模型中 ANO1表达降低

4.4 IL-4通过经典的 STAT6通路调节 ANO1的表达

5. 讨论

6. 结论

参考文献

综述